總結

單分子實驗方法提供空間與時間高解析度的工具可觀察到單一分子的精確 的構形與構形變化的動力學行為，不同於整體實驗(ensemble experiment)容易受 到分子構形異質化(heterogeneous)產生不同訊號，造成實驗結果被平均化以及高

度訊號卻因為改用PCD 和 POC 系統產生了訊號漂移的現象，由圓二色光譜與此

須由其他的實驗方法進行確認。此外，T4_HT21 在錄製時間內穩定不變的螢光共

圖

Figure 1 線性染色體末端的複製缺陷³⁰。

DNA 在進行複製的過程中，在延滯股需要 RNA 引子引導 DNA 聚合酶至 DNA 模板上進行 不連續複製，在複製的最後將DNA 模板 5’端上的 RNA 引子移除，導致複製 DNA 的長度比 DNA 模板短。

Figure 2 哺乳類端粒結構以及與端粒結合的蛋白質複合物²。

端粒重複序列由10-15 千鹼基對的雙股與 150-200 核苷酸的單股所組成的。負責保護染色體末 端避免發生降解、融合等形成不穩定的染色體影響DNA 複製準確性以及細胞的存亡。

Figure 3 端粒序列中所形成的 T-loop 結構²。

多種蛋白質複合物與端粒結合可以穩定T-loop 結構將 3’端上羥基藏匿在 T-loop 結構中避免端 粒酶結合而進行延長端粒序列。

Figure 4 端粒結合蛋白質複合物。

負責保護端粒末端避免被降解或融合以維持端粒完整性以及調控端粒的長度。其中端粒調控 因子1 與端粒調控因子 2 與端粒的雙股部分結合，端粒保護因子則與端粒單股部分結合。

Figure 5 端粒酶延長端粒的機制。

端粒酶包含一段可合成端粒序列的RNA 反轉錄酶，藉由此反轉錄酶可在癌細胞中增加端粒長 度導致癌細胞不會凋亡進而使癌症疾病病發。

Figure 6 同源重組機制。

利用具有相同序列之不同染色體上的互補序列進行 DNA 複製的行為常發生在修復損壞的 DNA。在癌細胞中可以延長端粒長度，在延長的過程不牽涉端粒酶，為少部分癌症病發的原 因。

Figure 7 端粒酶在不同的細胞有著不同的活性導致端粒延長或縮短的現象。

在體細胞中，端粒酶的活性受到嚴謹的調控，導致在正常體細胞中端粒長度隨細胞次數增加而 減少。在腫瘤細胞中，由於端粒酶過表達端粒可無限制增生，導致腫瘤細胞不會進入凋亡程序 而永生。若在腫瘤細胞的端粒序列利用端粒本身富含鳥嘌呤的特性可形成DNA 二級結構，G-quadruplex，則有機會可以抑制端粒酶與腫瘤細胞的端粒結合達到抑制癌症的效果。

Figure 8 85~90%癌細胞中過表達的端粒酶活性的治療策略⁵。

第一類為抑制端粒結合蛋白複合物的活性，可以使癌細胞中端粒結構失去保護，隨細胞分裂次 數增加而自行啟動細胞凋亡程序。第二類為抑制端粒酶活性，除了直接一端粒酶活性外，還可 以針對端粒酶的前驅物進行抑制使生成的端粒酶失去延長端粒的功能達到抑制癌症的效果。

Figure 9 鳥嘌呤四股結構的組成以及不同金屬陽離子在結構中進行穩定形成不同的構形。

(a)四個鳥嘌呤藉由 Hoogsteen 氫鍵形成環形平面(G-quartet)，再由兩個以上的 G-quartet 推疊 形成鳥嘌呤四股結構(b)人類端粒基因序列受到鈉離子或鉀離子穩定形成的不同構形的鳥嘌呤 四聚體，在鈉離子條件下形成反平行的構形，鉀離子條件下則形成混和形構形。

Figure 10 鳥嘌呤四股結構的分類。

(1)依據形成結構所需寡核苷酸股的數目可分成單體、雙體以及四聚體(2)結構中寡核苷酸股的 方向可分為平行、反平行以及混和型構形。

Figure 11 不同鳥嘌呤四股結構構形中有著不同種類的 loop 以及不同數量的鳥嘌呤異構物。

以混和型2 號鳥嘌呤結構為例，(a)串聯 G-quartet 的 Loop 種類有對角型、螺旋槳型和階梯型 (b) 不同構形的鳥嘌呤四股結構中有的不同數量的鳥嘌呤異構物(Syn 和 Anti)。

Figure 12 螢光染料分子對的激發與放射光譜。J(λ)為供體放射與受體激發光譜重疊部分²¹。 單分子螢光共振能量轉移的螢光染料分子對中Cy3 的放射波長與 Cy5 的激發波長在光譜必須 有部分重疊，重疊面積為J(λ)。

Figure 13 螢光共振能量轉移的放光和分子氧造成螢光基團毀損的機制²¹。 單分子螢光實驗所使用的有機螢光基團研究生化系統中常伴隨閃爍或光漂白現象發生，可藉 由添加三重態淬滅劑抑制閃爍以及搭配酵素型除氧系統，將系統中氧移除避免造成螢光基團 毀損而不放光的光漂白現象。

Figure 14 螢光共振能量轉移效率與染料分子之間距離變化的曲線圖。

Figure 15 實驗數據分析與處理。

(a)由 EMCCD 以每幀 30 毫秒的速度拍攝的影像傳送至電腦，分別有 30 幀和 4000 幀。將影像經 由IDL 程序進行儀器校正與疊圖分析，得到個別分子的位置與螢光強度訊號。(c)再用 MATLAB 程式進行螢光訊號強度比較並修正實驗誤差。(b)多個分子的 30 幀影像繪製的螢光共振能量轉移 效率直方圖，利用螢光共振能量轉移效率不同可計算螢光染料分子對的距離，用以判斷分子是否 有構形上的變化。(c)單一分子錄製兩分鐘的影像，可觀察到分子的構型變化動力學行為，並可進 一步分析得到動力學資訊。

Figure 16 不同的核苷酸修飾方式並與螢光染料分子供體 Cyanine3(Cy3)的鍵結³¹。

Figure 17 石英玻片與蓋玻片組裝樣品槽之步驟(a)黏上切割好的雙面膠帶(b)放上蓋玻片(c)以 環氧樹脂將縫隙填。

Figure 18 石英玻片經 mPEG-SVA 和 biotin-PEG 修飾與固定 DNA 樣品於玻片表面示意圖。

Figure 19 PTIR(Prism-type Total Internal Reflection )稜鏡式全內反射顯微術示意圖。

Figure 20 實驗光學零件架設示意圖。

(a)532nm 綠光激發雷射光源(LASOS DPSSL serise)和 640nm 紅光激發雷射光源(Omicron LuxX 638-40)，PBS:讓特定一波長光穿透與另一波長光反射。 (b)PTIR(Prism-type Total Internal Reflection )稜鏡式全內反射(C)Home-dual view 雙視光學零件組。

Figure 21 不同的酵素型除氧系統其 pH 隨時間的變化²⁰。

Figure 22 酵素型除氧系統的反應機制(a)GOC(b)PCD(c)POC 系統²⁰。

Figure 23 螢光共振能量轉移效率直方圖。

HT21 序列在 GOC 除氧系統中分別為不同濃度的鉀離子與鎂離子條件下所得到的實驗數據。

Figure 24 螢光共振能量轉移效率直方圖。

HT21 序列在 PCD 除氧系統中分別為不同濃度的鉀離子與鎂離子條件下所得到的實驗數據。

Figure 25 文獻中人類端粒序列的螢光共振能量轉移直方圖與其對應之構形以及圓二色光譜²⁹。

Figure 26 圓二色光譜圖。

HT21 的濃度為 5µM 分別在沒有添加鹽、100mM 鈉離子、150mM 鉀離子和 5mM 鎂離子條件 下進行偵測。鉀離子條件所得的鳥嘌呤四股結構為混和型，鈉離子條件下則測得反平行構形。

Figure 27 螢光共振能量轉移效率直方圖。

A_HT21 序列在 PCD 除氧系統中分別為不同濃度的鉀離子與鎂離子條件下所得到的實驗數 據。

Figure 28 螢光共振能量轉移效率直方圖。

N_HT21 序列在 PCD 除氧系統中分別為不同濃度的鉀離子與鎂離子條件下所得到的實驗數據。

Figure 29 T20 分子在 PCD 除氧系統下隨鎂離子濃度增加產生訊號漂移的現象。

Figure 30 HT21 分子在 PCD 除氧系統鉀離子濃度 50 mM 條件下錄製 120 秒的螢光共振能量 轉移效率-時間軌跡圖中螢光共振能量轉移效率穩定在特定狀態軌跡圖。

Figure 31 HT21 對不同鉀離子濃度條件下在觀察時間內螢光共振能量轉移效率未有明顯變化 的分子。

Figure 32 A_HT21 對不同鉀離子濃度條件下在觀察時間內螢光共振能量轉移效率未有明顯變 化的分子。

Figure 33 N_ HT21 對不同鉀離子濃度條件下在觀察時間內螢光共振能量轉移效率未有明顯變 化的分子。

Figure 34 將錄製的時間軌跡圖分類為(a)Dynamic 和(b)Static 在繪製成 FRET 直方圖

Figure 35 螢光共振能量轉移效率直方圖，T4_HT21 序列在 PCD 除氧系統中分別為不同濃度 的鉀離子與鎂離子條件下所得到的實驗數據。

Figure 36 比較 HT21 和 T4_HT21 不同訊號下的面積比例。

計算在PCD 系統鉀離子濃度 50 mM 條件下 HT21 的 F1和F2與T4_HT21 的 F1、F21和F22經 高斯曲線擬合後，再計算HT21 的 F1和F2與T4_HT21 的 F1、F21加上F22曲面下面積所佔的 比例。

Figure 37 T4_ HT21 對不同鉀離子濃度條件下在觀察時間內螢光共振能量轉移效率未有明顯 變化的分子。

Figure 38T4_HT21 分子的時間軌跡圖中快速轉變的訊號以及經互相關函數分析的結果。

已註解 [IL1]: 請把 50mM 的換成深一點的顏色

表格

Table 1 實驗所使用的藥品、儲存濃度以及最終濃度。

Table 2 寡核苷酸進行黏合反應所使用的流程。

Table 3 圓二色光譜之鳥嘌呤四股結構的特徵訊號位置。

Table 4 實驗所使用的單股寡核苷酸序列。

Table 5 HT21 不同鉀離子濃度條件長時間軌跡圖中狀態之間轉變的次數與動力學反應速率。

Table 6 A_HT21 不同鉀離子濃度條件長時間軌跡圖中狀態之間轉變的次數與動力學反應速 率。

Table 7 N_HT21 不同鉀離子濃度條件長時間軌跡圖中狀態之間轉變的次數與動力學反應速 率。

Table 8 HT21 分子在不同鉀離子濃度下，實驗所觀察到的分子構形有改變與構形無改變穩定 存在特定狀態的比例分布。

Table 9 A_ HT21 分子在不同鉀離子濃度下，實驗所觀察到的分子構形有改變與構形無改變穩 定存在特定狀態的比例分布。

Table 10 N_ HT21 分子在不同鉀離子濃度下，實驗所觀察到的分子構形有改變與構形無改變 穩定存在特定狀態的比例分布。

參考文獻

1. Blackburn, E. H. Telomeres and telomerase: the means to the end (Nobel lecture). Angew Chem Int Ed Engl 49, 7405–7421 (2010).

2. Blasco, M. Telomeres and human disease: ageing, cancer and beyond.

Nat. Rev. Genet. 6, 611–22 (2005).

3. Palm, W. & de Lange, T. How shelterin protects mammalian telomeres.

Annu. Rev. Genet. 42, 301–34 (2008).

4. Shay, J. W. & Bacchetti, S. A survey of telomerase activity in human cancer. Eur. J. Cancer 33, 787–791 (1997).

5. Sekaran, V., Soares, J. & Jarstfer, M. B. Telomere maintenance as a target for drug discovery. J Med Chem 57, 521–538 (2014).

6. Bochman, M. L., Paeschke, K. & Zakian, V. A. DNA secondary structures: stability and function of G-quadruplex structures. Nat. Rev. Genet. 13, 770–80 (2012).

7. Gellert, M., Lipsett, M. N. & Davies, D. R. Helix Formation By Guanylic Acid. Proc. Natl. Acad. Sci. 48, 2013–2018 (1962).

8. Williamson, J. R., Raghuraman, M. K. & Cech, T. R. Monovalent cation-induced structure of telomeric DNA: The G-quartet model. Cell 59, 871–

880 (1989).

9. Capra, J. A., Paeschke, K., Singh, M. & Zakian, V. A. G-quadruplex DNA sequences are evolutionarily conserved and associated with distinct genomic features in Saccharomyces cerevisiae. PLoS Comput. Biol. 6, 9 (2010).

10. Huppert, J. L. & Balasubramanian, S. G-quadruplexes in promoters throughout the human genome. Nucleic Acids Res. 35, 406–413 (2007).

11. Bidzinska, J., Cimino-Reale, G., Zaffaroni, N. & Folini, M.

G-quadruplex structures in the human genome as novel therapeutic targets.

Molecules 18, 12368–12395 (2013).

12. Biffi, G., Tannahill, D., McCafferty, J. & Balasubramanian, S.

Quantitative visualization of DNA G-quadruplex structures in human cells. Nat.

Chem. 5, 182–6 (2013).

13. Schaffitzel, C. et al. In vitro generated antibodies specific for telomeric guanine-quadruplex DNA react with Stylonychia lemnae macronuclei. Proc.

Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98, 8572–7 (2001).

14. Małgowska, M., Gudanis, D., Teubert, A., Dominiak, G. & Gdaniec, Z.

14. Małgowska, M., Gudanis, D., Teubert, A., Dominiak, G. & Gdaniec, Z.