2. 實驗
2.3 實驗步驟
2.3 實驗步驟
2.3.1 奈米鑽石製備
購自奇異公司 (G.E) 以高溫高壓法製作的鑽石，其表面包覆許多 複雜的官能基與石墨，所以需要做些前處理步驟，才能夠修飾聚精胺 酸於其上。
去石墨化
:
1. 取約 1000 mg 大小為 100 nm 的奈米鑽石放入玻璃培養皿上，
加入些許酒精，使鑽石溶液均勻散布在培養皿上。
2. 利用加熱板加熱培養皿使酒精蒸發其溫度略高於室溫，待鑽石 完全乾燥後，放入烘箱以 450 ℃烘烤 2 小時後回收。
表面酸洗
:
1. 帶降溫後，收集去石墨化後的奈米鑽石粉末轉放入圓底燒瓶中，
再加入適量濃硝酸及濃硫酸 (v/v = 1/3)，總量以能覆蓋過奈米 鑽石粉末即可。
2. 將圓底燒瓶放入微波反應器 (CEM, NC, USA) 中進行酸洗反 應，設定 100 瓦、100 ℃反應一小時，重複三個循環，待反應 物冷卻至室溫。
3. 加入大量去離子水，靜置一天，待鑽石粉末沉澱後，移除上清 液將，再加入去離子水清洗，並以 15,000 rpm （KUBOTA, Tokyo, Japan）離心 10 分鐘，移除上清液。
4. 重複步驟 3 數次，直至水溶液為中性為止，再以酒精清洗並以 15,000 rpm （KUBOTA, Tokyo, Japan）離心 10 分鐘，移除上 清液。
5. 將鑽石加熱除去剩餘酒精，戴鑽石粉末完全乾燥後，用去離子 水將鑽石配成 20 mg/ml 水溶液備用。
Figure 2-1.The surface functionalization of nanodiamond before and after acid wash
treatment.
2.3.2 聚精胺酸的修飾
1. 取前處理過的鑽石 50 μL (20 mg/mL)，離心 (15000 rpm, 3 分鐘) 去除上清液後，加入 30 μL EDC (20 mg/mL)、30 μL NHS (20 mg/mL)，940 μL MES buffer (0.1 M，pH 6)，配置成 1 mg/mL 的濃度。
2. 超音波震盪 2 分鐘，放在攪拌器上搖晃反應 15 分鐘，此步驟 為完成羧基奈米鑽石活化。
3. 離心(10,000 rpm, 1 分鐘)，移除未反應的 EDC、NHS，再加入 1 mL PBS (pH 7.4) 清洗。
4. 重覆步驟 3 兩次，加入 200 μL 聚精胺酸溶液 (5 mg/ml)，以 PBS buffer 調整至 1 mL，超音波震盪直至鑽石粉末均勻分布於溶液 中，放在攪拌器上搖晃反應 2 小時，完成聚精胺酸-羧基奈米 鑽石探針的合成反應。
5. 離心(15,000 rpm, 5 分鐘)，移除未反應的聚精胺酸溶液，再以 1 mL 去離子水清洗兩次。
6. 把合成好之聚精胺酸-羧基奈米鑽石探針以去離子水配製成 1 mg/mL 備用。
Figure 2-2. Fabrication of polyarginine-coated nanodiamonds.
2.3.3 利用傳統加熱方法做醣的消化及切醣
Methanolic HCl (3N)脫去 GAG polymer chain 上的硫酸根並將 GAG polymer chain 切成雙醣。
1. 將硫酸軟骨素多醣以去離子水配置成 20 mg/L，取 25 µL 加到 1 mL 的玻璃瓶中以氮氣吹乾。
2. 加入 200 µL Methanolic HCl (3N)，超音波震盪 10s。
3. 將玻璃瓶放入恆溫槽中，溫度設為 65 °C，加熱 75 分鐘。
4. 加熱結束後，以氮氣吹乾溶劑。
5. 加入 10 mL 去離子水將樣品充分混和均勻。
6. 取 1 µL 樣品滴在樣品盤上，再混和 1 µL 基質溶液，接著真空 抽乾樣品後利用 MALDI 進行分析。
2.3.4 聚精胺酸奈米鑽石對硫酸軟骨素多醣有效吸附量的 估計
為了知道聚精胺酸修飾過後的奈米鑽石，能夠吸附多少硫酸軟骨
素多醣
，本篇使用了過量的硫酸軟骨素多醣，逐次的用奈米鑽石飽和 吸附後，以奈米鑽石吸附的次數，簡單的估計修飾後的奈米鑽石對雙 醣之有效吸附量。1. 配置 40 mg/L
硫酸軟骨素多醣 25 μL 。
2. 加入 20 μg 聚精胺酸修飾的奈米鑽石。3. 超音波震盪 15 分鐘。
4. 以轉速 15000 rpm 離心 10 分鐘。
5. 使用微量滴管小心抽取上清液，避免吸取到奈米鑽石，將上清 液抽取至另一管 1.5 mL eppendorf 微量離心管中。
6. 重複 2 到 5 步驟 3~4 次，共收集 4~5 個移去上清液且含有奈米 鑽石沉澱物之微量離心管，接著放入幫浦將剩餘水分抽乾。
7. 各加入 200 µL Methanolic HCl (3N)，超音波震盪 10 s。
8. 將溶液從微量離心管轉移至微波加熱管中。
9. 加熱結束後，以氮氣吹乾溶劑。
10. 加入 40 mL 去離子水將樣品充分混和均勻，在將溶液轉移至微 量離心管中，離心取上清液。
11. 將上清液濃縮至 10 μL。
12. 個別取 1 μL 與 10-3 M NEDC 基質溶液 1 μL 混合後，滴在
MALDI 樣品盤上，之後真空抽乾，並利用 MALDI 進行分析。