利用奈米鑽石濃縮萃取技術結合基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀定量分析葡萄糖胺聚醣之寡糖衍生物

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(1)國立台灣師範大學化學系碩士論文. Department (Graduate Institute) of Chemistry National Taiwan Normal University. 利用奈米鑽石濃縮萃取技術結合基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀定量分析葡萄糖胺聚醣之寡糖衍生物. Quantitative Analysis of Oligosaccharides Derived from Sulfated Glycosaminoglycans by Affinity Purification and MALDI Mass Spectrometry. 謝芝茜 Chih-Chien Hsieh 學號 : 69420663. 指導教授 : 張煥正, 林震煌教授中華民國 101 年 6 月 June, 2012.

(2) Key words : GAG, MPS, MALDI-TOF MS,. Abstract. nanodiamond, methanolysis.. Degraded fragments of sulfated glycosaminoglycans (GAGs) are key reporters for profiling the burden of mucopolysaccharidosis (MPS) disease at baseline and during therapy. Here, we present a high-throughput assay, which combines microwave-assisted GAGs degradation, polyarginine affinity purification, and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI MS), for quantitative analysis of sulfated oligosaccharides in biological samples. First, sulfated oligosaccharides were selectively isolated from highly diluted solutions, spiked urine and spiked artificial Cerebrospinal Fluid (aCSF) using polyarginine-coated nanodiamonds (PA-coated NDs) as a solid phase extraction. support.. Second,. they. were. degraded. through. microwave-assisted methanolysis, which significantly reduced the reaction time from hours to minutes. To achieve quantitative analysis, the GAG such as chondroitin sulfate (CS) was mixed with an internal standard derived from its deuterated methanolysate and then analyzed by MALDI MS using N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride (NEDC) as the matrix. The calibration curve of this MS-based analysis showed a linear range from 50 ng to 2.5 ng with a correlation coefficient of 0.999. The new assay is rapid (less than 30 min) and sensitive (with a detection limit of 75 pg), and is potentially useful for clinical diagnosis of MPS.. 1.

(3) 摘要. 關鍵字 : 葡萄糖胺聚醣、黏多醣症、基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀、奈米鑽石。. 分析的葡萄糖胺聚醣 (glycosaminoglycans，GAGs)是做為診斷黏多醣症 (mucopolysaccharidosis disease，MPS)及判斷治療效果的重要依據。本篇利用微波加熱輔助進行 GAGs 降解，搭配聚精胺酸奈米鑽石探針進行純化再結合基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜儀 (MALDI-TOF MS)達到可高通量、定性、定量分析小體積生物樣品中的硫酸化 GAGs。利用微波加熱進行 GAGs 甲基化(Methanolysis)降解, 例如硫酸軟骨素多醣 (chondroitin sulfate, CS)甲基化降解，能有效的將反應時間由 75 分鐘縮短到 7 分鐘。而利用本實驗室之前所發展出覆蓋著聚精胺酸的奈米鑽石探針，可藉由聚精氨酸與硫酸化多醣之間的高專一性結合特性，使其能夠在高稀釋溶液、尿液中專一性的萃取出 CS，達到快速純化進入 MALDI MS 分析。我們藉由配置同位素甲基化試劑來降解 CS 做為內標準品，成功的克服了 MALDI 因雷射功率及非勻相結晶所導致訊號的低再現性，定量曲線的線性範圍從 50-2.5 ng，並且具有好的線性(R2 = 0.999)。本篇所使用的基質 NEDC 其基質訊號干擾小，適合用來分析降解後 CS，且高耐鹽，因此分析在複雜且含有高鹽類環境中(ex.尿液、腦脊髓液)之 CS，可不需經由去鹽的步驟就可直接進入 MALDI 進行分析。綜合以上，我們成功的發展出快速(30 分鐘內)且靈敏(LOD =75 pg)用來偵測複雜環境中 GAGs 的方法，可有效的運用在診斷 MPS 及監控治療效果上。 2.

(4) 目錄 Abstract .................................................................................................................................................... 1 摘要 .......................................................................................................................................................... 2 目錄 .......................................................................................................................................................... 3 表目錄 ...................................................................................................................................................... 4 圖目錄 ...................................................................................................................................................... 4 1.. 緒論 ................................................................................................................................................ 7. 1.1. 生物分子的中的磺酸化作用 ............................................................................................... 7. 1.2. 葡萄醣胺聚醣 ....................................................................................................................... 8. 1.3. 黏多醣症 (Mucopolysaccharidoses，MPS) ...................................................................... 11. 1.4. 葡萄糖胺聚醣的分析鑑定方法 ......................................................................................... 14 1.4.1. 電泳法 .............................................................................................................. 14. 1.4.2. HPLC (High-performance liquid chromatography) ......................................... 16. 1.4.3. 黏多醣症的鑑定分析方法 .............................................................................. 17. 1.4.4. MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser desorption ionization Time-of-flight. Mass spectrometry)................................................................................................................. 18 1.5. 胍基團與磺酸基團之間的非共價鍵結 ............................................................................. 19. 1.6. 奈米鑽石做為固相萃取（solid-phase extraction）的材料 .............................................. 23. 2.. 實驗 .............................................................................................................................................. 25. 2.1. 藥品與材料 ......................................................................................................................... 25. 2.2. 儀器設備 ............................................................................................................................. 26. 2.3. 實驗步驟 ............................................................................................................................. 28. 3.. 2.3.1. 奈米鑽石製備 .................................................................................................. 28. 2.3.2. 聚精胺酸的修飾 .............................................................................................. 30. 2.3.3. 利用傳統加熱方法做醣的消化及切醣 .......................................................... 31. 2.3.4. 聚精胺酸奈米鑽石對硫酸軟骨素多醣有效吸附量的估計 .......................... 32. 結果與討論 .................................................................................................................................. 34 3.1.. 利用甲醇降解 (Methanolysis)將硫酸軟骨素多醣降解成雙醣 .............................. 34. 3.2.. 一般 MALDI 基質於降解後硫酸軟骨素多醣之雙醣的分析 ................................. 35 3.

(5) 3.3.. 基質 NEDC 於硫酸軟骨素雙醣的分析 ................................................................... 37. 3.4.. 利用傳統加熱方法對硫酸軟骨素多醣的消化及降解之質譜分析 ........................ 40. 3.5.. 利用微波加熱方法對硫酸軟骨素多醣的消化及降解之 MALDI 偵測極限 ......... 41. 3.6.. 人體尿液中硫酸軟骨素多醣之分析 ........................................................................ 43 3.6.1.. 奈米鑽石的粒徑分佈 (size distribution) 與表面電位 (zeta potential) 的量. 測. 44. 3.6.2.. 聚精胺酸奈米鑽石探針萃取濃縮硫酸軟骨素多醣有效吸附量的估計 ....... 45. 3.6.3.. 人體尿液中硫酸軟骨素多醣之分析 .............................................................. 49. 4.. 結論 .............................................................................................................................................. 52. 5.. 參考資料 ...................................................................................................................................... 54. 表目錄 Table 1-1. Characteristics of GAGs.3 ..................................................................................................... 10 Table 1-2. Mucopolysaccharidosis classification. 8 ..................................................................... 13 Table 1-3. Reported and calculated values for acid dissociation constants (pKa) of methyl acids with various acid functional units.22 ............................................................................................................... 22 Table 1-4. Stoichiometries of binding (n), association constants (Kb), and enthalpies of association (△ H) of ANS- to poly(amino acids) at 25 °C and pH 2.0a.22 ...................................................................... 22 Table 3-1. Estimated adsorption capacity of CS by PA-coated NDs. ..................................................... 49. 圖目錄 Figure 1-1. Structure and biology of glycosaminoglycans.2 ................................................................... 10 Figure 1-2. The structures of heparan, keratan and dermatan sulfates as they are degraded by the indicated enzymes. 3 .............................................................................................................. 13 Figure 1-3. The structure of guanidium-sulfate complex. ...................................................................... 20 4.

(6) Figure 1-4. Specificity of HSGAG binding to proteins.2 ........................................................................ 21 Figure 1-5 Cluster structure of detonation diamond and surface functional groups. 25 ........................... 24 Figure 2-1.The surface functionalization of nanodiamond before and after acid wash treatment. ......... 29 Figure 2-2. Fabrication of polyarginine-coated nanodiamonds. ............................................................. 31 Figure 3-1. Degradation of chondroitin sulfate by methanolysis.27 ........................................................ 35 Figure 3-2. Comparison of the MALDI-TOF mass spectra of methanolysis product of CS (5 µg) obtained by conventional hot bath for 75 min at 65 °C using two different matrices: (a, b) 2,5dihydroxybenoic acid and (c, d) 3-aminoquinoline. The spectra shown in (a – c) and (b – d) were acquired in the positive and negative ion modes, respectively. The asterisks denote the peaks associated with degraded products of chondroitin-4-sulfate. ................................................................................... 37 Figure 3-3. Negative ion MALDI-TOF mass spectrum of NEDC (0.1 M, 1 μL).29 ............................... 38 Figure 3-4. Negative ion MALDI-TOF mass spectra of methanolysis products of CS (5 µg) obtained by conventional hot bath for 75 min at 65 °C using (a) NEDC, (b) 3-AQ and (c) DHB as matrix. ............ 39 Figure 3-5. Negative ion MALDI-TOF mass spectra of different amounts of methanolysis product of CS obtained by conventional hot bath for 75 min at 65 °C . The concentrations of methanolysate are (a) 5 µg, (b) 50 ng and (c) 25 ng, respectively. ............................................................................................ 39 Figure 3-6. Production of CS, DS and HS dimers from standards with methanolysis time. 7 ................. 40 Figure 3-7. Negative ion MALDI-TOF mass spectra of methanolysis product of CS (25ng) obtained by (a) conventional hot bath for 75 min at 65 °C , and (b) microwave irradiation for 7 min at 65 °C. ....... 41 Figure 3-8. Negative ion MALDI-TOF mass spectra of different amounts of methanolysis product of CS obtained by microwave irradiation for 7 min at 65 °C. The methanolysate are (a) 25 ng, (b) 12.5 ng, (c) 5 ng and (d) 2.5 ng, respectively. ...................................................................................................... 42 Figure 3-9. Negative ion MALDI-TOF mass spectra of methanolysis product of CS (1.25 ng) obtained by microwave irradiation for 7 min at 65 °C. Inset: Enlarged view of the peaks at around m/z 460. .... 43 Figure 3-10. The number distributions of acid-treated NDs and PA-coated NDs................................... 45 Figure 3-11. The zeta potentials (mV) of acid-treated NDs and PA-coated NDs. .................................. 45 5.

(7) Figure 3-12. Negative ion MALDI-TOF mass spectra of methanolysis products of CS, obtained with enrichment using 20 µg of PA-coated NDs and followed by micro-wave assisted methanolysis.. The. concentrations of CS are (a) 5 mg/L, (b) 10 mg/L,(c) 20 mg/L and (d) 30 mg/L, respectively. One-tenth of the methanlysate was used for direct MALDI MS analysis. ............................................. 47 Figure 3-13. Equential extractions of CS using 20 µg of PA-coated ND s for subsequent characterization by microwave-assisted methanolysis and MALDI TOF MS. CS are (a) 5 mg/L, (b) 10 mg/L,(c) 20 mg/L and (d) 30 mg/L, respectively. methanlysate was used for direct MALDI MS analysis.. The concentrations of One-tenth of the. The relative intensities of sulfated. disaccharides in the spectra were analyzed by three trials, with the peak area averaged. ...................... 48 Figure 3-14. Negative ion MALDI-TOF mass spectra of methanolysis products of CS, obtained with enrichment using 20 µg of PA-coated NDs and followed by micro-wave assisted methanolysis.. The. concentrations of CS spiked in the urine are (a) 5 mg/L, (b) 10 mg/L,(c) 20 mg/L and (d) 30 mg/L, respectively.. One-tenth of the methanlysate was used for direct MALDI MS analysis. ..................... 50. Figure 3-15. Negative ion MALDI-TOF mass spectra of methanolysis products of CS, obtained with enrichment using 20 µg of PA-coated NDs and followed by micro-wave assisted methanolysis.. The. concentrations of CS spiked in 250µL urine are (a) pure urine and (b) 20 mg/L. One-tenth of the methanlysate was used for direct MALDI MS analysis. ........................................................................ 51. 6.

(8) 1. 緒論 1.1 生物分子的中的磺酸化作用磺酸化反應不但是蛋白質結構上常見的一種後轉移修飾 (post-tanslational miodification)，同時也在生物代謝路徑中扮演一個重要的角色。經由磺基轉移酶的催化，磺酸根 (SO3-) 可以由 3’-phosphoadenosine 5’-phosphosulfate (PAPS)傳遞到胜肽、蛋白質或是醣類上面。磺酸化可增加生物分子的水溶性，使原本疏水的物質變成兩性物質；也有可能造成結構的改變。同時因為磺酸的 pKa 接近 1.5，讓磺酸化生物分子機乎不論在何種溶液條件下，皆可保持在離子狀態。在各種後轉移修飾中，磺酸化普遍發生於所有的有機系統中。磺酸化在一般生長和發育及維持內在環境，都扮演了重要的角色。一些磺酸化的大分子，像是位於細胞表面以及結締組織(connective tissue) 結構中的葡萄糖胺聚醣 (glycosaminoglycan) 和醣蛋白 (proteoglycan)，這些高酸性及高親水性的醣胺聚多醣影響了組織的水合作用(hydration)、彈性(elasticity)以及陽離子組成。此外這些化合物對於細胞外基質蛋白、生長因子、酵素、細胞表面受體都有很高的親和性，而且直接參與了與它們的鍵結。至於在分泌(secretory)蛋白及膜蛋白上的酪胺酸(tyrosine)上，也發現硫酸化(sulfation)影響它的功能的後轉譯修飾。此外，醣蛋白荷爾蒙的醣基部份也會被硫酸化，其硫 7.

(9) 酸化的程度會影響它的生物活性。一些硫醣脂質(sulfoglycolipid)像是神經脂質 (sphingolipid) 和乳甘油脂質 (galactoglycerolipid) 在髓鞘質 (myelin)、精子(spermatozoa)、腎及小腸中含量都非常的多，而且已被證實透過它們和細胞外基質蛋白、細胞黏著受體(cellular adhesive receptor)、血液凝結系統、補體活化系統(complement activation systems) 以及陽離子運輸系統的交互作用可以改變生理功能。因此磺酸化在生物轉化中扮演了值得注意的角色 1。. 1.2 葡萄醣胺聚醣葡萄醣胺聚醣 (Glycosaminoglycans，GAGs)，俗稱為黏多醣，存在於細胞外基質中 (extracellular matrix，ECM) 或者連結在細胞表面的蛋白質上，為體內含量豐富的異質多醣體 (heteropolysaccharides)，作為醣蛋白的一部分廣泛存在於哺乳類動物中，是構成骨骼、血管、皮膚等人體重要器官的主要成分之一。GAGs 以雙醣為單位構成長鏈多醣體，其雙醣之基本結構可能是 N- 乙醯半乳醣胺 (N-acetylgalactosamine ， GalNAc) 或. N- 乙醯葡萄醣胺. (N-acetylglucosamine，GlcNAc) 加上醣醛酸 (uronic acid，UA)，例如葡萄醣酫酸 (glucuronate acid) 或艾杜醣醛酸 (iduronate acid)，隨著 8.

(10) PAPS 經由磺酸化反應後產生的磺酸根修飾於不同醇基位置而有不同的結構。如圖 1-1. 所示，GAGs 主要分佈於細胞表層或細胞外間質中，其長鏈展開的構形導致溶液的高黏度，能夠有效鎖住水分。GAGs 具有韌性與彈性，因而適合做為關節中的潤滑液體，其靭性亦足以支撐細胞結構的完整性及提供離子等小分子的移動孔道，也能夠辨識細胞激素或是成長因子等蛋白質酵素，成為細胞與細胞之間的溝通橋樑 2。常見的 GAGs 有透明質酸 (Hyaluronate，HA，俗稱玻尿酸)、硫酸軟骨素 (Chondroitin sulfate，CS)、硫酸皮膚素 (Dermatan sulfate，DS)、硫酸角質素 (Keratan sulfate，KS) 和硫酸乙醯肝素(Heparan sulfate， HS)及肝素(Heparin)五種分類。如表 1-1. 所示，列出了各種 GAGs 在生物體中存在的區域 3。. 9.

(11) Figure 1-1. Structure and biology of glycosaminoglycans.2. Table 1-1. Characteristics of GAGs.3. 手術中的血液透析和血液體外循環中能防止血液凝固以避免血栓生成；硫酸軟骨素臨床上用於治療風濕痛、關節炎；透明質酸可增 10.

(12) 加關節間的潤滑、保持皮膚的水分與彈性。然而，過多的多醣卻也會危害健康，例如遺傳疾病的黏多醣症 (Mucopolysaccharidoses，MPS)，其患者缺乏能分解特定 GAGs 的水解酵素，造成 GAGs 分解不完全並累積在人體而逐漸產生病症 4。. 1.3 黏多醣症 (Mucopolysaccharidoses，MPS) 黏多醣症（全名為黏多糖貯積症）5,6 是一種遺傳性的先天性新陳代謝異常的疾病，屬於積聚病。其發生率在西方國家約為五萬到十萬分之一，台灣地區據估計至少應該有二百～三百個病例。正常情況下，人體產生酵素來分解我們細胞所需物質。GAGs 是一種長鏈複合糖分子，這物質是構成人體組織和器官的主要成分。黏多醣症的成因是身體缺乏能分解 GAGs 的酵素，令 GAGs 不斷累積在各種細胞組織、血漿、腦脊髓液、尿液中，進而影響細胞的正常功能，破壞身體多個器官，包括心臟、骨骼、關節、呼吸道系統、神經系統。如表 1-2 所示，黏多醣症共有 7 型---一、二、三、四、六、七、九型和許多亞型。黏多醣症沒有第五型和第八型。這七種型號是根據缺少分解某種 GAGs 的酵素和所表現出的症狀來分的。目前，已知 11 種不同的水解酵素的缺乏所導致各類型的黏多醣症，如圖 1-2 所示，缺乏的水解 11.

(13) 酵素以綠字表示，症狀名稱以藍字表示。例如 MPSⅡHunter syndrome 是由於己醛醣酸鹽硫酸脂酵素 (iduronate sulfatase) 的基因發生變異，導致 Hepran sulfate 和 Dematan sulfate 降解不完全而累積在人體內。黏多醣症的堆積是漸進式的過程，因此罹病的小孩在出生時並無異樣，但隨著年齡的增長，逐漸在體內累積過量的 GAGs，會影響其智能、外貌及骨骼發展。罹患黏多醣症的病人多数活不到 20 歲。目前主要的治療有兩種，雖然無法有效的完全根治，但可將降低 20％~80％特定 GAGs 累積在體內的濃度。其一為骨髓移植 (Bone marrow transplantation, BMT) 或造血幹細胞移植 (Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)，透過移植骨髓或臍帶血細胞，為患者提供可以產生所缺失酵素的細胞，此治療能夠延長病患受命、穩定病患神經功能的惡化，但無法紓緩骨骼及心臟方面的病症。另外一種治療為注射酵素來補充和替帶黏多醣症患缺少或缺乏的酵素，其中靜脈注射治療能有效的穩定病患內臟的病變，而近年來研究發現透過鞘內注射能使酵素經由腦脊髓液流經大腦，對神經方面的病變產生治療 7. 。. 12.

(14) Figure 1-2. The structures of heparan, keratan and dermatan sulfates as they are degraded by the indicated enzymes. 3. Table 1-2. Mucopolysaccharidosis classification. 8 13.

(15) 1.4 葡萄糖胺聚醣的分析鑑定方法葡萄糖胺聚醣調控了許多重要的生理機制，但往往因為量少、修飾的穩定度及雜質分離等問題，造成鑑定的困難。除此之外，目前各種分析技術在醣類分離、偵測上，相較於蛋白質體學與基因體學的研究，卻還遠遠落後許多，仍然有很多理論和實際問題有待解決。因此，相較於舊分析方法，新技術的開發成為了一個重要的工作。以質譜為工具的技術平台已普遍地用來研究蛋白質體學以及醣生理學 (glycobiology)，所以為了鑑定這些微量的後轉譯修飾以及醣分子，前分群(prefractionation)的技術更是必要的分離步驟。一般來說，對於不同的醣胺多醣，現今研究常用的方法大多使用酵素降解或是化學降解，以得到不同大小的寡醣，利用高效能液相層析或是毛細管電泳連接質譜儀、螢光光譜儀。只是這些方法大多因為儀器昂貴且需要複雜的處理程序造成分析上的不便，利用奈米粒子固相萃取當做前分群技術已能夠解決這些缺點 9,10。. 1.4.1 電泳法膠體電泳法 (Gel electrophoresis) 是目前用在蛋白質體學的研究上最廣泛應用於分離不同物理性質（如大小、等電點等）的分子。通常用於分析用途，但也可以作爲純化技術，例如在質譜、聚合酶鏈式 14.

(16) 反應、DNA 定序之前，先行純化分析物。早期的電泳是在濾紙上面進行，但是蛋白質容易發熱及變性而有拖尾的現象，改用膠體後改善了發熱及拖尾，至此膠體電泳法才大量應用在蛋白質分析上。其中，二維電泳提供了較好的解析度和分離能力，原理是利用兩種不同的分離機構在兩個垂直維度的方向進行分離，也就是先在第一維度利用等電點聚焦法 (Isoelectric focusing) 將不同等電點的蛋白質分離，再從第二維度用膠體電泳法 (SDS-PAGE) 分離不同分子量的蛋白質 11,12。分離完畢之後藉由蛋白染色 (Coomassie blue and silver staining)、抗體標定 (antibody labeling) 進行標記，而分離出來的蛋白質更可以直接取下用質譜進行身分鑑定 (Protein identification，Protein ID)。但二維電泳的缺點包括所偵測蛋白質的等電點及分子量有限制範圍、靈敏度不佳、分析時間長、且需要大量的樣品。另外傳統電泳法主要適合用在大分子蛋白質，而醣類大多為電中性，且親水性強，也沒有發光基團，所以增加了分離與偵測上的難度。毛細管電泳法 (Capillary electrophoresis，CE) 則是另一種常被用來分離各種 GAGs 雙醣結構的電泳方法，藉由石英毛細管在電場作用下產生的電滲流與電泳動能有效的分離小分子的醣類，是種結合電泳與管柱層析的方法，具有進樣少、靈敏度較傳統電泳高、解析度高、分析時間短等特性. 11,13. 。層析管柱的微小化，再加上高電壓的環境， 15.

(17) 減少了分離時間和加強分離效果，然而通入高電壓，伴隨而來的便是高電流的產生，進而在毛細管內有熱源 (Joule heating) 消散的問題，若不能將熱排掉，會造成溶液黏度改變或是此微量分析物結構發生變化。因此，毛細管電泳容易有再現性不佳的缺點。. 1.4.2 HPLC (High-performance liquid chromatography) 一般高效率液體層析來分離葡萄糖胺聚醣，先是使用大小排除法 (Size-Exclusion Chromatography，SEC) 初步的分離大小不一的寡醣，接著使用強陰離子交換層析法 (Strong anion exchangechromatography， SAX) 進行較細部的分離與濃縮，能夠得到相當好的解析度，缺點是需要大量的溶劑與鹽類 (0.1-2.0 M) 才能沖提出高負電荷的 GAGs，因而造成分析的時間過長；另外過多的鹽類也會造成質譜偵測的靈敏度降低，所以需要額外的去鹽步驟才行；若是使用螢光偵測，則必須在分析前先將葡萄糖胺聚醣進行衍生化，這些缺點導致使用上的不便。使用反相離子對層析法 (Reverse phase ion pair chromatography，RPIP)，雖然解析度不如 SAX-HPLC，但是不需要去鹽，可直接連接質譜使用，也是分析葡萄糖胺聚醣的一項選擇 11,13。. 16.

(18) 1.4.3 黏多醣症的鑑定分析方法至今，藉由分析累積在尿液和血漿裡的 GAGs，已發表出多種用來診斷 MPS 的方法。例如：使用 1,9-dimethylmethylene blue (DMB) 染料檢測可用來快速、簡便的測量尿液中所有的 GAGs 含量，然而儘管 1,9-dimethylmethylene blue (DMB)染料檢測常用來做尿液中 GAGs 的定量分析，卻無法分辨出個別的 GAGs，且不適合做微量定量，只能辨別是否為黏多醣症 14；傳統的 carbazole assay 是利用 GAGs 分子中的 uronic acid 與 carbazole reagent 反應，產生紫色的發色團，於分光光度計以可見光波長 525 nm 下量測其吸收值，但受尿液中的中性醣分子以及尿液中的其他化合物影響很大，且需要大量樣品 15。而電泳無法知道其多醣的結構以及無法有效的辨識專一性修飾。ELISA 已可用來做 KS、HS 在血液及尿液中的定量分析，但在 DS 測量中無法判別其組成與 HS、KS 之間的差別。Electrospray ionization (ESI) MS 及串聯式質譜儀已被用來分析 GAGs 中的寡糖、雙醣及單醣。但在樣品進樣分析前得進行費時、複雜的樣品前處理及標記樣品，此外儀器也非常昂貴。HPLC-ESIMS/MS 可用來偵測 MPS 病人血漿及血液中微量(nmole)HS、DS、KS 雙醣的雙醣衍生物，而此方法需要多種的降解酶來將含有 GAGs 的樣品由多醣降解成雙醣。而藉由逆相 HPLC-ESI-MS/MS 分析尿液中完整的 HS、DS 之二到五醣衍生物來 17.

(19) 診斷 MPS，然而此方法無法鑑定在 MPS 病人尿液中含量較多的大分子質量 GAGs，並且得經過複雜的樣品前處理因此相當費時。這些方法大多因為儀器昂貴且需要複雜的處理程序造成分析上的不便。16. 1.4.4 MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser desorption ionization Time-of-flight Mass spectrometry) 對於鑑定醣類結構的方法，質譜是經常使用到的工具，不論是胜肽、蛋白質或是寡醣等等都可以使用質譜分析。最初的 FAB (Fast atom bombardment) 質譜是最早用在 heparin/heparan sulfate 結構分析的質譜工具 17。近年來，各種軟性游離技術的開發，例如電噴灑質譜、基質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜等，提供了更好的靈敏度和更大的偵測質量範圍，使我們能快速且有效地分析蛋白質、胜肽與醣類。本篇中用到的質譜儀是基質輔助雷射脫附游離離子飛行時間質譜儀 (MALDI-TOF MS)，其離子游離化技術是在 1985 年，由德國的 Hillenkamp 教授及日本的 Karas 先生提出，是屬於軟性游離化技術 18。首先將分析物與基質均勻混合後，於樣品盤中風乾或是真空幫浦抽乾形成樣品-基質的共結晶後，在真空下以雷射光束照射此固態結晶時，基質會吸收雷射能量，大量的基質夾帶分析物脫附而出，過程中分析物與基質會發生質子轉移而產生氣相離子，藉由電場加速後進入飛行 18.

(20) 管中，再被偵測器偵測，透過離子飛行時間轉換成精確的質荷比 (m/z)。其優點是高通量、靈敏度高、儀器偵測極限低，分析時間短，可分析高質量的大分子，圖譜複雜度低，甚至對樣品中的鹽類或介面活性劑有較高的容忍度等等。MALDI-TOF MS 經常被用在快速的鑑定 PTM 修飾和醣類的分析. 19. ，因此找出適合分析經由甲基化降解成雙醣的. GAGs 的基質是必要的工作。. 1.5 胍基團與磺酸基團之間的非共價鍵結過去實驗中發現，在 MALDI 分析之下，磺酸化胜肽和肝素寡醣的游離效率很差，但加入少許帶有精胺酸的鹼性胜肽，使之產生非共價鍵的離子錯合物，便可提高磺酸化胜肽和肝素寡醣在質譜上的訊號強度 20。產生這種狀況的關鍵在於聚精胺酸側鏈上的胍基團和磺酸基團之間的作用力。如圖 1-3. 所示，過去的文獻利用胍離子和硫酸甲烷當做模型，離子間會產生氫鍵在同一平面上，經由計算得到的鍵長為 2.72 或是 2.66Å ，而穩定能為-106.23 或-108.14 千焦每莫耳。除了氫鍵外，兩個離子間的庫倫引力也提供了一部分的貢獻 21。. 19.

(21) Figure 1-3. The structure of guanidium-sulfate complex.. 精胺酸在所有的胺基酸中的鹼性是最強的，擁有超過 14 千焦每莫耳的質子親合性，其 pKa 約為 12.5。精胺酸的強鹼性是因為其側鏈上的胍基團有三種共振式，提供了很高的穩定能 22。某些蛋白質受體會專一性辨識細胞表面硫化乙醯肝素，正是因為胺基酸組成的結構中擁有許多一級胺基團，像是精胺酸或賴胺酸，其立體的結構剛好能夠分享帶有多價負電荷的硫酸乙醯肝素，形成穩定的錯合物，進而影響蛋白質的活性並進行訊息傳遞 2，如圖 1-4. 所示。. 20.

(22) Heparan hexasaccharide binding site. Protein specific binding site. Figure 1-4. Specificity of HSGAG binding to proteins.2. 除了磺酸化或硫酸化，帶負電的修飾還包含磷酸基以及羧基，都有可能與胍基團產生錯合物，根據其不同的酸性而有不同的作用力。表 1-3.中列出計算和實驗得到的 pKa，磺酸或是硫酸的酸性相當強，在大多數的 pH 下依然能夠與帶正電的分子進行錯合。在表 1-4. 中列出了聚賴胺酸、聚組胺酸、聚精胺酸三種高等電點的聚合胺基酸分子和磺酸根分子 ANS- 分子之間的作用力，其中聚精胺酸的結合常數最大，結合能也最大 22，證明了聚精胺酸與磺酸根之間的高親和性結合作用力。. 21.

(23) Table 1-3. Reported and calculated values for acid dissociation constants (pKa) of methyl acids with various acid functional units.22. Table 1-4. Stoichiometries of binding (n), association constants (Kb), and enthalpies of association (△H) of ANS- to poly(amino acids) at 25 °C and pH 2.0a.22. 22.

(24) 1.6 奈米鑽石做為固相萃取（solid-phase extraction）的材料通常從生物體取出的樣品中包含複雜的胜肽或是蛋白質混合物及鹽類等雜質，固相萃取則是最常用的初步分離技術之一。藉由將欲分離物吸附在固態基材表面，不只能夠除去大量雜質，還能夠提高欲分離物的濃度，幫助後續分析實驗的進行。相較於需要大量樣品與溶劑沖提的管柱層析，奈米材料的高比表面積提供更好的吸附能力，可以稱得上是微型的管柱層析。隨著奈米科技的進步與需求，各種材料陸續被研發應用。常用固態基材有疏水性粒子或是高分子粒子，金屬粒子或鐵磁粒子等等，而奈米鑽石則是近年來所發展出來的材料之一，本實驗室也著重在奈米鑽石的製備與其應用研究 10,23, 24。鑽石是由碳原子以 sp3 鍵結所形成的碳結晶，而奈米尺度的鑽石製作的方法有兩種: 一種是利用火藥爆炸所產生的鑽石 (detonation nanodiamond)；另一種是利用高溫高壓環境下所產生的鑽石 (High pressure high temperature, HPHT nanodiamond)。不論是哪種方法製作的奈米鑽石，其表面大都包覆 sp2 結構的石墨或是煤灰等雜質，除了雜質外，表面上也具有許多複雜的官能基，如圖 5. 所示。藉由浸泡強酸酸洗鑽石表面，除去表面雜質，並產生較多的羧基 (carboxy group)，酸洗過後的奈米鑽石便可進一步應用於固相萃取或表面修飾以及生物實驗上。 23.

(25) Figure 1-5 Cluster structure of detonation diamond and surface functional groups.25. 24.

(26) 2. 實驗 2.1 藥品與材料 Poly-L-arginine hydrochloride (molecular weights reanging from 15000 to 7000) CS (Chondroitin sulfate sodium salt from bovine cartilage) DS (Chondroitin sulfate B sodium salt) HS (Heparan sulfate sodium salt from bovine kidney) Deuterium (2H)-labeled methanol Acetyl chloride Methanolic HCl 3N N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride (NEDC) Silver nitrate 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) 3-Aminoquinoline (3-AQ) 1,1,3,3,-Tetramethylguandine (TMG) All of above were purchased from Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Sodium chloride Potassium phosphate monobasic All of above were purchased from Acrose. Potassium chloride Magnesium chloride anhydrous All of above were purchased from 和光 25.

(27) Calcium chloride, anhydrous All of above were purchased from 藥理. Sodium bicarbonate All of above were purchased from J.T.Baker. Sodium sulfate All of above were purchased from Mallinckrodt. N-(3-Dimethylaminopropyl)-N’-ethylcarbodiimide Hydrochloride (EDC) N-hydroxysuccinimide (NHS) All of above were purchased from Fluka (Seelze, Germany). 100 nm nanodiamond from General Electric (USA) Sulfuric acid from Fisher Scientific Acetonitrile (ACN) from J.T Baker (Phillipsburg, NJ). 2.2 儀器設備基質輔助脫附游離-飛行時間質譜儀 (MALDI-TOF MS) 本論文使用的質譜儀是購自美商布魯克道爾頓 ( Bruker Daltonics )，型號為 Microflex，使用雷射為 337nm 氮氣雷射 (pulse width 3ns)，在操作時皆使用負離子模式 (negative mode)，分析時的. 26.

(28) 加速電壓為 20kV，電壓脈衝離子延遲時間為 (200~400ns)，雷射總發數從 100 到 300 發，發射頻率為 5Hz。. 動態光散射儀 (Dynamic light scattering, DelsaNano C, Beckman Coulter,USA ). 聚焦微波化學反應系統（Discover BenchMate, CEM）微波為一種電磁波，能量比紅外光稍弱，分子吸收微波之後會快速的轉動，分子跟分子之間因為快速轉動而彼此摩擦，進而產生大量熱能，此能量可以轉作化學反應所需的能量，可以輕易跨越活化能，縮短反應時間讓反應更快速的完成，本篇論文主要使用此儀器進行醣降解的反應。. 27.

(29) 2.3 實驗步驟 2.3.1 奈米鑽石製備購自奇異公司 (G.E) 以高溫高壓法製作的鑽石，其表面包覆許多複雜的官能基與石墨，所以需要做些前處理步驟，才能夠修飾聚精胺酸於其上。. 去石墨化: 1. 取約 1000 mg 大小為 100 nm 的奈米鑽石放入玻璃培養皿上，加入些許酒精，使鑽石溶液均勻散布在培養皿上。 2. 利用加熱板加熱培養皿使酒精蒸發其溫度略高於室溫，待鑽石完全乾燥後，放入烘箱以 450 ℃烘烤 2 小時後回收。. 表面酸洗: 1. 帶降溫後，收集去石墨化後的奈米鑽石粉末轉放入圓底燒瓶中，再加入適量濃硝酸及濃硫酸 (v/v = 1/3)，總量以能覆蓋過奈米鑽石粉末即可。 28.

(30) 2. 將圓底燒瓶放入微波反應器 (CEM, NC, USA) 中進行酸洗反應，設定 100 瓦、100 ℃反應一小時，重複三個循環，待反應物冷卻至室溫。 3. 加入大量去離子水，靜置一天，待鑽石粉末沉澱後，移除上清液將，再加入去離子水清洗，並以 15,000 rpm（KUBOTA, Tokyo, Japan）離心 10 分鐘，移除上清液。 4. 重複步驟 3 數次，直至水溶液為中性為止，再以酒精清洗並以 15,000 rpm （KUBOTA, Tokyo, Japan）離心 10 分鐘，移除上清液。 5. 將鑽石加熱除去剩餘酒精，戴鑽石粉末完全乾燥後，用去離子水將鑽石配成 20 mg/ml 水溶液備用。. Figure 2-1.The surface functionalization of nanodiamond before and after acid wash treatment.. 29.

(31) 2.3.2 聚精胺酸的修飾 1. 取前處理過的鑽石 50 μL (20 mg/mL)，離心 (15000 rpm, 3 分鐘) 去除上清液後，加入 30 μL EDC (20 mg/mL)、30 μL NHS (20 mg/mL)，940 μL MES buffer (0.1 M，pH 6)，配置成 1 mg/mL 的濃度。 2. 超音波震盪 2 分鐘，放在攪拌器上搖晃反應 15 分鐘，此步驟為完成羧基奈米鑽石活化。 3. 離心(10,000 rpm, 1 分鐘)，移除未反應的 EDC、NHS，再加入 1 mL PBS (pH 7.4) 清洗。 4. 重覆步驟 3 兩次，加入 200 μL 聚精胺酸溶液 (5 mg/ml)，以 PBS buffer 調整至 1 mL，超音波震盪直至鑽石粉末均勻分布於溶液中，放在攪拌器上搖晃反應 2 小時，完成聚精胺酸-羧基奈米鑽石探針的合成反應。 5. 離心(15,000 rpm, 5 分鐘)，移除未反應的聚精胺酸溶液，再以 1 mL 去離子水清洗兩次。 6. 把合成好之聚精胺酸-羧基奈米鑽石探針以去離子水配製成 1 mg/mL 備用。. 30.

(32) Figure 2-2. Fabrication of polyarginine-coated nanodiamonds.. 2.3.3 利用傳統加熱方法做醣的消化及切醣 Methanolic HCl (3N)脫去 GAG polymer chain 上的硫酸根並將 GAG polymer chain 切成雙醣。 1. 將硫酸軟骨素多醣以去離子水配置成 20 mg/L，取 25 µL 加到 1 mL 的玻璃瓶中以氮氣吹乾。 2. 加入 200 µL Methanolic HCl (3N)，超音波震盪 10s。 3. 將玻璃瓶放入恆溫槽中，溫度設為 65 °C，加熱 75 分鐘。 4. 加熱結束後，以氮氣吹乾溶劑。 5. 加入 10 mL 去離子水將樣品充分混和均勻。 6. 取 1 µL 樣品滴在樣品盤上，再混和 1 µL 基質溶液，接著真空抽乾樣品後利用 MALDI 進行分析。. 31.

(33) 2.3.4 聚精胺酸奈米鑽石對硫酸軟骨素多醣有效吸附量的估計為了知道聚精胺酸修飾過後的奈米鑽石，能夠吸附多少硫酸軟骨素多醣，本篇使用了過量的硫酸軟骨素多醣，逐次的用奈米鑽石飽和吸附後，以奈米鑽石吸附的次數，簡單的估計修飾後的奈米鑽石對雙醣之有效吸附量。 1. 配置 40 mg/L 硫酸軟骨素多醣 25 μL 。 2. 加入 20 μg 聚精胺酸修飾的奈米鑽石。 3. 超音波震盪 15 分鐘。 4. 以轉速 15000 rpm 離心 10 分鐘。 5. 使用微量滴管小心抽取上清液，避免吸取到奈米鑽石，將上清液抽取至另一管 1.5 mL eppendorf 微量離心管中。 6. 重複 2 到 5 步驟 3~4 次，共收集 4~5 個移去上清液且含有奈米鑽石沉澱物之微量離心管，接著放入幫浦將剩餘水分抽乾。 7. 各加入 200 µL Methanolic HCl (3N)，超音波震盪 10 s。 8. 將溶液從微量離心管轉移至微波加熱管中。 9. 加熱結束後，以氮氣吹乾溶劑。 10. 加入 40 mL 去離子水將樣品充分混和均勻，在將溶液轉移至微量離心管中，離心取上清液。 32.

(34) 11. 將上清液濃縮至 10 μL。 12. 個別取 1 μL 與 10-3 M NEDC 基質溶液 1 μL 混合後，滴在 MALDI 樣品盤上，之後真空抽乾，並利用 MALDI 進行分析。. 33.

(35) 3. 結果與討論 3.1. 利用甲醇降解 (Methanolysis)將硫酸軟骨素多醣降解成雙醣由於體內酵素代謝完全及不完全，不管在正常人或黏多醣症病人其累積在組織、尿液、血漿及腦脊髓液中的葡萄糖胺聚醣之分子大小並不固定且種類眾多含多種雙醣、寡醣及多醣，因此對於質譜定量分析上相當困難且複雜 16,26。此外葡萄糖胺聚醣上的磺酸根，是以氧硫鍵結 (O-SO3) 或是氮-硫鍵結(N-SO3) 在六碳醣上，在 MALDI 的脫附游離過程和真空中並不穩定，以往得到的質譜圖往往是磺酸根裂解的訊號強過母離子訊號。本篇利用化學降解法之甲基降解能將長鏈的葡萄糖胺聚醣降解為中性雙醣為一單位之簡單雙醣分子，以利做為 MALDI 的定量和定性分析。如圖 3-1 所示，以硫酸軟骨素多醣(CS) 為例，在經過甲基降解 (Mthanolysis)後，長鏈的葡萄糖胺聚醣會除去硫酸根並且斷鍵形成穩定的雙醣結構，其降解後之硫酸皮膚軟骨素多醣 (CS)分子質量為 425.2。. 34.

(36) CH2OH OSO3-. COO-. O O. H. H. NHCOCH3. H H. H H. OH. OH. COO-. H H. H. O. H. O. H. OH. H. O. H. H. H. O OSO 3. O. H. H. CH2OH. NHCOCH3. OH. n. H H. OH. Methanolysis CH2OH. COOCH3. O. O. H H OH. H H. H. OH. OCH3. H. H H. O. OH. H. OH. NHCOCH3. C16H27NO12 Molecular weight: 425.39 Figure 3-1. Degradation of chondroitin sulfate by methanolysis.27. 3.2. 一般 MALDI 基質於降解後硫酸軟骨素多醣之雙醣的分析硫酸軟骨素多醣之降解後雙醣為中性醣。首先必須找到適合使用在此降解後雙醣分析時的 MALDI 基質，才能以 MALDI-TOF 質譜分析。儘管中性醣在 MALDI 的脫附游離過程和真空中較為穩定，但以往得到的質譜圖往往是帶有鹼金族之離子，可能同時帶有鈉、鉀、銫、鋰等離子的訊號，且過多的鹽類也會造成靈敏度下降，增加辨識訊號 35.

(37) 的複雜度 28。如圖 3-2 所示，我們測試了常用於中性醣類的基質，各以不同濃度與 5 µg 降解後硫酸軟骨素雙醣等體積混和後，直接利用 MALDI-TOF 質譜分析。如圖 3-2 所示，左邊的(a)、(c)圖為正離子模式，(a)圖為 100 mM 2,5-Dihydrobenzoic acid (DHB)與 5 µg 降解後硫酸軟骨素雙醣等體積混合的質譜圖， (c) 圖為 30 mg/mL 3-aminoquinoline (3-AQ)與 5 µg 降解後硫酸軟骨素雙醣等體積混合；右邊的(b)、(d)圖則為負離子模式， (b)圖為 100 mM DHB 與 5 µg 降解後硫酸軟骨素雙醣等體積混合的質譜圖，(d)圖為 30 mg/mL 3-AQ 與 5 µg 降解後硫酸軟骨素雙醣等體積混合。在正離子模式下，除了測得降解後硫酸軟骨素雙醣帶有氫離子的訊號外，還分別獲得帶有鈉、鉀離子的訊號；另外在正離子模式下，DHB 及 3-AQ 都無法測得降解後硫酸軟骨素雙醣的訊號。不管是在正離子模式下或負離子模式下， DHB 及 3-AQ 的基質訊號大大地干擾了降解後硫酸軟骨素雙醣的訊號，不只抑制了降解後硫酸軟骨素雙醣的訊號，也有鈉、鉀鹽類訊號的干擾，增加了訊號辨識的困難度，因此使用 DHB 與 3-AQ 在 MALD-TOF 質譜分析得到的結果不甚理想。. 36.

(38) Positive ion mode. 100. RP_DHB. [M+K] (a) 464 + [M+H] + [M+Na] 426 448. 100. +. Negative ion mode RN_DHB. (b). Relative intensity(%). *. *. 0. *. 0. RP_3-AQ. 100. (c). RN_3-AQ. *. 100. *. *. 0 400 420 440 460 480 500 m/z. (d). 0 400 420 440 460 480 500 m/z. Figure 3-2. Comparison of the MALDI-TOF mass spectra of methanolysis product of CS (5 µg) obtained by conventional hot bath for 75 min at 65 °C using two different matrices: (a, b) 2,5- dihydroxybenoic acid and (c, d) 3-aminoquinoline. The spectra shown in (a – c) and (b – d) were acquired in the positive and negative ion modes, respectively. The asterisks denote the peaks associated with degraded products of chondroitin-4-sulfate.. 3.3. 基質 NEDC 於硫酸軟骨素雙醣的分析先前的文獻上證實本篇所使用的基質 N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride (NEDC)是個容易吸收雷射能量，且高耐鹽的基質，適合用來分析小分子的中性醣，且在低分子量範圍基質訊號干擾小、背景基線較平，如圖 3-3 所示，NEDC 在負離子模式下，只會有. 35. Cl-、37Cl-在 m/z 34.97、36.97 及[HCl+Cl]-同位素離子群在. m/z 70.75、72.75 和 74.75 等訊號，並不會有 NED 及其碎片的離子訊號產生 29。 37.

(39) Figure 3-3. Negative ion MALDI-TOF mass spectrum of NEDC (0.1 M, 1 μL).29. 如圖 3-4(a)所示，發現在負離子模式下，將 5 µg 降解後之硫酸軟骨素多醣以 NEDC 為基質所得的質譜分析圖譜，可得到降解後硫酸軟骨素多醣之雙醣帶有氯離子[M+Cl]-的訊號(m/z 460)。此外在 m/z 410 的訊號推論為在 methanolysis 反應過程中，反應試劑添加不足導致甲基化不完全[M-CH3]-的訊號，因此如圖 3-5(b)所示，在 50 ng 之降解後硫酸軟骨素多醣其 m/z 410 的訊號明顯下降許多，而圖 3-5(c) 在 25 ng 硫酸軟骨素多醣中由於添加足夠的 methanolysis 反應試劑，因此不會有甲基化不完全的訊號出現。由結果證明 NEDC，能有效偵測並容易辨識降解後之硫酸軟骨素多醣，並不會有鈉、鉀鹽類訊號的干擾，適合當作 MALDI-TOF 分析降解後之硫酸軟骨素多醣時的基質。. 38.

(40) [M-CH3]* 410. Relative intensity(%). 100. [M+Cl]* 460. NEDC. 7365. (a). 0 100. 0 1724 (b). 3-AQ * 0 100. 0 8952 DHB. (c). 0. 0 400. 420. 440. 460. 480. 500. m/z. Figure 3-4. Negative ion MALDI-TOF mass spectra of methanolysis products of CS (5 µg) obtained by conventional hot bath for 75 min at 65 °C using (a) NEDC, (b) 3-AQ and (c) DHB as matrix.. [M-CH3]* 410. Relative intensity(%). 100. [M+Cl]* 460. 5 µg. 0 100. *. 7365. (a). 0 4747. (b). 50 ng 0 100. 0 2270. * (c). 25 ng 0. 0 400. 420. 440. 460. 480. 500. m/z. Figure 3-5. Negative ion MALDI-TOF mass spectra of different amounts of methanolysis product of CS obtained by conventional hot bath for 75 min at 65 °C . The concentrations of methanolysate are (a) 5 µg, (b) 50 ng and (c) 25 ng, respectively. 39.

(41) 3.4. 利用傳統加熱方法對硫酸軟骨素多醣的消化及降解之質譜分析過去文獻中提到，硫酸軟骨素多醣加入 200µL (3N) Methanolic HCl，在恆溫槽加熱 65 ℃反應 75 min 為最佳反應條件 7。在此反應條件下，其降解後之雙醣 (dimer) 對單醣 (monomer) 的相對豐富比例最大。如圖 3-6 所示，當反應時間超過 75 分鐘後，雙醣的比例下降，生成物趨向單醣結構。圖 3-7(a)是利用傳加熱方式，將硫酸軟骨素多醣在恆溫槽加熱 65 ℃反應 75 min 後，吸取 1 µL 以 NEDC 為 matrix 所得的質譜分析圖譜，可發現降解後硫酸軟骨素多醣之雙醣帶有氯離子的訊號。. GAG Dimer Production vs Time 140 120. Response. 100 80. CS 60. DS. 40. HS. 20 0 0. 50. 100. 150. 200. 250. Time (min). Figure 3-6. Production of CS, DS and HS dimers from standards with methanolysis time.7 40.

(42) 100 conventional hot bath. [M+Cl]* 460 (a). 8491. Relative intensity(%). 65℃,75 min. 0. 0. 100. 9826. * microwave irradiation. (b). 65℃,7 min. 0. 0 400. 420. 440 m/z. 460. 480. Figure 3-7. Negative ion MALDI-TOF mass spectra of methanolysis product of CS (25ng) obtained by (a) conventional hot bath for 75 min at 65 °C , and (b) microwave irradiation for 7 min at 65 °C.. 3.5.. 利用微波加熱方法對硫酸軟骨素多醣的消化及降解. 之 MALDI 偵測極限接下來為了知道能夠利用微波來降解低濃度且微量的硫酸軟骨素多醣，並且可以被 MALDI-TOF 質譜給偵測，於是配置 0.5 到 10mg/L 的硫酸軟骨素多醣，各取 25 µL 來進行 Methnolysis 反應，反應後再稀釋 10 倍來做偵測，因此相當於每 MALDI 樣品點(1 µL)中從 25 到 2.5 ng，來得到其偵測極限範圍。如圖 3-8 所示，分別是 25、12.5、5、 2.5 ng 的降解後硫酸軟骨素多醣之雙醣訊號質譜圖，可發現即使在 1 mg/L 如此低濃度下，約 2.5 ng，仍可獲得乾淨的訊號質譜圖。而在 41.

(43) 硫酸軟骨素多醣濃度為 0.5 mg/L 時，約 1.25 ng，如圖 3-9 所示，儘管在此低濃度下其由基質所產生的訊號較樣品訊號來的高，但我們仍可獲得 m/z 460 的訊號，其訊號雜訊比為於 49.1。因此可以藉由偵測極限之訊號雜訊比≧3，來推算本篇利用 MALDI-TOF 質譜來偵測硫酸軟骨素多醣經降解後之雙醣訊號，結合 NEDC 當作基質在體積為 25µL 之樣品的絕對偵測極限濃度為 0.03 mg/L，相當於在 MALDI 樣品點上的偵測極限為 75 pg。. 100. *. 25 ng. [M+Cl]9146. 460. 0. 0. Relative intensity(%). 100. *. 12.5 ng. 6918. 0. 0. 100. *. 5 ng. 5746. 0. 0. 100. *. 2.5 ng. 4016. 0. 0 400. 420. 440. 460. 480. 500. m/z. Figure 3-8. Negative ion MALDI-TOF mass spectra of different amounts of methanolysis product of CS obtained by microwave irradiation for 7 min at 65 °C. The methanolysate are (a) 25 ng, (b) 12.5 ng, (c) 5 ng and (d) 2.5 ng, respectively.. 42.

(44) *. 100. 2359. Relative intensity(%). 1.25 ng. 460. 461. 462. 463. m/z. 460.65. 0. 0 400. 420. 440. 460. 480. 500. m/z. Figure 3-9. Negative ion MALDI-TOF mass spectra of methanolysis product of CS (1.25 ng) obtained by microwave irradiation for 7 min at 65 °C. Inset: Enlarged view of the peaks at around m/z 460.. 3.6. 人體尿液中硫酸軟骨素多醣之分析由於尿液中含有大量的尿素、尿酸、鹽類、代謝物及蛋白質，這些化合物都會干擾硫酸軟骨素多醣在質譜分析上的訊號。本實驗室在 2006 年所發表的文獻中提到利用酸洗奈米鑽石可有效的萃取出尿液中所含的蛋白質 24。另外，先前學長們的實驗證實了聚精胺酸奈米鑽石對磺酸根有很強的吸附能力，因此對磺酸化胜肽及肝素皆有高度純化濃縮的能力，而硫酸軟骨素多醣在分子結構上也擁有與磺酸化胜肽、肝素雙醣一樣的硫酸根。因此本實驗先利用酸洗奈米鑽石將尿液中的蛋白質萃取出來，達到快速純化尿液的效果，而在緒論中提到磺酸根 43.

(45) 的 pKa 值為負的，因此帶有磺酸根之硫酸軟骨素多醣不易被酸洗鑽石吸附，因此硫酸軟骨素多醣存在於以酸洗鑽石萃取後之尿液上清液中，接著利用聚精胺酸奈米鑽石能夠專一性的萃取出純化後尿液中的硫酸軟骨素多醣來進行 Methanolysis 降解，並且利用 MALDI MS 進行分析。. 3.6.1. 奈米鑽石的粒徑分佈 (size distribution) 與表面電位 (zeta potential) 的量測聚精胺酸修飾後之奈米鑽石，有必要去確認修飾是否成功鍵結在奈米鑽石表面，藉由表面官能基的改變，表面電位與粒徑大小的測量成為一種可靠的驗證方法。粒徑大小比較，如圖 3-10 所示，酸洗過的奈米鑽石平均粒徑約為 100 nm 左右，而修飾上聚精胺酸之奈米鑽石平均粒徑增加 30 nm 為 130 nm 左右。表面電位比較，如圖 3-11 所示，酸洗過的奈米鑽石表面帶有負電荷的羧基，因此在中性的水中測量得到的表面電位則為負值，而修飾上聚精胺酸之奈米鑽石，由於表面的官能基變成胺基為主，因此表面電位會轉變為正值。. 44.

(46) Number distribution (%). 50. Acid-treated NDs. Avg : 90.6 ± 25.0 nm. 40. PA-coated NDs. Avg : 112.3 ± 36.2 nm. 30 20 10 0 0. 50. 100. 150. 200. 250. 300. Diameter (nm). Figure 3-10. The number distributions of acid-treated NDs and PA-coated NDs.. Normalized intensity. 1.0 Acid-treated NDs Avg: -12.20 mV PA-coated NDs Avg: 37.68 mV. 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 -100. -50. 0. 50. 100. 150. 200. Zeta potential (mV). Figure 3-11. The zeta potentials (mV) of acid-treated NDs and PA-coated NDs.. 3.6.2. 聚精胺酸奈米鑽石探針萃取濃縮硫酸軟骨素多醣有效吸附量的估計首先，先證實聚精胺酸奈米鑽石也對硫酸軟骨素多醣有如此專一親和性，並且利用 MALDI 質譜進行分析，接著由於我們期望能將奈米鑽石探針應用於真實樣品，所以我們必須了解其探針對硫酸軟骨素 45.

(47) 多醣的飽和吸附量。在圖 3-12 實驗中，我們以 20 µg 的聚精胺酸奈米鑽石探針分別去萃取 5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L 各 25 µL 之硫酸軟骨素多醣，接著經過甲基化降解再以 MALDI-MS 分析。發現所獲得的質譜訊號與未經過聚精胺酸奈米鑽石探針萃取相同，皆得到 m/z 460 降解後之硫酸軟骨素雙醣的訊號，因此說明了硫酸軟骨素多醣能像磺酸化胜肽、肝素雙醣一樣，成功的被聚精胺酸修飾的奈米鑽石所吸附。而從圖 3-12 ，我們可以發現聚精胺酸奈米鑽石探針(20 µg)在萃取 5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L 各 25 µL 之硫酸軟骨素多醣所測得的訊號強度有明顯的變化，但濃度從 20 mg/L 提高到 30 mg/L 時沒有明顯的增長，因此我們可以推估 20 µg 的聚精胺酸奈米鑽石探針對硫酸軟骨素多醣的飽和吸附量大約介於濃度 20 mg/L 至 30 mg/L 的 25 µL 硫酸軟骨素多醣之間。. 46.

(48) [M+Cl]10000. 460. CS 5mg/L 25uL. 5000. *. 0 10000. Intesity (A.U.). (a). (b). CS 10mg/L 25uL. *. 5000 0 10000 5000. CS 20mg/L 25uL. *. (c). CS 30mg/L 25uL. *. (d). 0 10000 5000 0 400. 420. 440. 460. 480. 500. m/z. Figure 3-12. Negative ion MALDI-TOF mass spectra of methanolysis products of CS, obtained with enrichment using 20 µg of PA-coated NDs and followed by micro-wave assisted methanolysis. The concentrations of CS are (a) 5 mg/L, (b) 10 mg/L,(c) 20 mg/L and (d) 30 mg/L, respectively. One-tenth of the methanlysate was used for direct MALDI MS analysis.. 我們再以另一種實驗來推估並雙重確認聚精胺酸奈米鑽石探針對硫酸軟骨素多醣的飽和吸附量，如圖 3-13 我們也利用 20 µg 的聚精胺酸奈米鑽石探針但多次萃取較大量之硫酸軟骨素多醣，以萃取 40 mg/L 為例，如圖 3-13(c)，在連續 3 次的萃取下，可幾乎把 40 mg/L 的 25 µL 硫酸軟骨素多醣完全萃取出來，我們可以發現在前兩次所萃取的量在質譜分析下其相對訊號強度幾乎差不多，可見前兩次的所萃取的量是飽和吸附。. 47.

(49) 100. (a). (b). (c). 20 mg/L. 30 mg/L. 40 mg/L. Relative intensity(%). 80. 60. 40. 20. 0 1. 2. 3. 1 2 3 Extraction times. 1. 2. 3. Figure 3-13. Equential extractions of CS using 20 µg of PA-coated ND s for subsequent characterization by microwave-assisted methanolysis and MALDI TOF MS. The concentrations of CS are (a) 5 mg/L, (b) 10 mg/L,(c) 20 mg/L and (d) 30 mg/L, respectively. One-tenth of the methanlysate was used for direct MALDI MS analysis. The relative intensities of sulfated disaccharides in the spectra were analyzed by three trials, with the peak area averaged.. 在 40 mg/L 的萃取實驗中，如表 3-1，聚精胺酸奈米鑽石探針地一次萃取質譜訊號強度為 5596.9，而全部萃取的總訊號強度為 11517.9，因此可得第一次萃取的比例約為 0.49，乘上 40 mg/L 與 25 µL 再除以 20 µg 可得聚精胺酸奈米鑽石探針對硫酸軟骨素多醣之有效吸附量為 24.3 ng CS /µg PAND，而三次不同濃度實驗的平均所得聚精胺酸奈米鑽石探針對硫酸軟骨素多醣之有效吸附量約 23.5 ng CS /µg PAND。. 48.

(50) 單位: ng CS /µg PAND. Table 3-1. Estimated adsorption capacity of CS by PA-coated NDs.. 3.6.3. 人體尿液中硫酸軟骨素多醣之分析如圖 3-14 所示，分別配置 50、20、10、2、1 mg/L 的硫酸軟骨素多醣在 25 µL 的尿液中來進行 Methanolysis 降解再經由 MALDI MS 分析。本實驗先利用酸洗奈米鑽石將尿液中的蛋白質萃取出來，接著利用聚精胺酸奈米鑽石能夠專一性的萃取出純化後尿液中的硫酸軟骨素多醣，成功的偵測到 1 mg/L 的硫酸軟骨素多醣在 25 µL 尿液中。. 49.

(51) 100. [M+Cl]* 460. 50 mg/L. 6425. (a). 0. 0. Relative intensity(%). 100. *. 20 mg/L. 5540. (b). 0. 0. 100. *. 10 mg/L. 4048. (c). 0. 0. 100. *. 2 mg/L. 3199 (d). 0. 0. 100. *. 1 mg/L. 2612 (e). 0. 0 400. 420. 440. 460. 480. 500. m/z. Figure 3-14. Negative ion MALDI-TOF mass spectra of methanolysis products of CS, obtained with enrichment using 20 µg of PA-coated NDs and followed by micro-wave assisted methanolysis. The concentrations of CS spiked in the urine are (a) 5 mg/L, (b) 10 mg/L,(c) 20 mg/L and (d) 30 mg/L, respectively. methanlysate was used for direct MALDI MS analysis.. One-tenth of the. 文獻中指出，一般正常人在尿液中所含的硫酸軟骨素多醣約為 16 mg/24 h，而正常人一天排尿量約 2 L31。但將 25 µL 未添加硫酸軟骨素多醣的尿液進行 Methanolysis 降解再經由 MALDI MS 分析，卻沒偵測到降解後硫酸軟骨素雙醣 m/z 460 的訊號，因此推論用 25 µL 的尿液來進行分析，由於體積太小無法測得在尿液中低濃度含量的硫酸軟骨素多醣。因此圖 3-15 將尿液體積增加為 250 µL，圖 3-15 (a)為未添加硫酸軟骨素多醣的尿液，在體積增加後可偵測到降解後硫酸軟骨素雙醣 50.

(52) m/z 460 的訊號，圖 3-15(b)為添加 20 mg/L 的硫酸軟骨素多醣在尿液中，在同樣的雷射功率下，比較(a)、(b)兩圖的 m/z 410 與 m/z 460 相加所得的訊號強度總和，發現添加 20 mg/L 的硫酸軟骨素多醣在尿液中的訊號強度為未添加硫酸軟骨素多醣之尿液訊號強度的 3 倍，可藉由此推估尿液中所含之硫酸軟骨素多醣約為 10 mg/L，與文獻中提到正常人在尿液中所含的硫酸軟骨素多醣濃度相近。 [M+Cl]-. *. 100. Relative intensity(%). Pure urine 250L. 460. 2391. (a). 0. 0. 100. 5084 [M-CH3]-. 20 mg/L 250 L. (b). 410. * 0. 0 400. 420. 440. 460. 480. 500. m/z. Figure 3-15. Negative ion MALDI-TOF mass spectra of methanolysis products of CS, obtained with enrichment using 20 µg of PA-coated NDs and followed by micro-wave assisted methanolysis. The concentrations of CS spiked in 250µL urine are (a) pure urine and (b) 20 mg/L. One-tenth of the methanlysate was used for direct MALDI MS analysis.. 51.

(53) 4. 結論在本篇論文中，我們成功的利用 MALDI-TOF MS 對硫酸軟骨素多醣做定性和定量分析。首先，我們利用化學降解方法(methanolysis) 將硫酸軟骨素多醣降解為中性雙醣分子，並且在微波的輔助下，將 methanolysis 的反應時間由 75 分鐘縮短至 7 分鐘。除此之外，我們還發現具有較低的基質背景干擾，且耐鹽之含氯芳香化物 N-(1-naphthyl) ethylenediamine dihydrochloride (NEDC) 適合當作分析降解後硫酸軟骨素雙醣的 MALDI 基質，較一般中性基質背景干擾少，不會有金屬鹽類的訊號。高靈敏度的 MALDI-TOF 質譜搭配基質 NEDC 來分析本篇使用 methanolysis 降解後之軟骨素多醣，其偵測極限可以到 75 pg，較過去其他分析硫酸軟骨素的方法之偵測極限來的低。另外，在定量分析上，我們配置 deuterio-methanolysis 試劑，將軟骨素多醣做同位素甲基化降解，來做為內標準品，藉由添加內標準品來做定量，成功了克服了 MALDI 在定量上的困難。結合高耐鹽的基質 NEDC，不需要經過前處理及去鹽，就成功的偵測到低濃度(1 mg/L)的硫酸軟骨素多醣在微量(25 µL)的人工腦脊髓液中。在高複雜的尿液中，利用本實驗室發展出的奈米鑽石及表面修飾聚精胺酸之奈米鑽石當作固相萃取的新材料能夠快速的對硫酸軟骨素多醣進行 Pre-fractionation 的前處理並結合高靈敏度的 MALDI-TOF 質譜進行分 52.

(54) 析，成功的測得尿液中所含的硫酸軟骨素多醣。綜合以上，我們成功的發展出快速且靈敏用來分析複雜環境中 GAGs 的方法，未來可有效的運用在診斷 MPS 及監控治療效果上。. 53.

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