葡萄糖胺聚醣的分析鑑定方法

葡萄糖胺聚醣調控了許多重要的生理機制，但往往因為量少、修 飾的穩定度及雜質分離等問題，造成鑑定的困難。除此之外，目前各 種分析技術在醣類分離、偵測上，相較於蛋白質體學與基因體學的研 究，卻還遠遠落後許多，仍然有很多理論和實際問題有待解決。因此，

相較於舊分析方法，新技術的開發成為了一個重要的工作。以質譜為 工 具 的 技 術 平 台 已 普 遍 地 用 來 研 究 蛋 白 質 體 學 以 及 醣 生 理 學 (glycobiology)，所以為了鑑定這些微量的後轉譯修飾以及醣分子，前 分群(prefractionation)的技術更是必要的分離步驟。一般來說，對於不 同的醣胺多醣，現今研究常用的方法大多使用酵素降解或是化學降解，

以得到不同大小的寡醣，利用高效能液相層析或是毛細管電泳連接質 譜儀、螢光光譜儀。只是這些方法大多因為儀器昂貴且需要複雜的處 理程序造成分析上的不便，利用奈米粒子固相萃取當做前分群技術已 能夠解決這些缺點 ^9,10。

1.4.1 電泳法

膠體電泳法 (Gel electrophoresis) 是目前用在蛋白質體學的研究 上最廣泛應用於分離不同物理性質（如大小、等電點等）的分子。通 常用於分析用途，但也可以作爲純化技術，例如在質譜、聚合酶鏈式

反應、DNA 定序之前，先行純化分析物。早期的電泳是在濾紙上面 進行，但是蛋白質容易發熱及變性而有拖尾的現象，改用膠體後改善 了發熱及拖尾，至此膠體電泳法才大量應用在蛋白質分析上。其中，

二維電泳提供了較好的解析度和分離能力，原理是利用兩種不同的分 離機構在兩個垂直維度的方向進行分離，也就是先在第一維度利用等 電點聚焦法 (Isoelectric focusing) 將不同等電點的蛋白質分離，再從 第二維度用膠體電泳法 (SDS-PAGE) 分離不同分子量的蛋白質^11,12。 分離完畢之後藉由蛋白染色 (Coomassie blue and silver staining)、抗體 標定 (antibody labeling) 進行標記，而分離出來的蛋白質更可以直接 取下用質譜進行身分鑑定 (Protein identification，Protein ID)。但二維 電泳的缺點包括所偵測蛋白質的等電點及分子量有限制範圍、靈敏度 不佳、分析時間長、且需要大量的樣品。另外傳統電泳法主要適合用 在大分子蛋白質，而醣類大多為電中性，且親水性強，也沒有發光基 團，所以增加了分離與偵測上的難度。

毛細管電泳法 (Capillary electrophoresis，CE) 則是另一種常被用 來分離各種 GAGs 雙醣結構的電泳方法，藉由石英毛細管在電場作用 下產生的電滲流與電泳動能有效的分離小分子的醣類，是種結合電泳 與管柱層析的方法，具有進樣少、靈敏度較傳統電泳高、解析度高、

分析時間短等特性 ^11,13。層析管柱的微小化，再加上高電壓的環境，

減少了分離時間和加強分離效果，然而通入高電壓，伴隨而來的便是 高電流的產生，進而在毛細管內有熱源 (Joule heating) 消散的問題，

若不能將熱排掉，會造成溶液黏度改變或是此微量分析物結構發生變 化。因此，毛細管電泳容易有再現性不佳的缺點。

1.4.2 HPLC (High-performance liquid chromatography)

接著使用強陰離子交換層析法 (Strong anion exchangechromatography，

SAX) 進行較細部的分離與濃縮，能夠得到相當好的解析度，缺點是 需要大量的溶劑與鹽類 (0.1-2.0 M) 才能沖提出高負電荷的 GAGs，

因而造成分析的時間過長；另外過多的鹽類也會造成質譜偵測的靈敏 度降低，所以需要額外的去鹽步驟才行；若是使用螢光偵測，則必須 在分析前先將葡萄糖胺聚醣進行衍生化，這些缺點導致使用上的不便。

使用反相離子對層析法 (Reverse phase ion pair chromatography，RPIP)，

雖然解析度不如 SAX-HPLC，但是不需要去鹽，可直接連接質譜使用，

也是分析葡萄糖胺聚醣的一項選擇^11,13。

1.4.3 黏多醣症的鑑定分析方法

至今，藉由分析累積在尿液和血漿裡的 GAGs，已發表出多種用 來診斷 MPS 的方法。例如：使用 1,9-dimethylmethylene blue (DMB) 染料檢測可用來快速、簡便的測量尿液中所有的 GAGs 含量，然而儘 管 1,9-dimethylmethylene blue (DMB)染料檢測常用來做尿液中 GAGs 的定量分析，卻無法分辨出個別的 GAGs，且不適合做微量定量，只 能辨別是否為黏多醣症¹⁴；傳統的 carbazole assay 是利用 GAGs 分子 中的 uronic acid 與 carbazole reagent 反應，產生紫色的發色團，於 分光光度計以可見光波長 525 nm 下量測其吸收值，但受尿液中的中 性醣分子以及尿液中的其他化合物影響很大，且需要大量樣品¹⁵。而 電泳無法知道其多醣的結構以及無法有效的辨識專一性修飾。ELISA 已可用來做 KS、HS 在血液及尿液中的定量分析，但在 DS 測量中無 法判別其組成與 HS、KS 之間的差別。Electrospray ionization (ESI) MS 及串聯式質譜儀已被用來分析 GAGs 中的寡糖、雙醣及單醣。但在樣 品進樣分析前得進行費時、複雜的樣品前處理及標記樣品，此外儀器 也非常昂貴。HPLC-ESIMS/MS 可用來偵測 MPS 病人血漿及血液中 微量(nmole)HS、DS、KS 雙醣的雙醣衍生物，而此方法需要多種的 降解酶來將含有 GAGs 的樣品由多醣降解成雙醣。而藉由逆相 HPLC-ESI-MS/MS 分析尿液中完整的 HS、DS 之二到五醣衍生物來

診斷 MPS，然而此方法無法鑑定在 MPS 病人尿液中含量較多的大分 子質量 GAGs，並且得經過複雜的樣品前處理因此相當費時。這些方 法大多因為儀器昂貴且需要複雜的處理程序造成分析上的不便。¹⁶

1.4.4 MALDI-TOF MS (Matrix Assisted Laser desorption ionization Time-of-flight Mass spectrometry)

對於鑑定醣類結構的方法，質譜是經常使用到的工具，不論是胜 肽、蛋白質或是寡醣等等都可以使用質譜分析。最初的 FAB (Fast atom bombardment) 質譜是最早用在 heparin/heparan sulfate 結構分析的質 譜工具¹⁷。近年來，各種軟性游離技術的開發，例如電噴灑質譜、基 質輔助雷射脫附游離飛行時間質譜等，提供了更好的靈敏度和更大的 偵測質量範圍，使我們能快速且有效地分析蛋白質、胜肽與醣類。本 篇中用到的質譜儀是基質輔助雷射脫附游離離子飛行時間質譜儀 (MALDI-TOF MS)，其離子游離化技術是在 1985 年，由德國的 Hillenkamp 教授及日本的 Karas 先生提出，是屬於軟性游離化技術¹⁸。 首先將分析物與基質均勻混合後，於樣品盤中風乾或是真空幫浦抽乾 形成樣品-基質的共結晶後，在真空下以雷射光束照射此固態結晶時，

基質會吸收雷射能量，大量的基質夾帶分析物脫附而出，過程中分析 物與基質會發生質子轉移而產生氣相離子，藉由電場加速後進入飛行

管中，再被偵測器偵測，透過離子飛行時間轉換成精確的質荷比 (m/z)。

其優點是高通量、靈敏度高、儀器偵測極限低，分析時間短，可分析 高質量的大分子，圖譜複雜度低，甚至對樣品中的鹽類或介面活性劑 有較高的容忍度等等。MALDI-TOF MS 經常被用在快速的鑑定 PTM 修飾和醣類的分析 ¹⁹，因此找出適合分析經由甲基化降解成雙醣的 GAGs 的基質是必要的工作。