壹、條件探討
回顧分析植物染料的文獻中，較常出現的染料分子主要為蒽醌類還有 黃酮類兩種化合物，例如茜草素和桑色素。本實驗選擇數種經常出現且已 商業化可購得的標準品進行分析研究，包含三種蒽醌類：茜草素（alizarin），
大黃素（emodin）和紫草素（purpurin），三種黃酮類：木犀草素（luteolin），
檞皮素（quercetin）和桑色素（morin）。分析物之結構如 Fig. 13。根據文 獻，分析物之 pKa 值多集中在 pH 8-9 之間，33-39如 Table 2，可以做為選 擇分析條件的參考。
一、紫外光偵測波長
文獻中使用的紫外光偵測波長大多設在250-280 nm 之間14, 20, 22, 25, 27
， 為了確認最適合的偵測波長，我們將標準品以 80 % ACN 配製成 25 μM 偵 測各個分析物的吸收光譜圖，所得結果如 Fig. 14。其中蒽醌類化合物在 200-500 nm 間皆有吸收峰，如 Fig. 14(a)-(c)，黃酮類化合物在 200-400 間 有吸收峰，如 Fig. 14(d)-(f)，六個分析物的最高吸收波長集中在 200-280 nm 之間，為避免在短波長會有干擾，最後選擇 250 nm 作為偵測波長。
二、電泳條件的探討
（一）緩衝溶液系統之選擇
文獻中使用 CE-UV 分析植物染料的例子並不多 14, 24, 25, 27，其中所使 用的緩衝溶液系統有磷酸鈉，硼酸鈉，pH 值在 8.5-9.5 之間，因此本研究 比較了五種緩衝溶液系統：phosphate, Tris-borate, HCl-borax, NaOH-boric acid 及 NH4Cl-NH3，比較分析在不同緩衝系統下之分離效果，並針對五種
緩衝溶液的 pH 值，濃度，有機溶劑之添加，界面活性劑之添加等條件進
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行最佳化的探討後進行比較，選擇對分析物之分離有最佳效果的緩衝溶液 系統，結果如 Fig. 15。
在 Tris-borate 的系統下，以濃度 0.4 M Tris-borate 在 pH 9.0 添加 10%
ACN 進行分離，如 Fig. 15(e)，整個電泳過程需要 13 分鐘才能將 6 個分析 物分離，且 alizarin 和 emodin 無法達到基線分離，而且 morin 的訊號有嚴 重趨前（fornting）和變寬（broading）的現象，推測是因為在 pH 9.0 的情 況下，borate 的含量不足以和分析物形成錯和物。
以 20 mM HCl-borax 在 pH 8.9 添加 5% ACN 進行分離，結果如 Fig.
15(b)，雖然在 6 分鐘內可以完成六種分析物之分離，但是 purpurin 有嚴重 變寬的情況，且訊號強度微弱，峰高只有 alizarin 的 7%，這在定量上可能 會有線性範圍狹窄的問題。
以 22.5 mM NaOH-boric acid 在 pH 10.2 對分離物進行分離，如 Fig.
15(c)，遷移時間在 5 分鐘內完成，但是 luteolin 和 purpurin 訊號重疊，無 法分離，從電泳層析圖也可以發現其他染料分子之訊號解析度也很差，添 加不同濃度的界面活性劑 SDS 或是 ACN 並沒有明顯改善。
以 10 mM NH4Cl-NH3在 pH 8.9 進行分離，如 Fig. 15(d)，遷移時間在 4 分鐘內結束，但是除了 quercetin 之外，其他染料分子皆無法完全分離，
添加 SDS 或 ACN 也無明顯改善。
以 10 mM phosphate buffer pH 10.4 在 6 分鐘內可以將分析物完全分 離，如 Fig. 15(a)，在不添加界面活性劑和 ACN 的情況下，半高寬解析度 都可以達到 1.46 以上。所以磷酸緩衝溶液在以上 5 種緩衝系統中有最佳的 分離效果。且分離時間較其他以CE-UV 為分析方法之文獻快速14, 24, 25, 27
， 是有潛力的分析方法。因此以下的實驗選用磷酸緩衝溶液進行最佳化條件 之探討。
（二）緩衝溶液 pH 值和濃度
本研究使用 Na2HPO4和 Na3PO4配製成 pH 值 10.0，10.4，10.7，10.9
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和 11.0 的緩衝溶液，在濃度 10 mM 下進行條件探討，如 Fig. 16，發現在 鹼性條件下基線穩定，且有較好的分離效果，因 pH 值大於 10.7 會造成電 流值過高（＞100 μA），為避免焦耳熱影響分離，最後選擇以 Na2HPO4和 Na3PO4配製成 pH 10.4 做為分離條件。
在緩衝溶液的濃度方面，因為磷酸鹽本身導電度較強，所以高濃度下 易引起過高的電流（＞100 μA），所以本研究比較 5 mM，10 mM，15 mM 和 20 mM phosphate 對分析物分離之影響，如 Fig. 17，發現濃度在 5 mM 時，緩衝能力不足，無法將分析物完全分離，濃度在 15 mM 時，luteolin 和 purpurin 的訊號遷移時間會重疊，所以選擇 10 mM phosphate 為最佳條 件，此條件下電流值約 50 μA。
（三）有機溶劑和界面活性劑之添加
文獻中針對數種有有機溶劑添加物進行探討：1-propanol、2-pronanol、
EtOH、MeOH 和 ACN24, 25, 27，考量樣品配置在 80%之 ACN 溶液中，本研 究嘗試在10 mM phosphate pH 10.4 的緩衝溶液中添加 0%、2.5%、5%、7.5%、
10%和 12.5% 體積比的 ACN，比較分離效果，發現添加有機溶劑使遷移 時間變慢，如 Fig. 18，可能是因為有機溶劑的添加改變溶液的黏滯性
（viscosity），造成 EOF 速度降低，所以在往後的實驗中不添加有機溶劑。
界面活性劑 SDS 在 CE 中是常見的添加劑，在分析植物染料的文獻 中也被使用過，25, 27本實驗探討在phosphate 緩衝溶液中添加 0 mM，5 mM，
7.5 mM，10 mM 和 15 mM 之 SDS，結果如 Fig. 19，發現隨著 SDS 濃度加 高，分析物之遷移時間往前，但是 quercetin 和 morin 的解析度反而變差，
如Table. 3。因此本研究在植物染料的分析不添加界面活性劑，以 10 mM 磷 酸緩衝溶液，pH 值 10.4 為最佳分離條件。
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三、偵測極限和定量極限
以最佳化條件，10 mM phosphate，pH 10.4，分離電壓 20 kV，偵測波 長設定在 250 nm，進行線性範圍、偵測極限和定量極限的測定，結果如 Table. 4。Alizarin、purpurin、luteolin、quercetin 和 morin 的偵測極限 0.3 μM，
emodin 為 0.8 μM，定量極限前五個分析物為 1.0 μM，emodin 2.5 μM。線 性範圍 emodin 在 2.5-100 μM，luteolin 在 1.0-75 μM，alizarin、purpurin、
quercetin 和 morin 皆在 1.0-100 μM 之間。與其他以 CE 分析植物染之文獻
相比 23-27，本實驗在分析物的遷移時間、偵測極限和線性範圍方面都優於
其他文獻之結果。遷移時間之比較如 Table 5，可以發現目前發表的 CE 相 關文獻，同時分析蒽醌類和黃酮類染料的研究並不多，而本研究之遷移時 間在 6 分鐘內完成，其他文獻則需要至少 8.4-20 分鐘才能完成分離，且本 研究在分析物的遷移時間 RSD 值皆小於 0.38 %，也顯示此方法有良好再 現性。
在偵測極限和線性範圍方面，本研究之結果也較其他文獻可以達到更 低的偵測極限，如 Table 1，也有較廣的線性範圍，若應用在真實樣品的分 析上，也許可以有更高的靈敏度和解析度。
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貳、真實樣品之分析
一、茜草根萃取液之分析
經過傳統萃取方法萃取之茜草根萃取液為混濁深紅色，以 10000×g 離 心 10 分鐘後取上清液，以孔徑 0.22 μm 的濾膜過濾，再將濾液用 ddH2O 稀釋至 0.05 倍，即可直接注入樣品槽以最佳化條件進行 CE-UV 之分析，
結果如 Fig. 20(a)，發現有些基質干擾的狀況。茜草根中主要的染料分子為 alizarin 和 purpurin25, 40，在萃取液中添加 0.1 mM 標準品進行訊號之確認，
結果如Fig. 20(b)，發現在遷移時間 3.2 分鐘和 3.8 分鐘訊號強度明顯增強，
可以確認茜草根之萃取液含有 alizarin 和 purpurin。
為確認茜草根萃取液中 alizarin 和 purpurin 之含量，我們以標準添加 法在萃取液中添加一系列濃度之標準品：25 μM、50 μM、75 μM 和 100 μM，
並以峰面積對添加濃度做圖，如 Fig. 21，所得回歸曲線方程式，alizarin 和 purpurin 分別為 y = 437.76x + 6340.4 和 y = 174.35x + 2266.2，再以外插 法推算染料分子的濃度，得茜草根萃取液中含有 alizarin 濃度 289.67 μM 和 purpurin 濃度 259.96 μM，結果整理如 Table 6。
二、茜草染纖維之分析
常見纖維上染料之萃取法為酸水解法，將織品碎片浸泡在 H2O：MeOH：
HCl 體積比 1：1：2 之混和溶液中，經過加熱，抽乾，回溶和過濾等步驟 才能進行分析，14, 18, 20, 23
，其過程繁瑣且耗時。本研究改良 José Luis Vílchez 等人在 2006 提出之萃取方法 21, 24，將經過傳統染色的深紅色四十支棉剪 成小碎片，秤取 0.10 g 浸泡於一系列濃度之 SDS 溶液中，如 Fig. 12(a)，
並以超音波震盪器震盪 30 分鐘，結果如 Fig. 12(b)，以移液管吸取上層溶 液以 2000×g 離心 2 分鐘，取上清液 200 μL 直接注入樣品槽進行 CE-UV 之分析，發現以 5 mM SDS 萃取可以得到分離效果較好的電泳層析圖，結
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果如 Fig. 22(a)。經過添加標準品確認後，發現在遷移時間 3.4 分鐘出現 alizarin 的訊號，將 Fig. 22(a)中 alizarin 訊號之積分面積對照檢量線，發現 經過此萃取步驟所得之萃取液含有 alizarin 20.4 μM。
在 Fig. 21(a)中也可以發現由茜草染纖維所得之萃取液層析圖之基線 相較於茜草根萃取液之層析圖，較無基質干擾的狀況，我們在纖維萃取液 中添加 25 μM 之 alizarin 以 CE-UV 進行偵測，測得濃度為 46.5 μM，回收 率為 104.99 %，如 Table 6。由此可證明以 5 mM SDS 萃取纖維上染料可 避免基質干擾之情形。
從 Fig. 21 可以發現在遷移時間 4.4 分鐘出現一未知訊號，和茜草根萃 取液之電泳層析圖，以及未經染色之四十支棉布分析結果相比，皆未發現 相對應之訊號，還需要做進一步的確認。
三、薯榔塊莖萃取液之分析
我們將薯榔塊莖切成小塊浸泡在ACN 中以超音波震盪 30 分鐘，將萃 取液離心後取上清液以 ddH2O 稀釋成 0.2 倍，經 CE-UV 分析，結果如 Fig.
23(a)，發現基質干擾十分嚴重，在添加一系列濃度之標準品進行訊號確認 後，發現在遷移時間 9.2 分鐘有 alizarin 之訊號，因此可以推測薯榔塊莖中 亦含有 alizarin，但因為樣品之基質干擾嚴重，將在改善前處理步驟之後進 行 alizarin 的定量。
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Fig. 13. Structures of analytes.
(a) alizarin, (b) purpurin, (c) emodin, (d) quercetin, (e) morin, and (f) luteolin.
(a) (b)
(d) (e)
(c)
(f)
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Table 2. Molecular weight, pKa value of analytes.
Compound Abbreviation Molecular
Weight pKa1 pKa2 pKa3
Alizarin A 240.21 7.5 13.5 -
Purpurin P 256.21 4.7 9.5 -
Emodin E 270.24 5.7 7.9 -
Quercetin Q 338.26 7.3 8.4 -
Morin M 302.24 5.0 8.6 -
Luteolin L 286.24 6.9 8.6 10.3
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200 300 400 500
0.0 0.5 1.0
Absorbance(a.u.)
200 300 400 500
0.0 0.5 1.0
200 300 400 500
0.0 0.5 1.0
Absorbance(a.u.)
200 300 400 500
0.0 0.5 1.0
200 300 400 500
0.0 0.5 1.0
Absorbance(a.u.)
Wavelengh (nm) 200 300 400 500
0.0 0.5 1.0
Wavelength (nm)
Fig. 14. UV-vis spectra of analytes 25 μM in 80% ACN.
(a) alizarin, (b) purpurin, (c) emodin, (d) quercetion, (e) morin, and (f) luteolin in 80 % ACN.
(a) (b)
(c) (d)
(e) (f)
- 43 -
Fig. 15. Effect of different buffer system on analysis.
(a) pH 10.4 phosphate buffer 10 mM (b) pH 8.9 Borax-HCl 20 mM 5% ACN (c) pH 10.2 Boric acid-NaOH 22.5 mM (d) pH 8.9 NH4Cl-NH3 10 mM
(e) pH 9.0 Tris-borate buffer 400 mM 10 % ACN
The applied potential was 20 kV. Detection was performed at 250 nm. Total length and effective length of capillary are 60 cm and 48 cm, repectively.
(A) Alizarin, (E) Emodin, (L) Luteolin, (P) Purpurin, (M) Morin, (Q) Quercetin.
0 2 4 6
- 44 -
Fig. 16. The separating of dye compounds in various pH of 10 mM phosphate buffer.
(a) pH 10.0, (b) pH 10.4, (c) pH 10.7, (d) pH 10.9, and (e) pH 11.0
Separation buffer is 10 mM phosphate buffer. The applied potential was 20 kV.
Detection was performed at 250 nm. Total length and effective length of capillary are 60 cm and 48 cm, repectively.
(A) Alizarin, (E) Emodin, (L) Luteolin, (P) Purpurin, (M) Morin, (Q) Quercetin.
2 4 6
- 45 -
Fig. 17. Effect of concentration of phosphate buffer on separating dye compounds. (a) 5 mM, (b) 10 mM, (c) 15 mM, and (d) 20 mM.
Separation buffer is phosphate buffer (pH 10.4). The applied potential was 20 kV.
Detection was performed at 250 nm. Total length and effective length of capillary are 60 cm and 48 cm, repectively.
(A) Alizarin, (E) Emodin, (L) Luteolin, (P) Purpurin, (M) Morin, (Q) Quercetin.
0
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0% 2.50% 5% 7.50% 10% 12.50%
3 4 5 6
7 Alizarin
Emodin Luteolin Purpurin Morin Quercetin
Migration time
ACN
Fig. 18. Effect of percentage of ACN in 10 mM phosphate buffer on separating dye compounds.
Separation buffer is 10 mM phosphate buffer (pH 10.4). The applied potential was 20 kV. Detection was performed at 250 nm. Total length and effective length of capillary are 60 cm and 48 cm, repectively.
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Fig. 19. Effect of concentration of SDS in 10 mM phosphate buffer on separating analyts. (a) 0 mM, (b) 5 mM, (c) 7.5 mM, (d) 10 mM, and (e) 12.5 mM.
Separation buffer is 10 mM phosphate buffer (pH 10.4). The applied potential was 20 kV. Detection was performed at 250 nm. Total length and effective length of capillary are 60 cm and 48 cm, repectively.
(A) Alizarin, (E) Emodin, (L) Luteolin, (P) Purpurin, (M) Morin, (Q) Quercetin.
0
- 48 -
Table 3. Effect of SDS concentration on resolution* of dye compounds.
SDS conc. [mM] A/L L/E E/P P/M M/Q
0 1.54 1.22 0.87 3.03 1.05 5 1.04 1.3 0.74 3.55 1.01 7.5 1.1 1.38 0.83 3.99 0.88
10 1.58 1.42 0.84 - - 15 2.11 1.35 0.81 - -
*Resolution: resolution between a peak and the previous peak, calculated as 2(tpeak-tprevios)/(widthpeak+widthprvious)
tpeak: migration time of the peak; tprevios: migration time of the previous peak;
width: end time - begin time
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Table 4. LOD, LOQ, Linear Range and R2 of analytes.
Analyte LOD (μM) LOQ (μM) Linear Range (μM) R2
Alizarin 0.3 1.0 1.0-100 0.9957
Emodin 0.8 2.5 2.5-100 0.9939
Luteolin 0.3 1.0 1.0-75 0.9928
Purpurin 0.3 1.0 1.0-100 0.9975
Morin 0.3 1.0 1.0-100 0.9948
Quercetin 0.3 1.0 1.0-100 0.9965
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Table 5. Comparison of migration time of analytes among this work and previous studies.
Alizarin Emodin Luteolin Purpurin Morin Quercetin Ref.
3.4 (0.16)* 3.8 (0.38) 4.1 (0.20) 4.3 (0.26) 5.2 (0.23) 5.4 (0.19) Present
5.3 5.4 - 5.6 - - 23
4.0 - - 5.4 - - 24
5.5 - - 8.4 - - 25
- 20.0 - - - - 27
12.2 11.7 10.0 12.8 12.0 9.2 26
* RSD % (n=3)
- 51 -
Fig. 20. Analysis of madder roots exaction with 10 mM phosphate. (a) 0.05x madder roots exaction, (b) spike 0.1 mM alizarin and purpurin.
Separation buffer is 10 mM phosphate buffer (pH 10.4). The applied potential was 20 kV. Detection was performed at 250 nm. Total length and effective length of capillary are 60 cm and 48 cm, repectively.
(A) Alizarin, (P) Purpurin.
0 10
0 2 4 6 8
0 10
Time (min)
Time (min)