以毛細管電泳偵測天然染料植物及植物 染織品中染料分子之研究

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國立台東大學生命科學研究所 碩士論文

以毛細管電泳偵測天然染料植物及植物 染織品中染料分子之研究

研 究 生： 林以婷 撰

指導教授：胡焯淳 博士

中 華 民 國 九 十 九 年 六 月

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致謝辭

首先感謝指導教授胡焯淳老師給予這個機會，讓我有幸接觸到分析化 學領域的奧妙，謝謝老師的栽培和指導，讓我在兩年的研究所生活中成長 了不少。邱泰嘉老師，謝謝您經常關心我的實驗，給我許多寶貴的建議和 想法，也謝謝您擔任我的口考委員，給予我論文上的指正。國立台東專科 學校園藝科的蔡志賢老師，謝謝您抽空前來擔任我的口考委員，以您的學 術專業指出我論文的盲點和需要改進之處，讓我獲益良多。

可以順利完成論文口考，要感謝台灣大學化學系的江政剛學長和謝依 婷同學，還有中山大學化學系的張仲維同學和劉鎮宇同學，謝謝你們提供 我意見，給我加油打氣，讓我不會緊張得不知所措（但還是很緊張）。還 有明樺和其他 100 級的學弟妹，你們真是幫了大忙，謝謝你們讓我的口考 可以順利的進行。

兩年的時間很快，彷彿前幾天還懵懵懂懂在接受于鈊學長指導的基礎

訓練，在實驗室和 98 級的淨容、文虔、鎮宇、還有于菁嘻笑的場景還歷

歷在目。雖然回憶如此美好，但現在的我已經要踏入人生另外一個階段，

帶著大家的期望和祝福，我有更多的勇氣和信心去面對未來的挑戰！

每天窩在科學館二樓的實驗室，看著大家來來去去，和大家聊天吃飯，

都是非常開心的事情。非常感謝林于鈊學長和蔡郁嫻學姊的教導和關心，

讓我可以快速的了解實驗室的一切事物，但與你們相處的時間實在太短了，

好可惜!98 級的鎮宇、文虔、淨容、于菁、孟涵、家綸、碧雲，謝謝你們 對我這個一開始什麼都不懂的學姐那麼的幫忙，讓我可以好好的管理實驗 室，祝你們的研究之路和教師之路都一切順利！99 級盈源、斌哲、華生、

瑀辰、玫菁、婉琪、思涵，謝謝你們這兩年來的陪伴和支持，你們真是太 厲害了，全部都推甄上研究所，以後要更努力的做研究唷！100 級的明樺、

珈吟、建華、志翔、思媛、郁佳、鳳榆、峙寰、湘蓉、明輝、紹華、佳倚

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（也太多人了！），感謝你們為實驗室帶來新的活力，接下來實驗室就靠 你們了！檢驗中心的助理-慧雯學姊和靜慧，謝謝你們常陪我聊天，聽我抱 怨，還有幫我很多忙，以後還請你們多多指教！

特別感謝台灣大學化學系的張煥宗老師，感謝您讓我在 97 年暑假期間 到您的實驗室學習。奈米生物實驗室的黃銘鋒學長，謝謝你兩個月的細心 指導。邱泰嘉老師、于鈊學長、政剛學長，謝謝你們每天中午陪我吃學生 餐廳，並給與我實驗上的建議。玟岑學姊、姿羽、依婷、瑜婷、瑞成、家 瑩、雪怡、子恩，與你們相處十分愉快，謝謝你們讓我兩個月的台北生活 留下無限歡樂的美好回憶。

生命科學研究所的魏百祿老師、彭仁君老師、黃祥恩老師、李俊霖老 師，謝謝你們在課業上還有專業領域的指導。同學們，博詠、慧婷、欣諭、

怡欣、洋斌，祝福大家畢業後可以順利高就，加油唷！還有系辦兩大美女 惠嵐和嘉謙，謝謝你們的在行政業務上的幫忙，還有幫我加油打氣。

高中和大學的好姊妹們，悅廉、純嘉、季芃、雅璇、子婷，還有最親 愛的學弟昶瑋，謝謝你們的關心和支持，讓我在台東一點都不覺得孤單。

我親愛的爸媽，感謝你們的養育之恩，謝謝你們容忍我這個老是不在 家的女兒，並且一直支持我，鼓勵我，謝謝！

林以婷 2010. 06. 26

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以毛細管電泳偵測天然染料植物及植物染織品中染料分子之研究

國 立 台 東 大 學 生 命 科 學 研 究 所

摘 要

本研究開發利用毛細管區帶電泳（Capillary Zone Electrophoresis，

CZE）配合紫外光吸收偵測器分析傳統染料植物茜草（Rubia tinctorum）

及薯榔（Dioscorea cirrhosa Lour）中染料分子與原住民傳統植物染成 品之方法。實驗中比較不同緩衝溶液系統對分析物分離之影響，包含 phosphate，Tris-borate，HCl-Borax，NaOH-Boric acid 及 NH

Cl-NH

， 也針對緩衝溶液之 pH 值，濃度，ACN 添加比例及 SDS 濃度進行條 件探討。最佳化的實驗條件是使用 10 mM phosphate buffer pH 10.4 緩 衝溶液，紫外光吸收偵測波長設定在 250 nm，分離電壓為 20 kV。本 實驗可在 6 分鐘內分離並偵測六種染料分子：茜草素（alizarin），大 黃素（emodin），木犀草素（luteolin），紫草素（purpurin），檞皮素

（quercetin）和桑色素（morin） 。偵測極限為 0.3－0.8 μM（S/N=3），

線性範圍在 1－100 μM 之間。本研究所開發之最佳分離條件可應用

在傳統染料植物－茜草和薯榔－及植物染織品中染料成分之分析。茜

草染依傳統方法萃取和染色，薯榔塊莖以超音波震盪進行萃取。茜草

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根和薯榔塊莖之萃取液經離心後取上清液，過濾並稀釋至適當濃度即

可進行毛細管電泳分析。植物染織品之處理方法為剪成小片浸泡在 5

mM SDS 水溶液中，以超音波震盪進行萃取，離心後取上清液即可進 行毛細管電泳分析。實驗結果顯示，在茜草根萃取液中可測得茜草素 和紫草素，含量分別為 289.7 μM 和 260.0 μM，在茜草染纖維中發現 含有茜草素 20.4 μM。

關 鍵 詞 ： 毛 細 管 電 泳 、 植 物 染 、 茜 草 、 薯 榔 。

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Identification of dye compounds in natural red dyestuffs and fabrics with capillary zone electrophoresis.

Yi-Ting Lin

Abstract

In this study, capillary zone electrophoresis with UV detection method was developed for identification of dye compounds in natural dyestuff, Rubia tinctorum, Dioscorea cirrhosa Lour and madder dye fabrics.

Different buffer systems were selected to comparing impact on the separation of analytes, including phosphate, Tris-borate, HCl-Borax, NaOH-Boric acid and NH

Cl-NH

, also the pH value and concentration of buffer solution, ACN percentage and SDS concentration in the buffer are also discussed. Optimal experimental separation buffer are 10 mM phosphate buffer (pH 10.4). Separation was carried out by applying a 20 kV voltage at the injection end, and detection was performed at 250 nm.

Six dye compounds- alizarin, emodin, luteolin, purpurin, quercetin and morin- can be separated within 6 minutes. Detection limits are in the range of 0.3-0.8 μM (S / N = 3), and linear ranges are between 1-100 μM.

Dried madder roots were extracted with traditional method, and so were

the madder dye fabrics. Ultrasonic extraction was used to extract the dye

compounds in D. cirrhosa tubers. Extract supernatant of dyestuffs were

diluted to the appropriate concentration after centrifugation and filtration,

then the sample could be injected to capillary electrophoresis. Small

pieces of madder dye fabrics were immersed in SDS aqueous solution,

ultrasonic extraction for 30 minutes, the supernatant after centrifugation

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could be carried out by capillary electrophoresis. Contents of alizarin and purpurin in madder roots are 289.7 μM and 260.0 μM, respectively. The madder dyed fibers found in alizarin are 20.4 μM.

Keywords: Capillary electrophoresis, natural dyes, Rubia tinctorum,

Dioscorea cirrhosa

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目 錄

摘 要... i 

Abstract ... iii 

目 錄... v 

表目錄... vi 

圖目錄... vi 

第一章 前言 ... - 1 - 

壹、毛細管電泳之概述 ... - 1 - 

一、毛細管電泳之發展 ... - 1 - 

二、毛細管電泳理論 ... - 2 - 

三、毛細管電泳分離模式 ... - 6 - 

貳、天然染之簡介 ... - 9 - 

一、茜草之簡介 ... - 10 - 

二、薯榔之簡介 ... - 11 - 

参、文獻回顧 ... - 14 - 

肆、研究目的 ... - 24 - 

第二章 材料與方法 ... - 25 - 

壹、藥品 ... - 25 - 

貳、儀器 ... - 25 - 

参、毛細管電泳實驗流程 ... - 26 - 

肆、真實樣品之製備 ... - 26 - 

第三章 實驗結果 ... - 34 - 

壹、條件探討 ... - 34 - 

一、紫外光偵測波長 ... - 34 - 

二、電泳條件的探討 ... - 34 - 

三、偵測極限和定量極限 ... - 37 - 

貳、真實樣品之分析 ... - 38 - 

一、茜草根萃取液之分析 ... - 38 - 

二、茜草染纖維之分析 ... - 38 - 

三、薯榔塊莖萃取液之分析 ... - 39 - 

第四章 結論 ... - 56 - 

第五章 參考文獻 ... - 57 - 

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表目錄

Table 1. The analysis conditions collected from previous studies. ... - 18 - 

Table 2. Molecular weight, pKa value of analytes. ... - 41 - 

Table 3. Effect of SDS concentration on resolution of dye compounds. ... - 48 - 

Table 4. LOD, LOQ, Linear Range and R² of analytes. ... - 49 - 

Table 5. Comparison of migration time of analytes among this work and previous studies. ... - 50 - 

Table 6. Concentration of dye compounds in madder roots and madder dye thread. - 54 - 

圖目錄

Fig. 2. Development of the electroosmotic flow. ... - 5 - 

Fig. 3. Separation mechanism of capillary zone electrophoresis (CZE). ... - 6 - 

Fig. 4. Separation machenism of Micellar Electrokinetic Chromatography (MEKC). ... - 7 - 

Fig. 5. Madder roots. ... - 13 - 

Fig. 6. Tuber of Dioscorea cirrhosa L.. ... - 13 - 

Fig. 7. Scheme of CE operation. ... - 28 - 

Fig. 9. Madder roots extraction. ... - 30 - 

Fig. 10. Scheme of madder dye. ... - 31 - 

Fig. 11. Fabric (a) before and (b) after madder dye. ... - 32 - 

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Fig. 12. Madder dye cotton immersed in SDS solution. ... - 33 - 

Fig. 13. Structures of analytes... - 40 - 

Fig. 14. UV-vis spectra of analytes 25 μM in 80% ACN. ... - 42 - 

Fig. 15. Effect of different buffer system on analysis. ... - 43 - 

Fig. 16. The separating of dye compounds in various pH of 10 mM phosphate buffer. - 44 -  Fig. 17. Effect of concentration of phosphate buffer ... - 45 - 

Fig. 18. Effect of percentage of ACN ... - 46 - 

Fig. 19. Effect of concentration of SDS in 10 mM phosphate buffer on separating analyts. ... - 47 - 

Fig. 20. Analysis of madder roots exaction... - 51 - 

Fig. 21. Standard addition of madder roots exaction ... - 52 - 

Fig. 22. Analysis of madder dye thread. ... - 53 - 

Fig. 23. Analysis of dye compounds in Dioscorea cirrhosa L. tuber. ... - 55 - 

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第一章 前言

壹、毛細管電泳之概述

一、毛細管電泳之發展

電泳（electrophoresis）是指帶電物質在電場中因受吸引或排斥而產生 的不同速率運動，進而達成分離的目的，Tiselius在1930年發表了利用電泳 分離血清中α-，β-和γ-球蛋白的技術，是電泳技術應用在生化領域的濫觴，

Tiselius也因此在1948年獲得諾貝爾獎。¹

毛細管電泳（Capillary electrophoresis, CE）中，電泳在填充有緩衝溶 液的細毛細管中進行。1967年Hjertén發現在細而長的管子中進行電泳可以 排除焦耳熱對實驗造成的影響，並成功的使用內徑300 μm的毛細管進行電 泳分離。1970年Neuhoff利用內徑450 mm 長度3 cm，填充聚丙烯醯胺

（polyacrylamide）的毛細管分離微量蛋白質。1974年R. Virtanen 利用內 徑200-500 μm的Pyrex毛細管分離並定量Li⁺，Na⁺和K⁺。1979年，Mikkers 等人以200 μm的Teflon毛細管在10分鐘內分離了數種無機（氯化物，氯酸 鹽，硫酸鹽和鉻酸鹽）和有機（己二酸和醋酸鹽）陰離子。Jorgenson等人 以內徑75 μm的毛細管，在30kV的高壓電進行電泳實驗，並提出電滲流的 理論。1988年後期出現商業化的毛細管電泳儀也加速了這樣技術的推廣和 普及程度¹。

毛細管內徑一般在25至75 μm之間，其微小的內徑與毛細管的表面積/

體積比很大，使產生的熱量可以很快的擴散。且毛細管中的高電阻能夠在 使用很高的電場時（100－500 V/cm）時只產生很少的熱量。毛細管電泳 使電泳分離能在高電場下進行，使得分析時間縮短、效率及分離度提高，

且因毛細管中使用水相進行電泳實驗，提供了更多樣化的操作模式，用以

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分離更多種類的樣品。²近年來，關於毛細管電泳應用的發表越來越多，如 分離藥物對掌異構物、分析水中農藥殘留和對綠茶中兒茶素之分析^{3, 4}，應 用領域多元且持續拓展中。

毛細管電泳之儀器裝置如Fig. 1，主要有毛細管、樣品瓶、兩端緩衝溶 液瓶、高壓電源供應器、偵測器與電腦。

Fig. 1. Diagram of a capillary electrophoresis system.

二、毛細管電泳理論

分析物在毛細管中的移動，主要與電泳淌度（eletrophoretic mobility）

和電滲流（electroosmotic flow）有關，以下簡單介紹其原理。

（一）電泳淌度（eletrophoretic mobility）⁵

在一個穩定的電場下，一帶電粒子在填充電解液（electrolytic solution）

的毛細管內的移動受靜電力（electrostatic force, F）的影響，可由下列式 子表示：

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F = q E

其中q為帶電粒子之電荷，E為電場之強度（E = V / L_tot，V為毛細管所 通電壓，Ltot為毛細管總長度）。

然而，靜電力受摩擦力（frictional force, F’）影響，根據Stock's law，

球形粒子所受到的摩擦力如下列式子表示：

F’ = 6 π η r ν

其中

η

ν

當速度不變時，表示靜電力與摩擦力相等，因此合併式子（1）和（2）

可以得到：

q E = 6 π η r ν

帶電粒子在毛細管中的遷移速度可以表示成：

ν

μ

其中

μ

μ

=

因此，影響電泳淌度的因子有帶電粒子的大小和電荷，電解液的黏度 和濃度。

（二）電滲流（electroosmotic flow）^{4, 5}

除 了 帶 電 粒 子 的 移 動 ， 另 一 影 響 電 泳 分 離 的 重 要 因 素 是 電 滲 流

（electroosmotic flow, EOF），電滲流是毛細管內壁表面電荷因電場施加 所引起毛細管內緩衝溶液的整體流動。毛細管表面的SiOH基團，如Fig. 2(a)，

經活化後形成SiO^-，如Fig. 2(b)，管壁因此帶有過多的負電荷，電解液中的

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正電離子因此被吸引，如Fig. 2(c)，並在毛細管內由管壁表面往中心方向 形成電雙層（electric double layer）的分布，靠近管壁表面為緻密層（Stern layer） ， 電 解 液 正 電 荷 受 管 壁 SiO^-的 吸 引 排 列 緊 密 ， 靠 近 中 心 為 擴 散 層

（diffuse layer），正電荷的數量隨著遠離管壁的距離成指數趨勢下降。因 為電雙層與靠近的溶液之間的電荷差異形成一個電位差，稱為zeta電位（ζ），

施加電壓後，組成擴散層的離子會由正極往負極移動，並帶動所有的溶液 向負極移動，形成電滲流，如Fig. 2(d)。

電滲流的速度（veo）可表示成：

ν

其中ε為電解液之介電常數，η為電解液之黏度。

由 上 式 可 知 電 滲 流 與zeta電位大小有關，而zeta電位取決於毛細管表 面電荷與緩衝溶液的離子強度，表面電荷量又受pH值控制，所以電滲流會 因為溶液的pH值而影響大小。

電滲流與一般壓力進行的分析技術的最大差別，是電滲流由靠近管壁 的液體帶動流動，不會因液體與管壁摩擦而形成壓力差，造成層流，使得 樣品波峰變寬。

電滲流的另一優點是可以使所有離子往同一方向移動，無論所帶電荷 為何。在毛細管內壁帶負電的情況下，電滲流是由正極往負極移動，帶正 電荷的物質在電場下的移動方向與電滲流相同，其電泳速度是電泳淌度加 上電滲流，所以會最快，不帶電的物質會隨著電滲流流出，帶負電的物質 在電場下移動方向與電滲流相反，所以最慢被流出。

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Fig. 2. Development of the electroosmotic flow.

(a)The fused silica capillary inner surface.

(b) Excess negative charge on the fused silica surface.

(c) The cations accumulating near the surface.

(d) Cations drag the bulk flow towards the cathode with them creating EOF.

(a) (b)

(c) (d)

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三、毛細管電泳分離模式

（一）毛細管區帶電泳 （Capillary zone electrophoresis, CZE）

毛細管區帶電泳是最基本的分離模式，在毛細管中注入緩衝溶液，讓 樣品隨著電滲流往負極移動，因樣品本身的電荷性質、所帶電荷數、以及 質量差異而形成不同的區塊分離，如Fig. 3，帶正電荷越多的樣品遷移時間 會越短，帶負電荷越多的樣品遷移時間會越長，而不帶電的中性樣品就隨

著電滲流被分離出來。因此，可藉由調控緩衝溶液的pH值和濃度達到分離

效果的優化。

Fig. 3. Separation mechanism of capillary zone electrophoresis (CZE).

（二）微胞電動層析（Micellar Electrokinetic Chromatography, MEKC）

此分離模式是電泳中應用最廣的方式之ㄧ，1984年由Terabe於提出。

此技術的優點是可同時分離帶電與中性物質。微胞電動層析的原理是在緩 衝溶液中加入介面活性劑，當介面活性劑的濃度達到臨界微胞濃度時，單

一的界面活性劑會聚集形成微胞，此即為偽固定相，而MEKC的分離機制

是基於分析物與微胞的分配作用不同，使原本只能與電滲流共遷移的中性 物質，可被微胞帶動而有遷移率而達成分離，如Fig. 4，此方法可視為電泳

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技術與層析技術兩者的結合。在電泳過程中，當加入的陰離子界面活性劑 形成微胞時，因微胞帶負電，與電滲流方向相反，但是在電滲流速度大於 微胞的移動速度之狀況下，帶動微胞緩緩的往負極移動，當分析物表面與 界面活性劑鍵結越多，使得表面親水基與毛細管壁做用力變大，使得遷移 時間拉長。所以親水物質遷移時間愈快，疏水物質遷移時間愈長。而分析 物與微胞之間做用情形主要取決於兩者之間的靜電吸引力、偶極-偶極作用 力（dipole-dipole interactions）等，這又與使用的界面活性劑種類與分析 物結構有密切關係。

Fig. 4. Separation machenism of Micellar Electrokinetic Chromatography (MEKC).

界面活性劑通常具有親水官能基（Hydrophilic head group） 與疏水官 能基（Hydrophobic tail group）。在低濃度時，界面活性劑會使溶液的表 面張力降低，但隨著濃度增加，其物理性質如（導電度、表面張力）會因 為形成微胞而改變。微胞乃是由數十或數百個界面活性劑分子聚集而成的。

在水溶液中，界面活性劑的親水基部份朝外與水分子水合，並且將疏水基 包圍起來以減少水分子與疏水基的接觸面積。此時親水基之間的斥力與烷 鏈之間的凡得瓦爾力會使得微胞呈現球狀結構。但會隨著濃度與溫度改變

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可能為短柵狀、球狀、棒狀或層狀。在溶液中界面活性劑形成微胞的濃度 為臨界微胞濃度（critical micelle concentration, CMC），在高於CMC值的 時候微胞與單體是共存的，而溫度、鹽類、有機溶劑都會影響微胞的形成。

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貳、天然染之簡介

天然染（natural dye）已經存在超過四千年，在人類歷史中佔有重要 地位，非洲土著用樹皮將皮膚染成紅色，東南亞地區的佛教徒用波羅蜜木 材染出象徵神聖的黃色袈裟，台灣原住民使用植物染染出多彩多姿的傳統 服飾。在化學合成染料出現的一個半世紀以前，織品的顏色和作畫的顏料 都是由天然染料萃取得到，人們利用染料裝飾服裝和住所，特別的染料往 往價值連城，穿著漂亮顏色的服裝就代表著權利和財富，例如從骨螺腺體 萃取的紫色染料，價錢甚至比黃金還貴，染出來的紫色服裝只有牧師才可 以穿著。天然染最常見的是植物染，植物的根、莖、葉、花、果和種子都 可以做為染材萃取染料進行染色；另外幾種特定動物也是染料來源，有昆 蟲和貝類動物，如胭脂蟲和骨螺；而礦物如朱砂也是歷史悠久的染料。^{6, 7} 天然染料依顏色可區分為（1）藍紫色染料；（2）紅色染料；（3）黃色 染料和（4）咖啡色和黑色染料 ⁸。藍紫色染料主要來源為木藍（Indigofera

tinctoria）

及其衍生物，故可萃取出藍紫色染料。紅色染料主要來自胭脂蟲

（Dactylopius coccus Costa）、茜草（Rubia tinctorum L.）和蘇木（Caesalpinia

sappan L.）

tinctoria L.）

等，故可萃取出黃色染料。咖啡色和黑色染料主要來自富含單寧（tannin）

和沒食子酸（gallic acid）的橡樹癭（Oak galls）。

自十九世紀以來，合成化學染挾帶著高效率和高堅牢度，在數十年之 間，迅速將有千年歷史的植物染取代，植物染工藝漸漸式微。但近幾年，

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人們開始思考歷史文化的重要性和善用自然資源的問題，植物染重新獲得 科學界和社會大眾的重視。出土的珍貴織品類歷史文物需要適當的保存和 必要的復原，分析其中所含有的染料分子成為推測當時使用染料植物之依 據，染料植物和當時生活環境的文化涵義也是歷史學家有興趣的部分，因 此，近期天然染料的分析和研究已越來越受到注目。若能將此分析方法應 用在台灣原住民傳統服飾之分析，搭配歷史考據或耆老之回憶，對於原住 民文化之重建必能有所幫助。

一、茜草之簡介

茜草，英文名稱 madder，常見的兩個種分別為 Rubia cordifolia 和 Rubia

tinctorum，屬植物界（Plantae）被子植物門（Magnoliophyta）雙子葉植物

綱（Magnoliopsida）龍膽目（Gentianales）茜草科（Rubiaceae）茜草屬（Rubia）。 常見的俗名如下：別名：紅根仔草、紅藤仔草、過山龍、金草、蒨草、染 緋草、茹藘和茅蒐。在歐洲地中海地區，亞洲日本、印度和中國都有分布，

在台灣全境低海拔之山野或闊葉林皆有分布。茜草為多年生蔓性草本植物，

根皮中含色素，老根色素尤多。地上之莖部被倒鉤刺，莖節隨處生根。莖 為方形，細長蔓生，有縱稜，開花期間多分枝。葉四至五枚輪生，葉柄長 約 1 至 4 公分，葉片心形或狹卵形，長約 3 至 5 公分，基部為心形，先端 尖銳，全緣，葉脈四至六條，葉柄與葉片都有細逆刺。花序為圓錐形聚繖 花序，腋生或頂生，花冠乳黃色，花瓣五裂。果實呈細圓球狀，初為綠色，

熟時轉黑，夏秋開花。⁹

茜草之用途可分為藥用和染色。藥理方面有止咳和祛痰作用，小鼠口 服茜草根煎劑有明顯的止咳祛痰作用；對平滑肌的作用，茜草根的水提取 物對離體豚鼠子宮有興奮作用。產婦口服也有加強子宮的收縮作用。茜草 根溫浸液能擴張蛙足蹼膜血管並稍能收縮家兔的血液凝固時間，推測有輕 度的止血作用。茜草根在試管內對金黃色葡萄球菌與白色葡萄球菌，卡他

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球菌，肺炎球菌及流感桿菌均有一定的抑制作用。根含多種羥基蒽醌衍生 物，如茜草素（alizarin）、異茜草素（purpuroxanthin）、羥基茜草素（purpurin）、 偽羥基茜草素（pseudopurpurin）、茜草酸(munjistin)、茜草甙(rubia,

ruberythric acid)、大黃素甲醚，茜草萘酸甙Ⅰ及Ⅱ等。¹⁰

茜草根，如 Fig. 5，為人類最早使用的紅色染料之一，古文獻中早有 記述，《詩經》有「縞衣茹藘，聊可與娛」、「東門之墠茹藘在阪」等句。《漢

官儀》記有「染園出卮茜，供染御服」之句。《史記‧貨殖傳》中亦有「千

畝卮茜，其人與千戶侯等」的記載，可見當時栽植茜草可享有厚利，茜草 染紅在周朝以前即受到相當的重視。茜草的種類，主要有東洋茜、西洋茜、

印度茜三種，其染出的色相並不一樣。在中國使用的茜草是屬於東洋茜，

染出的色相是偏橙色的，紅色的感覺較低。西洋茜另外也因為其葉片有六 片的緣故，也被稱之為六葉茜，東洋茜則是四葉，因此也被稱之為四葉茜。

印度茜是三的其中染出來紅色最強的一種，染出來的顏色較為暗沉。¹¹

二、薯榔之簡介

薯榔，學名 Dioscorea cirrhosa Lour，為植物界（Plantae）木蘭植物門

（Magnoliophyta）百合綱（Liliopsida）百合目（Liliales）薯蕷科

（Dioscoreaceae）薯蕷屬（Dioscorea）植物。常見的俗名如下：藷榔、薯 峎、赭魁、儲糧、餘糧、裡白葉薯榔、裡白葉薯蕷、薯莨、朱砂蓮、紅薯 峎、紅孩兒、紅藥子等。薯榔原產於中國南方、越南、馬來半島、東印度 群島、琉球等地。目前在台灣全境低海拔山區、山麓、荒野或疏林內皆有 分佈 ¹¹。

薯榔為多年生宿根性纏繞藤本植物，全株光滑無毛，莖桿圓柱形，質 地堅韌，基部長有堅硬的棘刺，上部多分枝，常攀附在喬木或灌木叢中。

葉互生或對生，光滑革質，長橢圓形至長披針形，正面綠色，背面粉綠，

葉長 4 至 10 公分，寬 2 至 5 公分。花單性，數多形小，雄花序圓錐狀，

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雌花序穗狀，腋生，蒴果三翅狀，徑約 2.5 至 3 公分，種子扁平而藏在翅 內，春夏開花，夏秋結果。塊莖肥大，長者數節，多鬚根，表面粗糙且常 有疣狀突起，其肉質呈棕紅或紫紅色。多年生塊莖基部長裸出地面，量多 者可挖出二、三十斤以上，為優良的紅褐色染料。

在藥理活性的研究方面發現薯榔具有止血、使子宮興奮和抗菌活性 ^10,

12。家兔灌服薯榔煎劑 1.5 g/kg，其出血時間與凝血時間較正常分別縮短 48 %及 36.5 %，均顯著縮短，故薯榔萃取液有類似血小板的促凝作用。薯 莨酊劑或煎劑對離體小鼠子宮有明顯的興奮作用，張力，振幅及頻率均有 增強，萃取液則未顯現作用。酊劑或煎劑在試管內對金黃色葡萄菌球有中 等度抑菌作用，對甲型副傷寒桿菌與宋氏痢疾桿菌有較弱的抗菌作用。抗 菌作用可能與其中所含鞣質有關。

薯榔塊莖主要含有縮合性丹寧（condensed tannins）及配醣體

（glycosides），已分離得到多酚配醣體如 3，4 二羥基苯乙醇葡萄糖甙

（3,4-dihydroxyphenethyl alcohol glucoside），根皮酚葡萄糖甙

（phloroglucinol glucosicde）等。¹³

薯榔塊莖，如 Fig. 6，含有豐富的單寧酸與膠質，染後的顏色多呈赭 紅色與漆黑色，過去閩粵生產的香雲紗（又稱莨紗）與拷綢（又稱莨綢或 黑膠綢），即是以薯榔汁液塗染，再以含鐵質的烏泥媒染處理單面，使絲 綢品呈現一面赭紅、一面漆黑的高級夏季絲織品。除漢民族大量使用之外，

台灣本島各族原住民也多以薯榔染苧麻紗線，染成的紗線多呈紅褐色，然 後再和青、黃、黑等色線交織成各式各樣的服飾。過去薯榔除了用來染衣 服及紗線外，也大量地用來染棉麻編製的魚網，這主要是因薯榔富含單寧 酸及膠質，染色之後能加強纖維韌性，並防止海水腐蝕魚網纖維之故。^{6, 11}

- 13 -

Fig. 5. Madder roots. ¹¹

Fig. 6. Tuber of Dioscorea cirrhosa L..

- 14 -

参、文獻回顧

回顧目前的文獻，關於天然染料的分析並不多，如 Table 1，大部份文 獻使用高效液相層析儀（High performance liquid chromatography, HPLC）

進行分離，偵測器常見的有紫外光/可見光偵測器（UV/Vis Detector）和光 二極體陣列式偵測器（Photodiode array detector, DAD），以及電噴灑質譜 儀（Electrospray ionization-mass spectrometry, ESI-MS）。

2003 年，Maciej Jarosz 等人利用 RPLC-DAD/ESI-MS 分析胭脂蟲萃取 物和茜草根萃取物所含蒽醌類染料：胭脂紅、紫膠紅酸（laccaic acid）和 茜草素 ¹⁴。實驗發現 ESI-MS 在靈敏度方面較 DAD 佳，偵測極限（Limit of Detection，LOD）可達 30-90 ng/mL；ESI-MS 也有較好的選擇性，可以清 楚的分離在 DAD 下解析度不好的胭脂紅和紫膠紅酸。

2006 年，Izabella Surowiec 等人以 HPLC-DAD 分析十七世紀蘇格蘭 織品，以了解其中的染料成分和染料的生物來源 ¹⁵。實驗偵測到蒽醌類、

黃酮類和靛藍等 11 種染料分子。發現以 MeOH：DMF（v/v）1：1 溶液萃 取織品纖維中的染料分子，與原本普遍使用 HCl 酸水解萃取法相比，可以 得到較高的萃取效率。在 16-17 世紀的咖啡色和黃色樣品中接偵測到茜草 素和羥基茜草素（purpurin），在淺咖啡色樣品中偵測到木犀草素、芹菜 素和鞣花酸（ellagic acid）。

2006年，Maciej Jarosz等人以RPLC-DAD/ ESI-MS分離並偵測接骨木

（Sambucus nigra）之果實、洋蘇木（Haematoxylon Campechianum）之心 材和菘藍（Isatis tinctoria）萃取液之染料分子。UV/Vis偵測波長設在280 nm，

ESI-MS使用正/負離子模式和選擇離子模式（SIM）法¹⁶。在22分鐘內可偵 測到分析物沒食子酸、韖花酸、蘇木精（hematoxylin）、氧化蘇木精

（hematein）、靛藍、靛玉紅、花青素（cyanidin-3-glucoside）、木犀草素、

芹菜素、漆黃素（fisetin）、檞皮素（quercetin）、楊梅素（myricetin）、

- 15 -

山奈素（kempferol）和盧丁（rutin）。

2006 年，Ioannis Karapanagiotis 和 Violaine de Villemereuil 使用 HPLC-UV/Vis 分離並偵測骨螺類腺體中的靛藍染料 ¹⁷。可偵測到靛藍、靛 玉紅、6-bromoindigotin、6-bromoindirubin、6’-bromoindirubin、

6,6’-dibromoindigotin 和 6,6’-dibromoindirubin，並使用 LC-MS-APCI 進行 方法之確認。發現不同種類骨螺所含有靛藍染料之種類和含量皆不相同，

其中以 Hexaplex trunculus 所含靛藍類染料種類最多。

2007 年，Marek Trojanowicz 等人使用 HPLC-ESI-MS 分析古代織品上 的紅色的蒽醌類染料和黃色的黃酮類染料及其降解產物羥基苯甲酸

（hydroxybenzoic acids）¹⁸。並利用不同的質譜分析法尋找最佳化的條件。

實驗發現在 HPLC 的流動相中加入甲酸，以選擇離子模式在負離子模式下 可以有較佳選擇性和靈敏度。實驗 LOD 為 0.5-32 ng/mL，較 DAD 偵測器

靈敏。在 19 世紀壁毯纖維萃取物偵測到檞皮素、茜草素、羥基茜草素、

異茜草素和二羥基苯甲酸。

2007 年，Peng Zou 和 Hwee Ling Koh 使用 LC-ESI MS 偵測菘藍

（Isatis indigotica）根部和葉部所含有靛苷、靛紅、靛玉紅和靛藍 ¹⁹。靛 苷、靛紅、靛玉紅在負離子模式下可以得到較好的訊號，而靛藍在正離子 模式下可以得到較好的訊號。透過串連質譜（tandem mass，MS/MS）可以

得到分析物之子離子片段，更能確認分析物的訊號。實驗之 LOD 為：靛

苷 0.004 ng，靛紅 0.01 ng，靛玉紅 0.04 ng，靛藍 0.03 ng。在各地蒐集到 的菘藍樣品中，以來自中國四川的菘藍所偵測到靛藍類染料含量最高。

2008 年，Y. Chryssoulakis 等人以 HPLC-UV 分析 15-19 世紀後拜佔庭 時期牧師服飾上之天然染料，可偵測到茜草素、羥基茜草素、胭脂紅酸、

紫膠紅酸、木犀草素、芹菜素、漆黃素、大豆異黃酮（genistein）、硫黄 菊素（sulfuretin）、鞣花酸、靛藍和靛玉紅，實驗 LOD 2-29 ng/mL²⁰。並 推測其染料來源可能為：茜草、胭脂蟲、金雀花、黃櫨（Cotinus coggygria

- 16 -

Scop.）和菘藍等植物。

2006 年， Rosario Blanc 等人在以 HPLC-DAD 分析西班牙古籍上的 天然染料，可以偵測到的染料有胭脂紅酸、靛藍、番紅花酸（crocetin）、

藤黃酸（gambogic acid）、茜草素和羥基茜草素 ²¹。使用的流洗條件是移 動相 A：40 mM SDS, 10 mM phosphate (pH 2.3)-0.1% TFA，移動相 B：乙 腈（acetonitrile, ACN）梯度流洗。在分析歷史地圖開發了新的採樣技巧，

使用沾有濃度 0.1 M 之界面活性劑 SDS（sodium dodecyl sulphate, SDS）溶 液的刷子輕刷古籍表面，即可將染料轉移至刷子上達到萃取的目的。在黃 色/綠色/咖啡色樣品上偵測到藤黃酸和番紅花酸，在紅色/橘色樣品偵測到 胭脂紅酸，在藍色樣品偵測到靛藍。

2005 年，Mohammad Talebi 等人以微波輔助萃取茜草根內的茜草素和 羥基茜草素，以反應曲面法（central composite design）探討影響萃取效率 主要因子（溫度、溶劑組成、溶劑體積及萃取時間）的最佳化條件，並以 HPLC-UV 偵測所萃取的染料分子 ²²。實驗在 20 分鐘內可得到傳統萃取法 140%的萃取效率，在六分鐘內就可以偵測到 alizarin 和 purpurin。

以毛細管電泳（Capillary electrophoresis, CE）分離天然染料的文獻整 理如下：

2003 年，Maciej Jarosz 等人在以 CE-DAD/ESI-MS 分析古代畫家作畫 時常使用的天然染料：胭脂蟲萃取物和茜草根萃取物，實驗結果偵測到胭 脂紅、紫膠紅和茜草素 ²³。實驗 LOD 0.15-0.52 μg/mL，在古文物的重建和 保存的相關研究上很有幫助。

2007 年，José Luis Vilchez 等人利用 CE-DAD 分析西班牙帝王時期的 地圖等古籍上的染料成分 ²⁴。使用 40 mM 的四硼酸鹽作緩衝溶液，分離電 壓 30 kV，偵測波長 196、232、252、300 和 365 nm。可在 13.1 分鐘內分 離偵測茜草素、羥基茜草素、靛藍、胭脂紅酸、番紅花酸和藤黃酸。以沾 有 0.1 M SDS 溶液的刷子萃取真實樣品西班牙古籍，在黃色/綠色/咖啡色/

- 17 -

紅色樣品上偵測到藤黃酸，在紅色樣品偵測到胭脂紅酸，在綠色樣品上偵 測到靛藍。

2007 年，M.I. Maguregui 等人使用微胞電動力毛細管層析法偵測古代 畫作上之紅色染料和深紅色顏料 ²⁵。在 20 mM borax 緩衝溶液中添加界面 活性劑SDS 使分析物形成微胞達到較好的分離效果。緩衝溶液中添加 10 % ACN 也可以得到較佳的解析度。實驗偵測到茜草素、羥基茜草素、醌茜

（quinizarin）、胭脂紅酸、紫膠酸、巴西蘇木素（brazilin）、紫檀素（santalin）

和血竭素（dracorhodin），LOD 最低可達 0.1 ppm（茜草素）。在主教博 物館（Diocesan Museum）所收藏的畫作上偵測到茜草素、醌茜和羥基茜 草素的訊號。

2008 年，Izabella Surowiec 等人以 CE-DAD/ESI-MS 分析沒石子酸、

胭脂蟲酸、桑色素、檞皮素、木犀草素、芹菜素、鼠李素（rhamnetin）、

茜草素、羥基茜草素、異茜草素和大黃素等天然染料，以 40 mM 醋酸銨作 緩衝溶液可以得到最好的分離效果，在質譜分析以選擇離子法（Extrated ion）確認分子訊號 ²⁶。

2008 年，Hanqi Zhang 等人以 MEKC 比較不同的萃取方法萃取中藥材 大黃（Rheum palmatum L.）中的蒽醌類種類及含量 ²⁷。在 15 mM 硼酸鈉 緩衝溶液中添加界面活性劑SDS，可以在 25 分鐘內分離出大黃素（emodin）、

蘆薈大黃素（aloe-emodin）和大黃酸（rhein）。結果發現以霧化萃取法所 得萃取效率最高，相較於其他萃取法如迴流萃取、浸漬提取和超音波萃取 也有設備簡單和節省時間等特點。

以上文獻之分析物，真實樣品，樣品前處理步驟，分析方法，以及實 驗所得偵測極限和線性範圍均整理於 Table 1。

- 18 -

Table 1. The analysis conditions collected from previous studies.

Analytes Real Sample Preparation Condition Detector Linear

range LOD Ref.

alizarin, carminic acid, cochineal, lac dye, laccaic acid, madder lake and purpurin

lac dye, cochineal, and madder

5 mg of cochineal / lac dye powder was dissolved in MeOH, sonicted for 20 min.

0.6 mg of madder lake was dissolved in 500 μL of a 10% (v/v) aqueous solution of HCl, the mixture was heated to 65℃ for 5 min and extracted into 1 mL of n-amyl alcohol then drawn off from the aqueous phase, then the solution was diluted with methanol.

MeOH:water (80 :20) with 0.2% of acetic acid.

RPLC-DAD (280 nm) RPLC-ESI/MS

2.0-60.0 [μg/mL]

0.18-1.71 [μg/mL]

14

carminic acid, cochineal dye, emodin, lac dye, laccaic acid, madder lake and purpurin

cochineal, lac dye, and madder

0.5 mg of the cochineal and lac-dye powder were dissolved in 2.5 mL of MeOH with sonication for about 20 min.

0.5 mg of madder lake was dissolved in 500 μL of 10% HCl, the mixture was heated at 65

°C for 5min and extracted with 1 ml of n-amyl alcohol and then separated from the aqueous phase and diluted with MeOH.

CE-UV

5 mM sodium phosphate, pH 8.5

CE-MS

20 mM ammonium carbonate, pH 9.0

CE/UV/ESI-MS 1.0–20.0 [μg/mL]

0.12-0.58 [μg/mL]

23

alizarin, purpurin roots of Rubia tinctorum L. and Galium

Reflux Ultrasonic

microwave-assisted extraction

Mobile phase: acidic

Methanol: KH2PO4, (50 mM, pH 3)=71:29 (v/v)

LC-UV (250 nm)

5-100 [μg/mL]

0.15-0.48 ²²

- 19 - humifusum M.

Bieb.

ellagic acid, flavonoids, indigotin, and plant-derived anthraquinones

historical Scottish textiles

Sample hydrolysed with acidic MeOH in 100

℃

Dried and reconstituted with 1:1 (v/v) MeOH:DMF

Dried after filtered and reconstituted with 1:1 (v/v) MeOH:DMF

Solvent gradient

A: 20% methanol; B: pure methanol; C: phosphoric acid

LC-DAD (250- 750 nm)

- - ¹⁵

alizarin, carminic acid, crocetin, gambogic

acid,indigotin, and purpurin

historical maps and drawings

brush imbibed with 0.1M SDS and applying directly onto the map

extracts were transferred to 0.1M SDS sonicated for 45 min and centrifuged at 2000 rpm for 5 min

Mobile phase: (A) 40mM SDS–10mM phosphate buffer (pH 2.3)–0.1% TFA (B) acetonitrile

LC-DAD (190-950 nm)

- - ²¹

apigenin,

cyanidin-3-glucoside, cyanidin-3,5-diglucoside, ellagic acid, fisetin, gallic acid, hematoxylin, hematein, indigotin, indirubin,

kempferol, luteolin, myricetin, quercetin, rutin

blue–red Italian tapestry

extracted with a mixture of DMSO and HCl in a water-bath at 80 °C. then diluted with MeOH.

Mobile phase: (A)methanol (B)0.15% (v/v) aqueous solution of formic acid

HPLC-UV-MS (280, 445, 520 and 600 nm)

- - ¹⁶

- 20 - indigotin, indirubin,

6-bromoindigotin, 6’-bromoindirubin, 6-bromoindirubin, 6,6’-dibromoindigotin, 6,6’-dibromoindirubin

Hexaplex trunculus, Murex brandaris, and Thais

haemastoma

the hypobranchial glands of mollusks were separated from the body, exposed to direct sunlight for 6 h.

cut in small pieces and extracted for 1 h with DMF at 80°C.

Filtered and the solvent

was removed under reduced pressure (using a high vacuum pump) at 40°C.

Gradient elution: (A) 0.1%

TFA (B) ACN with 0.1%

TFA

LC-UV 14–0.8 [μg/mL]

0.02 [μg/mL]

17

2,4-dihydroxybenzoic acid, 3,4-dihydroxybenzoic acid (97%), 4-hydroxybenzoic acid, alizarin, anthragallo, apigenin, carminic acid, emodin, gallic acid, hystazarin, luteolin, morin, purpurin, quercetin, quinizarin, rhamnetin and xanthopurpurin

wool fiber from the 4th–3rd century BC Orange thread from the 19th century Aubusson tapestry

HCl/MeOH/H2O (2:1:1 v/v) solution on a boiling water bath for 10 min dried under the nitrogen stream and redissolved in 5 mL 50%

MeOH.

extracted with 20 lL of DMSO and heated in a water bath for 5 min,

Mobile phase: (A) 0.3% v/v formic acid in water (B)ACN

LC-MS - 0.5-32 [ng/mL]

18

alizarin, carminic acid, crocetin, gambogic acid, indigotin and purpurin

Historical drawings and maps from Spain

brush imbibed with 0.1M SDS and applying directly onto the map

extracts were transferred to 0.1M SDS sonicated for 45 min and centrifuged at 2000 rpm for 5 min

running buffer:40 mM tetraborate of pH 9.25 applied voltage: 30 kV

CE-UV ( 232, 252, 300, 356, 196 nm)

- - ²⁴

- 21 - indican, indigotin, indirubin

and isatin

Isatis indigotica 0.2 -0.5 g powder of roots or leaves was extracted with THF by ultrasonication.

Evaporated in vacuo and the residue reconstituted in acetonitrile

Mobile phase: (A) water (B) ACN

LC-MS 10.8-200 0 [ng/mL]

0.004-0.03 ng

19

alizarin, purpurin, quinizarin, carminic acid, laccaic acid, brazilwood, dragon’s blood, sandalwood

17th century non-attributed oil paint

Paint samples and sulphuric acid (1 M) was added into hydrolysis tubes was kept under mechanical shaking. Then the colorants were extracted with 6mL of dichloromethane in a three-step LLE extraction procedure.

20mM borax (pH 9) with 20mM SDS and 10%

acetonitrile

CE-UV 254 nm

0.5-110 [mg/L]

0.1-4.0 [mg/L]

25

carminic acid, ellagic acid, laccaic acid A, fisetin, sulfuretin, luteolin, apigenin, genistein, alizarin, indigotin, purpurin, indirubin

historical

garments from the Holy Mountain of Athos

Samples were immersed in 400 mL

of H2O: MeOH: 37% HCl (1:1:2, v/v/v) at 100 ℃ and dried under nitrogen flow.

The residues were dissolved in DMF

Gradient elution: (A) 0.1%

TFA in H2O. (B) 0.1% TFA in ACN.

LC-DAD 1.3-20.0 [μg/mL]

0.002- 0.029 [μg/mL]

20

emodin, aloe-emodin and rhein

Rheum palmatum L.

0.05 g powders in 15 mL 80% ethanol under ultrasonic nebulization extraction 30 min.

the extract was filtrated and evaporated to dry, and redissolved by alcohol.

15 mM sodium borate, 30 mM SDS and 10% ethanol (pH 9.52).

CE-UV 1.5-100 [μg/mL]

- ²⁷

alizarin, apigenin glucoside, chrysoeriol glucoside, indigotin, indirubin, purpurin, rubiadin, etc.

textile finds from Chärchän, dated at about 1000 BC

Dyes were extracted from woolen threads using formic acid/methanol (5:95, v/v)

The extracts were dried and suspended in 50 μL 50% MeOH, then the solution was

Gradient elution: (A)water, (B)acetonitrile, and (C) 1%

formic acid

LC-DAD-MS - - ²⁸

- 22 - centrifuged and upper 30 mL was removed for HPLC-DAD-MS analysis

18 anthraquinone compounds wool thread dyed with madder (Rubia tinctorum) and Our Lady’s bedstraw (Galium verum)

1 mg of dyed thread in 200 mL of HCl/MeOH/H2O (2:1:1,v/v) vacuum dried and then solubilised in 50 mL MeOH/H2O 1/1 mix and filtered

Mobile phase: (A) H2O and (B) MeCN

HPLC-ESI/MS - - ²⁹

alizarin, apigenin, brasilein, carminic acid, eosin Y, genistein, hansa yellow, indigocarmin, kaempferol, purpurin, quercetin, quercitrin, rhamnetin, etc.

Historical threads dated from 1th C.

to 1915

0.1–0.5mg for historical samples suspended in 1:1 (v/v) mixtureof ACN and MeOH and ultrasonicated.

20 mL of aqueous HF (c. 4M) is added.

The solution was vortexed, and left at room temperature 30 min

Mobile phase: (A) MeOH, (B) 5% ACN (C) 0.1% TFA in 50% MeOH, (D) ACN.

LC-DAD - - ³⁰

apigenin, apigenin-glucoside, brassidin,

kaempferol-glucoside-rhamno- side, luteolin,

luteolin-glucoside

Reseda luteola L.

from Portugal

powdered R. luteola was extracted with 15 mL of methanol/water (8:2) by sonication at room temperature for 10 min.

The extracts were filtered (Minisart RC15 0.45 mm, Sartorius), diluted (1/15) with methanol/water (8:2).

Gradient elution: (A) methanol and(solvent B) water with 0.1% acetic acid

LC-DAD-MS 6.4-600 [μg/mL]

0.2-1.4 [μg/mL]

31

alizarin, galiosin, lucidin, lucidin primeveroside,

Rubia tinctorum roots

ultrasound-assisted extraction: 18 min, 36 ℃ and 37/63 MeOH/H2O (v/v).

Binary elution: (A) acetonitrile and (B) 0.01%

LC-DAD - - ³²

- 23 - pseudopurpurin, purpurin,

rubiadin, ruberythric acid, rubiadin primeveroside, xanthopurpurin

TFA in water

alizarin, apigenin, carminic acid, emodin, gallic acid, luteolin, morin, purpurin, quercetin, rhamnetin and xanthopurpurin

- - pH 9.5, 40 mM ammonium

acetate, 40% ACN

CE-DAD-MS - - ²⁶

- 24 -

肆、研究目的

歷史文物的鑑定和保存一直是考古科學界重視的議題，若能分析歷史 文物之組成與成份，必能對當時生活環境以及文化發展有所了解，而毛細 管電泳具有需要樣品量很少、樣品前處理簡單以及分析快速等特性，適合 應用於珍貴且可取得量稀少之古文物之分析。很適合應用於分析歷史文物 上的天然染料。

天然染在台灣地區已存在很長一段時間，尤其是原住民五顏六色的傳 統服飾多出自於天然染，關於民間常使用染色用植物的成分分析文獻並不 多，尤其是目前關於薯榔成分分析的研究並不多。茜草和薯榔都是台灣常 見的紅色染料植物，關於茜草已知含有茜草素和紫草素等染料分子，故推 測薯榔可能含有茜草素和紫草素等紅色染料。

本研究擬利用毛細管電泳搭配紫外光光譜偵測器分析以下幾種天然染 料：茜草素、紫草素、大黃素、胭脂蟲酸、桑色素、檞皮素、木犀草素、

芹菜素和靛藍。探討緩衝溶液 pH 值和濃度、界面活性劑濃度對染料分離

之影響，並開發最佳分離條件，並應用在茜草及薯榔的染料成分分析，也 期望能應用於原住民傳統服飾染料成分之鑑定。

- 25 -

第二章 材料與方法

壹、藥品

實驗所使用的染料標準品茜草素（alizarin）、紫草素（purpurin）和桑 色素（morin）購自 Fluka 公司，大黃素（emodin）、胭脂紅酸（carminic acid）、

檞皮素（quercetin）、芹菜素（apigenin）和木犀草素（luteolin）購自 Sigma 公司，靛藍（indigotin）購自 Aldrich 公司。標準品以 80 %乙腈配製成濃 度 1×10^-3 M 之母液（stock solution），避光保存於 4 ℃下備用。實驗時，

依當天所需要濃度以 ddH2O 稀釋之。

磷酸（H3PO4）、Tris（NH2C(CH2OH)3）和氫氧化銨（NH4OH）購自 J. T. Baker 公司，磷酸二氫鈉（NaH2PO4．2H2O）、磷酸三鈉（Na3PO4．12H2O）、 SDS 和 HCl 購自 Sigma-Aldrich 公司，磷酸氫二鈉（Na2HPO4）、硼酸（H3BO3）、

四硼酸鈉（Na2B4O7．10H2O）、氫氧化鈉（NaOH）和氯化銨（NH4Cl）購 自 Riedel-de Haëh 公司，以去離子水配製成實驗所需之緩衝溶液。

分析級之乙腈（Acetonitrile）、甲醇（Methanol）購自 Merck 公司。去 離子水（電阻值

≥

貳、儀器

pH meter 製造商 HORIBA 型號 D-24 超音波振盪器 製造商 RANSON 型號 1510 超高速離心機 製造商 SIGMA 型號 SIGMA 3K30 微量離心機 製造商 EDWARDS 型號 QS 7011

紫外可見光吸收儀 製造商 Perkin Elmer 型號 Lambda EZ 201 螢光光譜儀 製造商 HITACHI 型號 F-4500

毛細管電泳系統 製造商 Prince Technologies 型號 PrinCE 250

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紫外光偵測器 製造商 Bischoff 型號 Lambda 1010 控制軟體 WPrince 32 Bit

數據擷取軟體 SISC 32 2.0 中文版

毛細管內徑 75 μm，外徑 375 μm，長度 60 cm，有效長度 48 cm

参、毛細管電泳實驗流程

新的毛細管以濃度 0.5 N 之 NaOH 充滿，靜置 8-12 小時後將 NaOH 以去離子水（ddH2O）置換備用。

每日進行實驗之前，先以 0.5 N NaOH 壓力 1000 psi 沖提毛細管 10 分 鐘，ddH2O 1000 psi 沖提 10 分鐘，再以緩衝溶液 1000 psi 沖提 10 分鐘，

即可開始進行實驗。每次電泳實驗先以 0.5 N NaOH 1000 psi 沖洗毛細管 1 分鐘，如 Fig. 7(a)，緩衝溶液 1000 psi 沖提 5 分鐘，如 Fig. 7(b)，樣品以 100 psi 進樣 0.1 分鐘，如 Fig. 7(c)，再以分離電壓 20 kV 進行電泳，如 Fig.

7(d)，電泳完畢以緩衝溶液 1000 psi 1 分鐘將毛細管中殘餘樣品推出。每 天實驗結束，以 0.5 N NaOH 1000 psi 沖提毛細管 5 分鐘，ddH2O 1000 psi 5 分鐘，讓毛細管充滿 ddH2O，即可關機。

肆、真實樣品之製備

（一）茜草萃取液

茜草根之萃取係依照民間傳統方法，流程如 Fig.8，秤取 50.0 g 市售乾 燥印度茜草根，與 0.8 公升的水一同放入不鏽鋼鍋中以瓦斯爐進行加熱，

如 Fig. 11，煮沸後以小火持續加熱 30 分鐘，如 Fig. 9(a)。將第一次萃取液 以紗布簡單過濾後，將茜草根留於鍋內，再加入 0.8 公升水進行第二次萃 取，一共萃取三次，將三次濾液集中即為茜草染液。靜置於塑膠瓶中，如 Fig. 9(b)，待隔日進行染色。

分析茜草根萃取液時，將萃取液以 10000×g 離心 10 分鐘，取上清液

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以孔徑 0.22 μm 濾膜過濾，再以 ddH2O 稀釋成 0.05 倍即可以 CE-UV 偵 測，並以標準添加法定量茜草素中茜草素（alizarin）和紫草素（purpurin）

之含量。

（二）茜草染織品

茜草染織品之製備係依照民間植物染傳統方法，流程如 Fig.10 所示：

秤取四十支棉布如 Fig.11(a)，並在事前泡水使纖維軟化，陰乾後將棉布放

入染液中一起加熱，沸騰後以小火持續加熱使色素可以附著在纖維上，30

分鐘後關火，待冷卻後取出棉布，將多餘的染液清洗乾淨並陰乾，即完成 染色，成品如 Fig.11(b)。

織品上染料之萃取及分析，將上述茜草染成品以剪刀剪成小片，秤取 0.1g 浸泡於一系列濃度之 10 mL SDS 水溶液中：1 mM，5 mM，10 mM 和 50 mM，以超音波震盪進行染料分子之萃取 30 分鐘，將萃取液以移液管吸 取 1 mL，以 2000×g 離心 1 分鐘後取上清液進行 CE-UV 之分析，並對照檢 量線推算纖維含有的茜草素含量。

（三）薯榔塊莖染料之萃取

野生薯榔之塊莖，如 Fig. 6，採集自台東山區，將塊莖以菜刀和剪刀 分解成小塊，秤取 0.1 g 浸泡於 100% ACN 中，以超音波震盪器進行萃取 30 分鐘，將萃取液離心後取上清液進行 CE-UV 之分析。

- 28 -

Fig. 7. Scheme of CE operation.

(a) Flushing capillary with 0.5 N NaOH.

(b) Condition capillary with separation buffer.

(c) Sample injection.

(d) High voltage was applied to separate analytes.

(a) (b)

(d) (c)

- 29 -

Fig. 8. Scheme of madder roots extraction.

Weigh proper amount of dry madder roots.

Put madder roots and water into the stainless steel pot

Heat to boiling and last 30 min.

Gather filtered extract

and stand over night

before dyeing.

- 30 -

Fig. 9. Madder roots extraction.

(a) Madder roots were heating in boiling water.

(b) Madder roots extract was gathered in the bottle.

(a)

(b)

- 31 -

Fig. 10. Scheme of madder dye.

Weigh proper amount of cotton.

Put cotton and madder root extract into the stainless steel pot.

Heat to boiling and last 30 min.

Wash and let

the cotton dried

in the shade.

- 32 -

Fig. 11. Fabric (a) before and (b) after madder dye.

(a)

(b)

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Fig. 12. Madder dye cotton immersed in SDS solution.

(a) Cotton before and (b) after ultrasonic extraction (1) 50 mM, (2) 10 mM, (3) 5 mM, (4) 1 mM SDS.

(a)

(b)

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第三章 實驗結果

壹、條件探討

回顧分析植物染料的文獻中，較常出現的染料分子主要為蒽醌類還有 黃酮類兩種化合物，例如茜草素和桑色素。本實驗選擇數種經常出現且已 商業化可購得的標準品進行分析研究，包含三種蒽醌類：茜草素（alizarin），

大黃素（emodin）和紫草素（purpurin），三種黃酮類：木犀草素（luteolin），

檞皮素（quercetin）和桑色素（morin）。分析物之結構如 Fig. 13。根據文 獻，分析物之 pKa 值多集中在 pH 8-9 之間，^33-39如 Table 2，可以做為選 擇分析條件的參考。

一、紫外光偵測波長

文獻中使用的紫外光偵測波長大多設在250-280 nm 之間14, 20, 22, 25, 27

， 為了確認最適合的偵測波長，我們將標準品以 80 % ACN 配製成 25 μM 偵 測各個分析物的吸收光譜圖，所得結果如 Fig. 14。其中蒽醌類化合物在 200-500 nm 間皆有吸收峰，如 Fig. 14(a)-(c)，黃酮類化合物在 200-400 間 有吸收峰，如 Fig. 14(d)-(f)，六個分析物的最高吸收波長集中在 200-280 nm 之間，為避免在短波長會有干擾，最後選擇 250 nm 作為偵測波長。

二、電泳條件的探討

（一）緩衝溶液系統之選擇

文獻中使用 CE-UV 分析植物染料的例子並不多 14, 24, 25, 27，其中所使 用的緩衝溶液系統有磷酸鈉，硼酸鈉，pH 值在 8.5-9.5 之間，因此本研究 比較了五種緩衝溶液系統：phosphate, Tris-borate, HCl-borax, NaOH-boric acid 及 NH4Cl-NH3，比較分析在不同緩衝系統下之分離效果，並針對五種

緩衝溶液的 pH 值，濃度，有機溶劑之添加，界面活性劑之添加等條件進

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行最佳化的探討後進行比較，選擇對分析物之分離有最佳效果的緩衝溶液 系統，結果如 Fig. 15。

在 Tris-borate 的系統下，以濃度 0.4 M Tris-borate 在 pH 9.0 添加 10%

ACN 進行分離，如 Fig. 15(e)，整個電泳過程需要 13 分鐘才能將 6 個分析 物分離，且 alizarin 和 emodin 無法達到基線分離，而且 morin 的訊號有嚴 重趨前（fornting）和變寬（broading）的現象，推測是因為在 pH 9.0 的情 況下，borate 的含量不足以和分析物形成錯和物。

以 20 mM HCl-borax 在 pH 8.9 添加 5% ACN 進行分離，結果如 Fig.

15(b)，雖然在 6 分鐘內可以完成六種分析物之分離，但是 purpurin 有嚴重 變寬的情況，且訊號強度微弱，峰高只有 alizarin 的 7%，這在定量上可能 會有線性範圍狹窄的問題。

以 22.5 mM NaOH-boric acid 在 pH 10.2 對分離物進行分離，如 Fig.

15(c)，遷移時間在 5 分鐘內完成，但是 luteolin 和 purpurin 訊號重疊，無 法分離，從電泳層析圖也可以發現其他染料分子之訊號解析度也很差，添 加不同濃度的界面活性劑 SDS 或是 ACN 並沒有明顯改善。

以 10 mM NH4Cl-NH3在 pH 8.9 進行分離，如 Fig. 15(d)，遷移時間在 4 分鐘內結束，但是除了 quercetin 之外，其他染料分子皆無法完全分離，

添加 SDS 或 ACN 也無明顯改善。

以 10 mM phosphate buffer pH 10.4 在 6 分鐘內可以將分析物完全分 離，如 Fig. 15(a)，在不添加界面活性劑和 ACN 的情況下，半高寬解析度 都可以達到 1.46 以上。所以磷酸緩衝溶液在以上 5 種緩衝系統中有最佳的 分離效果。且分離時間較其他以CE-UV 為分析方法之文獻快速14, 24, 25, 27

， 是有潛力的分析方法。因此以下的實驗選用磷酸緩衝溶液進行最佳化條件 之探討。

（二）緩衝溶液 pH 值和濃度

本研究使用 Na2HPO4和 Na3PO4配製成 pH 值 10.0，10.4，10.7，10.9

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和 11.0 的緩衝溶液，在濃度 10 mM 下進行條件探討，如 Fig. 16，發現在 鹼性條件下基線穩定，且有較好的分離效果，因 pH 值大於 10.7 會造成電 流值過高（＞100 μA），為避免焦耳熱影響分離，最後選擇以 Na2HPO4和 Na3PO4配製成 pH 10.4 做為分離條件。

在緩衝溶液的濃度方面，因為磷酸鹽本身導電度較強，所以高濃度下 易引起過高的電流（＞100 μA），所以本研究比較 5 mM，10 mM，15 mM 和 20 mM phosphate 對分析物分離之影響，如 Fig. 17，發現濃度在 5 mM 時，緩衝能力不足，無法將分析物完全分離，濃度在 15 mM 時，luteolin 和 purpurin 的訊號遷移時間會重疊，所以選擇 10 mM phosphate 為最佳條 件，此條件下電流值約 50 μA。

（三）有機溶劑和界面活性劑之添加

文獻中針對數種有有機溶劑添加物進行探討：1-propanol、2-pronanol、

EtOH、MeOH 和 ACN^{24, 25, 27}，考量樣品配置在 80%之 ACN 溶液中，本研 究嘗試在10 mM phosphate pH 10.4 的緩衝溶液中添加 0%、2.5%、5%、7.5%、

10%和 12.5% 體積比的 ACN，比較分離效果，發現添加有機溶劑使遷移 時間變慢，如 Fig. 18，可能是因為有機溶劑的添加改變溶液的黏滯性

（viscosity），造成 EOF 速度降低，所以在往後的實驗中不添加有機溶劑。

界面活性劑 SDS 在 CE 中是常見的添加劑，在分析植物染料的文獻 中也被使用過，^{25, 27}本實驗探討在phosphate 緩衝溶液中添加 0 mM，5 mM，

7.5 mM，10 mM 和 15 mM 之 SDS，結果如 Fig. 19，發現隨著 SDS 濃度加 高，分析物之遷移時間往前，但是 quercetin 和 morin 的解析度反而變差，

如Table. 3。因此本研究在植物染料的分析不添加界面活性劑，以 10 mM 磷 酸緩衝溶液，pH 值 10.4 為最佳分離條件。

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三、偵測極限和定量極限

以最佳化條件，10 mM phosphate，pH 10.4，分離電壓 20 kV，偵測波 長設定在 250 nm，進行線性範圍、偵測極限和定量極限的測定，結果如 Table. 4。Alizarin、purpurin、luteolin、quercetin 和 morin 的偵測極限 0.3 μM，

emodin 為 0.8 μM，定量極限前五個分析物為 1.0 μM，emodin 2.5 μM。線 性範圍 emodin 在 2.5-100 μM，luteolin 在 1.0-75 μM，alizarin、purpurin、

quercetin 和 morin 皆在 1.0-100 μM 之間。與其他以 CE 分析植物染之文獻

相比 ^23-27，本實驗在分析物的遷移時間、偵測極限和線性範圍方面都優於

其他文獻之結果。遷移時間之比較如 Table 5，可以發現目前發表的 CE 相 關文獻，同時分析蒽醌類和黃酮類染料的研究並不多，而本研究之遷移時 間在 6 分鐘內完成，其他文獻則需要至少 8.4-20 分鐘才能完成分離，且本 研究在分析物的遷移時間 RSD 值皆小於 0.38 %，也顯示此方法有良好再 現性。

在偵測極限和線性範圍方面，本研究之結果也較其他文獻可以達到更 低的偵測極限，如 Table 1，也有較廣的線性範圍，若應用在真實樣品的分 析上，也許可以有更高的靈敏度和解析度。

- 38 -

貳、真實樣品之分析

一、茜草根萃取液之分析

經過傳統萃取方法萃取之茜草根萃取液為混濁深紅色，以 10000×g 離 心 10 分鐘後取上清液，以孔徑 0.22 μm 的濾膜過濾，再將濾液用 ddH2O 稀釋至 0.05 倍，即可直接注入樣品槽以最佳化條件進行 CE-UV 之分析，

結果如 Fig. 20(a)，發現有些基質干擾的狀況。茜草根中主要的染料分子為 alizarin 和 purpurin^{25, 40}，在萃取液中添加 0.1 mM 標準品進行訊號之確認，

結果如Fig. 20(b)，發現在遷移時間 3.2 分鐘和 3.8 分鐘訊號強度明顯增強，

可以確認茜草根之萃取液含有 alizarin 和 purpurin。

為確認茜草根萃取液中 alizarin 和 purpurin 之含量，我們以標準添加 法在萃取液中添加一系列濃度之標準品：25 μM、50 μM、75 μM 和 100 μM，

並以峰面積對添加濃度做圖，如 Fig. 21，所得回歸曲線方程式，alizarin 和 purpurin 分別為 y = 437.76x + 6340.4 和 y = 174.35x + 2266.2，再以外插 法推算染料分子的濃度，得茜草根萃取液中含有 alizarin 濃度 289.67 μM 和 purpurin 濃度 259.96 μM，結果整理如 Table 6。

二、茜草染纖維之分析

常見纖維上染料之萃取法為酸水解法，將織品碎片浸泡在 H2O：MeOH：

HCl 體積比 1：1：2 之混和溶液中，經過加熱，抽乾，回溶和過濾等步驟 才能進行分析，14, 18, 20, 23

，其過程繁瑣且耗時。本研究改良 José Luis Vílchez 等人在 2006 提出之萃取方法 ^{21, 24}，將經過傳統染色的深紅色四十支棉剪 成小碎片，秤取 0.10 g 浸泡於一系列濃度之 SDS 溶液中，如 Fig. 12(a)，

並以超音波震盪器震盪 30 分鐘，結果如 Fig. 12(b)，以移液管吸取上層溶 液以 2000×g 離心 2 分鐘，取上清液 200 μL 直接注入樣品槽進行 CE-UV 之分析，發現以 5 mM SDS 萃取可以得到分離效果較好的電泳層析圖，結

- 39 -

果如 Fig. 22(a)。經過添加標準品確認後，發現在遷移時間 3.4 分鐘出現 alizarin 的訊號，將 Fig. 22(a)中 alizarin 訊號之積分面積對照檢量線，發現 經過此萃取步驟所得之萃取液含有 alizarin 20.4 μM。

在 Fig. 21(a)中也可以發現由茜草染纖維所得之萃取液層析圖之基線 相較於茜草根萃取液之層析圖，較無基質干擾的狀況，我們在纖維萃取液 中添加 25 μM 之 alizarin 以 CE-UV 進行偵測，測得濃度為 46.5 μM，回收 率為 104.99 %，如 Table 6。由此可證明以 5 mM SDS 萃取纖維上染料可 避免基質干擾之情形。

從 Fig. 21 可以發現在遷移時間 4.4 分鐘出現一未知訊號，和茜草根萃 取液之電泳層析圖，以及未經染色之四十支棉布分析結果相比，皆未發現 相對應之訊號，還需要做進一步的確認。

三、薯榔塊莖萃取液之分析

我們將薯榔塊莖切成小塊浸泡在ACN 中以超音波震盪 30 分鐘，將萃 取液離心後取上清液以 ddH2O 稀釋成 0.2 倍，經 CE-UV 分析，結果如 Fig.

23(a)，發現基質干擾十分嚴重，在添加一系列濃度之標準品進行訊號確認 後，發現在遷移時間 9.2 分鐘有 alizarin 之訊號，因此可以推測薯榔塊莖中 亦含有 alizarin，但因為樣品之基質干擾嚴重，將在改善前處理步驟之後進 行 alizarin 的定量。

- 40 -

O

O

OH

OH

O

O

OH

OH

OH

O

O

OH

CH₃ OH

O

OH

OH

OH OH

HO

O

O

OH

OH HO

O HO

O

OH

OH

OH HO

O

Fig. 13. Structures of analytes.

(a) alizarin, (b) purpurin, (c) emodin, (d) quercetin, (e) morin, and (f) luteolin.

(a) (b)

(d) (e)

(c)

(f)

- 41 -

Table 2. Molecular weight, pKa value of analytes.

Compound Abbreviation Molecular

Weight pKa1 pKa2 pKa3

Alizarin A 240.21 7.5 13.5 -

Purpurin P 256.21 4.7 9.5 -

Emodin E 270.24 5.7 7.9 -

Quercetin Q 338.26 7.3 8.4 -

Morin M 302.24 5.0 8.6 -

Luteolin L 286.24 6.9 8.6 10.3

- 42 -

200 300 400 500

0.0 0.5 1.0

Absorbance(a.u.)

200 300 400 500

0.0 0.5 1.0

200 300 400 500

0.0 0.5 1.0

Absorbance(a.u.)

200 300 400 500

0.0 0.5 1.0

200 300 400 500

0.0 0.5 1.0

Absorbance(a.u.)

Wavelengh (nm) ^{200 300 400 500}

0.0 0.5 1.0

Wavelength (nm)

Fig. 14. UV-vis spectra of analytes 25 μM in 80% ACN.

(a) alizarin, (b) purpurin, (c) emodin, (d) quercetion, (e) morin, and (f) luteolin in 80 % ACN.

(a) (b)

(c) (d)

(e) (f)