本研究之實驗設計圖如圖所示。依照先前研究，重複次數為 19、20 的 CGG 序列具有兩種的髮夾型結構: 對齊髮夾結構 (Blunt-end hairpin) 與露出單組 CGG 的髮夾型結構 (Single-repeat overhang hairpin) [18][23]。將供體螢光基團修 飾在 5’端上，而受體螢光基團則修飾在副序列上，如圖 35 所示。這兩種不同的 髮夾型結構會讓兩個供體以及受體距離差大約三個核苷酸的距離。因此，對齊的 髮夾型結構預期會比與露出單組 CGG 的髮夾型結構得到較高的 EFRET值，先前 的研究也指出此 CGG 序列可能形成鳥嘌呤四聚體[21]，若有此結構的產生則會 讓供體與受體距離更遠。因此可以藉由 EFRET的差異，分辨出不同的構型。
圖 35、單分子實驗設計圖。
41
3-2 結構鑑定
首先以重複次數為 4 到 10、12、16、19、20 的序列進行實驗，實驗條件為 150mM 之鉀離子的環境下。實驗結果如圖 36 所示。實驗結果顯示，不論重複次 數為奇數或是偶數，皆能夠得到相當高的 EFRET值；偶數次數的序列，所得到的
E
FRET值為 0.82；奇數的序列所得到的 EFRET則為 0.8。即使序列的重複次數增加，這種現象仍然不會有所改變，並且在所有重覆中都能夠發現在較低的 EFRET區域，
有些許的分佈。在這幾條序列中，較特別的序列為(CGG)4，除了在 0.82 有分佈 外，在 0.66 上也有些許的分佈。由於其 EFRET較低，因此有可能為鳥嘌呤四聚體 的結構。
圖 36、不同重複次數的 CGG 序列之直方圖，在鉀離子條件為 150mM 時，所呈現出來得直方圖。
由圖可以看出，大部分的分子接呈現很高 EFRET(約在 0.8-0.82 之間)。
42
3-3 髮夾型結構鑑定
CGG 序列的主要構型，其主要的 EFRET值分別落在 0.8 以及 0.82。依照先前 文獻顯示，d(CGG)20可能形成對齊型的髮夾型結構[18]；d(CGG)19則是形成露出 一個核苷酸的髮夾型結構[23]。依照 Usdin 等人的預測，我們使用 d(CTG)4、與 d(CTG)4T1 作為模擬其構型的序列。先前研究中指出，d(CTG)4 可以形成對齊型 的髮夾型結構；d(CTG)4T1中的胸腺嘧啶 (Thymine, T) 並不會參與前面 CTG 重 複序列的折疊，因此會形成露出一個核苷酸之髮夾型結構[27]。將這兩條序列在 相同離子濃度的條件下進行實驗，實驗結果如圖 37 所示。實驗結果顯示，單數 組的序列與 d(CTG)4T1之 EFRET值相同；偶數組之 EFRET值與 d(CTG)4的 EFRET結 果較相近，僅相差 0.02，這樣的結果也與先前的預測相符合[18][23]。由於 T1(CTG)4以及(CTG)4T1兩條序列所造成的 EFRET值相同，因此不能夠分辨出的核 苷酸是位於 3’端或是 5’端。但實際上畫出序列可能形成的構型後，如圖 38 所示，
可以發現若露出的核苷酸是位於5’端時，鹼基對無法進行配對，不能形成髮夾型 的結構。因此可以推斷出，重複次數為奇數的序列，其構型應與(CTG)4T1相同。
43
圖 37、CGG 序列依重複次數不同分別與 d(CTG)4以及 d(CTG)4T1作比較圖。
圖 38、CGG 序列依重複次數所產生結構示意圖。鹼基間有黑線的部分代表能夠配對。(a) 重複次數為偶數時，會形成對齊的髮夾型結構。(b)重複次數為奇數時畫出的兩種可能結構，
類似(CTG)4T1的結構能有較穩定的鹼基配對，而類似 T1(CTG)4的構型的鹼基無法配對。
44
3-4 長時間軌跡圖
分析各序列的直方圖後可以發現，除了主要的構型之外，在較低 EFRET的也 有些許的分佈。為了確認這些少量的事件是否真實存在，可以分析長時間軌跡圖 (3000 frames, 30fps)，如圖 39 所示。從圖中可以發現，在較短序列經由 HMM 擬 合過後，約 90%的分子，其 EFRET值呈現穩定在 0.82 以及 0.8 的位置。隨著重複 次數的增加至 19 次時，開始出現 EFRET跳動的現象，其跳動為 0.8 至 0.72 兩者 間互相轉換。由於 0.72 的 EFRET值較高，並且在鋰離子的條件下，也能夠發現這 種跳動，我們根據先前文獻可知鳥嘌呤四聚體於鋰離子中不易形成[45]，因此可 以推斷 EFRET為 0.72 的結構不為鳥嘌呤四聚體，但可能為不對齊的髮夾型結構。
這種跳動的模式，可能為三核苷酸重複序列的滑動現象，這種形式的滑動也能夠 在 CTG 序列中觀察到[27]。
圖 39、部分 CGG 序列長時間軌跡圖，紅線為 Cy5 的螢光放光強度；綠線為 Cy3 的螢光放光強 度；灰線為計算出來的 EFRET值；與灰線重疊的紅線則為利用 HMM 擬合出的結果。
45
3-5 鳥嘌呤四聚體結構鑑定
為了確認 d(CGG)4中 EFRET為 0.66 的構型是否為鳥嘌呤四聚體，可以利用鳥 嘌呤四聚體的特性。根據先前文獻，這種特殊的二級結構對於離子的種類相當敏 銳。大部分只有在鉀離子存在下，才有可能會形成鳥嘌呤四聚體的結構：相對地，
在離子半徑較小的鋰離子中，則無法形成[45]。利用這點特性，我們置換溶液中 鹽類的條件，來判斷 DNA 構型是否真的為鳥嘌呤四聚體。實驗結果如圖 40 所 示，d(CGG) 4在鉀離子條件下出現 EFRET值接近 0.82 以及 0.66 的兩種結構，而 鋰離子的條件下僅有一個較高的 EFRET值。如前所述，在鋰離子的環境中鳥嘌呤 四聚體結構不易形成，因此我們可從這兩組實驗的比較中，推測 EFRET值為 0.66 的構型，有可能為鳥嘌呤四聚體。為了做更近一步地確認，我們在進行實驗前，
在 DNA 溶液中加入 PDS (pyridostatin)，PDS 可以誘發序列摺疊成鳥嘌呤四聚體 [46]，並且與實驗中的影像緩衝液有良好的相容性，因此可以用於本研究中。
圖 40、d(CGG)4在不同條件下，所得到的直方圖。藍色直方圖為僅含有金 屬離子。粉紅色則為有加入 PDS 的情況。
46
首先在實驗進行時加入 10nM 的 PDS 並維持相同的鉀離子條件，可以發現 d(CGG)4中，較低 EFRET的分佈明顯有增加的趨勢。雖新增的 EFRET分佈峰值位於 0.56，較我們認為的鳥嘌呤四聚體峰值 0.66 稍低，應為 PDS 嵌入在鳥嘌呤四聚 體，而造成其結構些微的改變[47]，其結合方式如圖 41 所示。因此，相較於沒有 小分子纏繞的情況，有 PDS 的鳥嘌呤四聚體構型會被撐開，造成更低的 EFRET值。
將 PDS 的濃度增加到 100nM，d(CGG)4幾乎全部的分佈會集中在 EFRET為 0.56 的狀態；這也顯示，隨著 PDS 濃度的增加，會更容易誘發出鳥嘌呤四聚體結構 的生成。
圖 41、PDS 嵌入於 DNA 序列中的示意圖。圖中的配體 (ligand) 為 PDS。圖中右側的複合體 (complex) 則為兩者結合後的構型[47]。
47
由這幾組實驗的結果，我們可以知道 d(CGG)4中的兩個構型確實為對齊型的 髮夾型結構以及鳥嘌呤四聚體。這兩種構型，也正是先前文獻中所做出的預測。
為了進一步研究其鳥嘌呤四聚體的詳細結構，我們使用(CGGAGG)2 序列 (ca2，
詳見表格 4) 進行實驗。先前的文獻中指出，這條序列的主要構型為平行結構的 鳥嘌呤四聚體[27]，再加上其序列長度與 d(CGG)4相同。因此最能夠模擬 d(CGG)4
的情況。從實驗結果也發現，ca2 的 EFRET為 0.66，與 d(CGG)4相同。為了進一 步確認 ca2 的構型是否與鳥嘌呤四聚體，我們將 ca2 中加入 100nM 的 PDS 進入 影像緩衝溶液中，實驗結果如圖 42 所示，EFRET值也會從原本的 0.66 下降至 0.56。
這樣的結果與 d(CGG)4相同，因此也間接確認 d(CGG)4的另一種構型為鳥嘌呤 四聚體結構。
圖 42、ca2 在鉀離子 150 mM 中以及加入 PDS 的直方圖。
48
49
圖 44、其他重複次數之 CGG 序列，在 100nM 的 PDS 進行實驗所得到的直方圖。
50
51
構型。經由這兩條序列，我們可以知道插入 AGG 的 CGG 序列，能夠產生出兩 種髮夾型結構與鳥嘌呤四聚體。
圖 45、(CGG)3AGG(CGG)5與(CGG)4AGG(CGG)4之實驗結果圖。
52
接著分別將 d(CGG) 19與 d(CGG)27的第九段以及第十四段 CGG 改成 AGG，
形成(CGG)9AGG(CGG)9與(CGG)13AGG(CGG)13 (詳見表格 4)，藉此去模擬重複 序列增長的情況，實驗結果如圖 46 所示。不同於一般的 CGG 序列，在鉀或是鋰 離子的條件下，其 EFRET的分佈皆是相同的。這也代表，此兩種構型很有可能不 為鳥嘌呤四聚體結構。為了做進一步地確認，我們將 PDS 加入這兩條序列之中。
與單純的 CGG 序列相同，加入 100 nM 的 PDS 進入溶液中，並不會有太大的變 化。直到加入的 PDS 變為 100nＭ時，才會出現鳥嘌呤四聚體結構，而且這種構 型所貢獻的 EFRET值大約在 0.1。
從長時間軌跡圖中可以發現，如圖 47 所示，大約 95%的分子，其 EFRET主 要落在 0.82 或是 0.72，而且這兩種構型也會互相轉換。相較於正常的 CGG 序 列，EFRET 的跳動也比正常序列頻繁，此一跳動極有可能是重複序列的滑動現象 [27]。由這些實驗結果得知，插入 AGG 後的序列，其結構的平衡會偏向以露出 一組 CGG 之髮夾型結構。
53
圖 46、(CGG)9AGG(CGG)9與(CGG)13AGG(CGG)13在不同條件下所得到的直方圖。由圖可以看 出，延長序列後，將不容易誘導出鳥嘌呤四聚體結結構。
圖 47、(CGG)9AGG(CGG)與(CGG)13AGG(CGG)13在鉀離子條件下的長時間軌跡圖。
54
將長時間軌跡圖進行 HMM 分析後，並繪製成轉換機率密度圖，如圖 48 所 示。圖中為分析正常的 CGG 序列以及插入 AGG 之 CGG 序列的結果。左圖中可 以看到，插入 AGG 之序列出現兩個主峰，兩者的發生次數也相當多。在右下角 的主峰，起始值為 0.82，終點則是 0.72；另一個主峰則剛好相反，起始值為 0.72 而終點值為 0.82。這樣的分析結果也說明這兩種不同的構型，會彼此間進行互相 轉換。而正常的 CGG 序列也有相同位置的兩主峰，也具有跳動的現象，但是其 跳動事件較少。
圖 48、d(CGG)19與(CGG)9AGG(CGG)9之機率轉換密度圖。X 軸為起始的 EFRET值；Y 軸為變 化後的 EFRET值。
55
3-6.2 插入雙組 AGG 之 CGG 序列
為了模擬在人體中真實的序列，我們將插入 AGG 的次數增多，設計出插入 兩 個 AGG 的 CGG 序 列 ， 分 別 是 (CGG)4AGG(CGG)9AGG(CGG)4 、 (CGG)4AGG(CGG)9AGG(CGG)9、(CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)9，三者有不同的 插入頻率；進行實驗的條件也與先前實驗相同，實驗結果如圖 49 所示。從 EFRET
直方圖可以發現不同的插入次數，EFRET直方圖皆與正常的 CGG 序列有所差異。
一旦插入 AGG 後，會產生出 EFRET較低的構型，並且隨著插入次數增加，比例 會有所提升。
圖 49、插入 AGG 之 CGG 序列與正常 CGG 序列之比較圖。淺藍色直方圖為插入 AGG 的 CGG 在鉀 150mM 下進行實驗所得到的直方圖。淺灰色線條為 d(CGG)9在相同條件下的 EFRET分佈。
深灰色為 d(CGG)19在相同條件下的 EFRET分佈。
56
根據先前 Delaney 團隊的研究成果，(CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)9擁有較 低 EFRET的構型髮夾型結構。為了確認此構型是否為鳥嘌呤四聚體結構，一樣可 以在影像緩衝溶液中加入 PDS 來驗證。實驗結果如圖 50 所示。由實驗結果可以 發現，不論是溶液中不論是有鉀離子或是鋰離子，其 EFRET的分佈都相同的。若 是加入 100nM 的 PDS 進入溶液中，僅僅只有 C4AC9AC4 會明顯多一個分佈出 來，其 EFRET值大約為 0.26。隨著重複次數的增加，所形成鳥嘌呤四聚體的 EFRET
值也會下降。這個數值也與較短的 CGG 序列的結果相同。從實驗結果可以推斷
值也會下降。這個數值也與較短的 CGG 序列的結果相同。從實驗結果可以推斷