利用單分子技術研究與染色體易碎症相關的d(CGG)重複序列及其抑制疾病的變異序列之構型動態學

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(1)國立臺灣師範大學理學院化學系碩士論文 Department of Chemistry College of Science National Taiwan Normal University Master Thesis 利用單分子技術研究與染色體易碎症相關的 d(CGG)重複序列及其抑制疾病的變異序列之構型動態學. Single-Molecule Study on the Conformational Dynamics of d(CGG) Tandem Repeats Associated with Fragile X Syndrome and Their Disease Inhibition Mutations. 沈洋逸 Yang-I Shen 指導教授：李以仁博士 Advisor : I-Ren Lee, Ph.D. 中華民國 107 年 8 月. August 2018.

(2) 致謝時光匆匆，兩年的碩士班時光即將結束。回想當初剛進入實驗室時，總有些不適應。陌生的人、環境。最令我不適應的是實驗室所使用的技術，不過感謝指導教授李以仁老師耐心的教導下，令我可以一步步地學習單分子技術。也感謝老師在我剛進入實驗室時，給予我學習以及人生規劃上的建議。除了李以仁老師的指導外，也要感謝其他有教導過我的老師們。感謝李弘文老師、溫進德老師以及范秀芳老師所提供的學術交流，每次進行學術交流時，總會令我大開眼界，學習到更多關於單分子技術的知識；也感謝他們在實驗上給予的建議及鼓勵。感謝洪偉修老師在書報課上的教導，老師總會提出不同的看法，讓我能以不同的角度去看待相同的問題，讓我有更多的想法。另外，也要感謝實驗室的成員給予我的幫助。感謝子芸、顥頤、建棋在我剛進入實驗室時，教導我實驗上所需要的技術，也感謝他們教導我關於單分子技術的知識。感謝語潔、巧穎在實驗上給幫助；也謝謝語潔常常與我一起研究期刊論文上的各種資訊、討論實驗的條件。他的想法總能夠給予我不一樣的思考方式，讓我學習到許多東西。感謝文昊、堃愷、陳謙平常幫忙我分擔實驗的壓力，以及分享生活上的趣事，令我的實驗室生活更加有趣。最後，感謝我的家人支持我所作的每一個決定，並提供我一個良好的讀書環境，令我在念書時不會因為經濟關係而有所煩惱。也感謝我的女友一起分擔生活上的雜務，使我能夠更專心於課業上。感謝這兩年所經歷過得一切，希望不論未來的我在何處，每當回想起這兩年的時光，能夠獲得更大的動力，突破未來的困難。. i.

(3) 摘要染色體易碎症為一種常見的遺傳性疾病，其發病原因可以歸咎於人體中 FMR1 中 CGG/CCG 三核苷酸重複序列的擴張。在正常人體中，CGG/CCG 的重複次數落在 5 至 44 之間；然而，在病人中，重複次數則會擴大至 200 以上。若 CGG 三核苷酸重複序列在 FMR1 基因中過度的擴張，將會觸發一種不正常的甲基化，稱為過甲基化；當基因過甲基化後，會造成組蛋白去乙醯化。經由這一系列不正常的生物修飾後，就會使 FMR1 基因失效。相較之下，在正常人體中的 CGG/CCG 序列之間會差入 AGG/CCT 序列。插入的頻率大約為 9 至 10 個 CGG 會出現一個 AGG 序列。. 然而 CGG 三核苷酸重複序列的構型以及 AGG 序列會對一般的 CGG 序列所照成影響仍是未知的。因此我們利用單分子螢光共振能量轉移光譜研究插入 AGG 以及未插入 AGG 之 CGG 序列的構型。我們的研究結果顯示，CGG 序列不能在生理條件下折疊成鳥嘌呤四具體聚體。僅有在重複次數少於 12 的 CGG 序列能夠在有鳥嘌呤四具體聚體誘導劑的環境下，才能夠形成鳥嘌呤四具體聚體結構。在一般情況下，CGG 序列則是會穩定地摺疊成對齊型的髮夾型構型。插入 AGG 的 CGG 的序列則會使這種使這種穩定的髮夾型結構改變，變化成另一種髮夾型結構。以先前研究所提出的重複序列的擴張理論為基礎，我們提出一個 AGG 三重複序列可能在 DNA 擴張中所扮演的角色。在具有 AGG 插入之序列含有傾向於形成帶有露出核苷酸之髮夾型結構，此一結構較不利於序列擴張，且在插入 AGG 後並未觀察到此結構活動至較利於被擴張的對齊型髮夾型結構。我們認為此一結構與結構動態學上的指標性與 AGG 插入抑制 DNA 擴張的原因。. 關鍵字 : 單分子螢光共振能量轉移、DNA 擴張、CGG 三核苷酸重複序列 ii.

(4) Abstract The expansion of CGG/CCG trinucleotides in the fragile X mental retardation (FMR1) gene leads to Fragile X syndrome (FXS), one of the most common genetic disorders. The number of CGG tract is in between 5 and 44 tandem repeat units in the healthy humans, while in the pathological samples, more than 200 repeat units were found in FMR1 gene. The overexpansion of CGG repeat would trigger hypermethylation, an abnormal DNA methylation and lead to inhibition of histone modification and epigenetic gene of FMR1 silence. In contrast, healthy individuals show that AGG/CCT interruptions exist in every 9-10 CGG/CCG trinucleotides. CGG repeat can fold into hairpin-like structures or G-quadruplexes, which are still under debating. Moreover, how AGG interruption affect to d(CGG)n structure is remained elusive. We use single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET) spectroscopy to study the conformation of CGG repeat with and without the interruption by AGG insertions. Our results show that d(CGG) repeats do not form a G-quadruplex under the physiological condition until the G-quadruplex inducer (pyridostatin) was added to the short (<16 repeat units) CGG sequences. The stable d(CGG) hairpin structure is interfered by the AGG insertion and lead to become another hairpin structure. Based on the DNA expansion model from our previous study, we propose a structure and structural dynamics role of AGG insertion in DNA preventing expansion. The insertion of AGG makes the majority of the sequencing folded into a hairpin with overhang configuration, which has less tendency to be expanded. When the CGG triplet fold into the hairpin structure, the new generated CGG repeat would enter the hairpin region and the DNA polymerase won’t work. Once the DNA iii.

(5) replication restart, it’ll cause the DNA expansion. According to our result, CGG repeat interrupted by AGG triplet tend to fold into the hairpin structure with overhang. Furthermore, this configuration failed to slip to a expansion-favored blunt-end hairpin configuration. The unique structure and structural dynamics caused by the AGG insertion to tandem (CGG) repeat prevents the disease caused by error-prone expansion.. Keyword : smFRET, DNA expansion, CGG trinucleotides, iv.

(6) 目錄致謝摘要. ………………………………………………………………………………………………… ……………….i ………………………………………………………………………………………………………… ………………...ii. Abstract ……………………………………………………………………………………………………………………………iii 圖目錄 …………………………………………………………………………………………………………………vii 表目錄 ………………………………………………………………………………………………………………….xi 第一章、緒論 ……………………………………………………………………………………………………………1 1-1 前言........................................................................................................................... 1 1-2 染色體易碎症 ......................................................................................................... 5 1-3 致病原因 ................................................................................................................... 7 1-4 已解出的 CGG/CCG 之二級結構 ....................................................................... 9 1-4.1 髮夾型結構............................................................................................ 9 1-4.2 鳥嘌呤四聚體...................................................................................... 11 1-5 研究動機 ................................................................................................................. 14 第二章、實驗方法與儀器. …………………………………………………………………………………………15. 2-1 單分子實驗技術 .................................................................................................. 15 2-1.1 螢光共振能量轉移.............................................................................. 17 2-1.2 全內反射螢光顯微鏡.......................................................................... 19 2-2 實驗樣品的製備 .................................................................................................... 21 2-2.1 實驗樣品槽製作.................................................................................. 21 2-2.2 樣品槽的組裝...................................................................................... 24 2-2.3 實驗與 DNA 序列的設計 ................................................................... 25 2-2.4 螢光分子的標記.................................................................................. 27 2-2.5DNA 黏合反應 ..................................................................................... 28 2-2.6 分子內二聚體去除反應...................................................................... 29 2-2.7 將分子固定於玻片表面...................................................................... 30 2-2.8 光漂白與閃爍現象.............................................................................. 31 v.

(7) 2-2.9 影像緩衝溶液...................................................................................... 33 2-3 數據處理與分析 ................................................................................................... 35 2-3.1 數據處理 ............................................................................................ 35 2-3.2 擬合分析 ............................................................................................ 38 第三章、實驗結果………………………………………………………………………………………………………….40 3-1 實驗設計 ................................................................................................................. 40 3-2 結構鑒定 ................................................................................................................. 41 3-3 髮夾型結構鑑定 .................................................................................................... 42 3-4 長時間軌跡圖 ........................................................................................................ 42 3-5 鳥嘌呤四聚體結構鑑定....................................................................................... 45 3-6 插入 AGG 之 CGG 序列 ..................................................................................... 50 3-6.1 插入單組 AGG 之 CGG 序列 ............................................................ 50 3-6.2 插入雙組 AGG 之 CGG 序列 ............................................................ 55 第四章、結論…………………………………………………………………………………………………………………..58 4-1d(CGG)n 之結構 ...................................................................................................... 58 4-2AGG 對 CGG 序列之影響 ................................................................................... 59 4-3DNA 在人體中的擴張模型.................................................................................. 61 參考文獻…………………………………………………………………………………………………………………………..63. vi.

(8) 圖目錄圖 1、人類 X 染色體示意圖。...................................................................................... 2 圖 2、複製叉(replication fork)示意圖。 ....................................................................... 2 圖 3、DNA 複製示意圖。 ............................................................................................. 3 圖 4、DNA 不正常複製之示意圖。 ............................................................................. 4 圖 5、DNA 之二級結構示意圖。 ................................................................................. 5 圖 6、X 染色體示意圖。............................................................................................... 5 圖 7、 CpG 島示意圖。 ................................................................................................ 7 圖 8、DNA 甲基化示意圖。 ......................................................................................... 7 圖 9、組蛋白乙醯化以及去乙醯化示意圖。 .............................................................. 8 圖 10、髮夾型結構示意圖。 ........................................................................................ 9 圖 11、Delaney 團隊之研究成示意圖。 .................................................................... 10 圖 12、鳥嘌呤四聚體結構示意圖。 .......................................................................... 11 圖 13、Usdin 團隊所解出 CGG20 的構型。 ............................................................... 12 圖 14、Michaela 團隊以圓二色光譜觀測 CGG 序列以及插入 AGG 之 CGG 序列的構型。 ...................................................................................................................... 13 圖 15 單分子技術示意圖。 ......................................................................................... 16 圖 16、螢光共振能量轉移示意圖。 .......................................................................... 18 圖 17、稜鏡式全內反射顯微鏡示意圖。 .................................................................. 20. vii.

(9) 圖 18、實驗用的玻片經化學修飾後的結構。 .......................................................... 22 圖 19、修飾玻片步驟示意圖。 .................................................................................. 23 圖 20、實驗樣品槽組裝步驟示意圖。 ...................................................................... 24 圖 21、實驗序列設計圖。 .......................................................................................... 25 圖 22、Cy3 NHS ester 與 NH2C6 modified DNA 進行交聯反應示意圖。 ............... 27 圖 23、DNA 黏合反應示意圖。 ................................................................................. 28 圖 24、高濃度的 DNA 分子，依照 DNA 黏合反應的加熱程序，可能會形成二聚體示意圖。 .................................................................................................................. 29 圖 25、經處理後的 DNA 分子固定於玻面上[41]。 ................................................. 30 圖 26、分子受激發後，電子進行躍遷的示意圖以及其時間尺度。 ...................... 31 圖 27、放光過程以及光漂白機制。 .......................................................................... 32 圖 28 、POC 系統作用示意圖。 ................................................................................ 33 圖 29、水溶性維生素反應示意圖。 .......................................................................... 33 圖 30、IDL 所選出之分子示意圖。 ........................................................................... 35 圖 31、經過 Matlab 計算後的 EFRET，再由 Origin 會出的值方圖。 ....................... 31 圖 32、EFRET 軌跡圖。 ................................................................................................. 37 圖 33、HaMMy 程式介面圖。 .................................................................................... 38 圖 34、TDP 軟體操作介面圖。 .................................................................................. 39 圖 35、單分子實驗設計圖。 ...................................................................................... 40. viii.

(10) 圖 36、不同重複次數的 CGG 序列之直方圖。 ........................................................ 41 圖 37、CGG 序列依重複次數所產生結構示意圖。 ................................................. 43 圖 38、CGG 序列依重複次數不同分別與 d(CTG)4 以及 d(CTG)4T1 作比較圖。 .. 43 圖 39、部分 CGG 序列長時間軌跡圖。 .................................................................... 44 圖 40、d(CGG)4 在不同條件下，所得到的直方圖。 ............................................... 45 圖 41、PDS 嵌入於 DNA 序列中的示意圖。 ........................................................... 46 圖 42、ca2 在鉀離子 150 mM 中以及加入 PDS 的直方圖。 ................................... 47 圖 43、其他序列在 PDS 為 10nM 時的情況之實驗結果圖。.................................. 48 圖 44、其他重複次數之 CGG 序列，在 100nM 的 PDS 進行實驗所得到的直方圖。 .............................................................................................................................. 49 圖 45、(CGG)3AGG(CGG)5 與(CGG)4AGG(CGG)4 之實驗結果圖。 ...................... 51 圖 46、(CGG)9AGG(CGG)9 與(CGG)13AGG(CGG)13 在不同條件下所得到的直方圖。 .............................................................................................................................. 52 圖 47、(CGG)9AGG(CGG)9 與(CGG)13AGG(CGG)13 在鉀離子條件下的長時間軌跡圖。 .............................................................................................................................. 52 圖 48、d(CGG)19 與(CGG)9AGG(CGG)9 之機率轉換密度圖。 ................................ 53 圖 49、插入 AGG 之 CGG 序列與正常 CGG 序列之比較圖。 ............................... 55 圖 50、由左至右分別為(CGG)4AGG(CGG)9AGG(CGG)4、(CGG)4AGG(CGG)9 AGG(CGG)9、(CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)9 這三條序列分別在鉀離子、鋰離子、PDS 中，所得到的 EFRET 直方圖。 ................................................................... 56. ix.

(11) 圖 51、插入 AGG 之 CGG 序列在鉀離子 150mM 下錄製的長時間軌跡圖。 ....... 57 圖 52、單組 AGG 插入 CGG 之序列的情況。兩種髮夾型結構會發生互換的現象。 .............................................................................................................................. 59 圖 53、插入兩組 AGG 之 CGG 序列的構型示意圖，主要會以右邊的構型為主。 ...................................................................................................................................... 60 圖 54、TGGAA 序列擴張機制示意圖。 ................................................................... 61 圖 55、CGG 序列可能的擴張模型示意圖。。 ......................................................... 61. x.

(12) 表目錄表格 1、三重複序列與其造成的遺傳疾病一覽。 ................................................... 1 表格 2、不同螢光分子的配對與其物理性質一覽。 ............................................. 18 表格 3、本研究所使用之 DNA 序列一覽。 ........................................................... 26 表格 4、影像緩衝溶液配方。 ................................................................................. 34. xi.

(13) 第一章、緒論 1-1 前言現今許多遺傳疾病被發現是與三核苷酸的擴張有關，在正常人的體內中，也可以發現這些三核苷酸重複序列，並且這些序列皆會保持在一定的數目，一旦這些三核苷酸重複序列擴張到某一定的程度，就會產生遺傳疾病[1]，如表格 1 所示。現今臨床上最有名的例子為亨丁頓舞蹈症 (Huntington Disease) ，其對應到的序列是由於位在人類第四對染色體上的編碼區出現 CAG 重複序列。在正常人體內，CAG 重複序列的次數少於 26；當 CAG 重複次數超過 37 以上時就會發病；在第 19 對染色體上的 DMPK 基因也有相似的情況，在這段基因中可以找到 CTG 重複序列，而其對應到的疾病為強直性肌肉失養症(Myotonic dystrophy)。. 表格 1、三重複序列與其對應到的疾病，摘錄自[1]。. 1.

(14) 在人體的 FMR1 基因也存在著相似的序列(如圖 1)，在此基因上可以發現 CGG/CCG 重複序列。在正常人的體內中，CGG/CCG 三核苷酸的重複次數落在 5 至 44 間，在此重複次數下，序列會穩定的遺傳至子代;序列擴張至 60 到 200 之間，則稱為前突變 (permutation) 。在這個狀態下，雖然個體不會產生疾病，但是序列會發生不穩定的現象並且會遺傳至子代。一旦在個體內的序列超過 200 時，就會產生 X 染色體易碎症 (Fragile X Syndrome)，簡稱為 FXS[5]。. 圖 1、人類 X 染色體示意圖。鍵頭所指的位置是 Xq27.3，為 FMR1 所處的位置，摘錄自[5]。. 對於遺傳疾病的研究，序列的擴張就顯得十分重要。DNA 的擴張，可以用以下理論作解釋。在 DNA 複製過程中，DNA 解螺旋酶會先解開一般的雙股螺旋結構；這個時候，就會形成複製叉 (replication fork) 的結構，如圖 2 所示[4]。. 圖 2、複製叉(replication fork)示意圖，正六邊形為 DNA 解螺旋酶、橢圓為 DNA 聚合酶，摘錄自[4]。. 2.

(15) 形成複製叉後，DNA 聚合酶會在起始位點 (origin of replication) 。但因為 DNA 聚合酶會辨認複製時的方向性，因此僅有一條單鏈可以連續進行複製，此鏈稱為領先股 (leading strand)；另一條單鏈則是分段進行複製，稱為延遲股 (legging strand) 。在延遲股所形成的 DNA 片段又稱為岡崎片段 (Okazaki fragment) [8]，如圖 3 所示。由於 DNA 聚合酶的特性也就會形成兩股之間進行複製的速率不相同，也就是序列上的偏差 (misalignment) 。. 圖 3、DNA 複製示意圖。DNA 過程中會出現領先股以及延遲股。在領先股，DNA 複製順利進行；但在延遲股會片段進行 DNA 複製，也就是產生岡崎片段(紅色片段)，摘錄自[8]。. 在 DNA 的擴張理論中，認為 DNA 擴張的關鍵在於領先股的部分。若在領先股上產生二級結構，會使領先股滑出模板外。若領先股的二級結構被破壞，形成一般的單股結構，複製叉就會變回原本的結構。這時領先股上的序列就無法跟新生股配對，這樣會導致複製重新啟動，最後導致 DNA 的擴張，如圖 4 所示。而若是二級結構出現在延遲股，二級結構也會阻礙 DNA 聚合酶的作用；但此時領先股的複製仍然繼續進行。這樣就導致 DNA 聚合酶會跳過一個或多個岡崎片段，在經由蛋白質的修復，就會始新生股縮短[3]。. 3.

(16) 圖 4、DNA 不正常複製之示意圖。DNA 複製過程中，因分別在領先股以及延遲股產生二級結構，而造成不正常的擴張或縮短，摘錄自[3]。. 隨著科學家針對 DNA 構型的深入研究，發現 DNA 除了典型的雙股螺旋外，也會產生二級結構[3]，如圖 5 所示。以(CNG)n 為例 (N = A, T, C, G) ，在先前的研究中，(CTG)n 與(CAG)n 會折疊成類似髮夾型的二級結構。有趣的是(CTG)n 的類髮夾型結構間會有滑動的現象，而目前認為這樣的滑動現象是造成序列擴張的一個關鍵因素[2][4]。因此，研究 CGG/CCG 三核苷酸序列的擴張原因，可以從探討此三核苷酸序列會折疊成的二級結構開始。. 圖 5、連續 DNA 可能形成之二級結構示意圖，摘錄自[1]。. 4.

(17) 1-2 染色體易碎症 X 染色體易碎症 (Fragile X Syndrome) ，為一種常見的遺傳性疾病，其發病機率僅次於唐氏症。患者在新生兒時期並不容易觀察出來；大多數的患者大約要在三歲才能確認患有此疾病。主要的症狀為智能障礙以及自閉症；體型特徵包含狹長的臉型、大耳以及結締組織異常。另外，男性患者會有巨睪症。在心智行為方面，女性患者的症狀則比較輕微，患者會有輕度的智能障礙、認知能力異常、精神分裂以及焦慮；同時也具備語言的能力。相較於女性患者，男性患者的症狀會隨著年齡增加而更嚴重；行為也會有自閉症的行為、語言溝通困難[9][10]。對於染色體易碎症的研究可以追溯到 1943 年，在當時就有人發現在特殊學校成員以男性居多，於是當時兩位學者 Martin 以及 Bell 就提出相關的報告。此報告指出此疾病造成阻礙智能上的發展並且是會具有性聯形式[6]，也就是說病患以男性為主。直到 1969 年，Lubs 認為此疾病與 X 染色體的狀態有一定的相關性[7] 。在隨後的研究中，也確認是在 X 染色體上的 Xq27.3 處出現束縮 (constriction) 或同染色體絲裂隙 (isochromatid gap) ，這也使得 X 染色體看起來像是要斷裂一般，如圖 6 所示。. 圖 6、X 染色體示意圖。左邊為正常的 X 染色體；右邊為不正常的 X 染色體，摘錄自[7]。. 5.

(18) 在 1977 年 Sutherland 對於 X 染色體的易碎做了更進一步的分析，他的研究報告指出，在缺乏葉酸以及胸腺嘧啶的條件下培養，可以使這種 X 染色體易碎的現象表達出來[11]。在 1985 年，Pembrey、Winter 以及 Davies 等人發現患者的親代基因雖然有影響，但外表卻不會有任何的異常，染色體方面也沒有碎裂的情況發生，這也顯示親代與子代間的差異[13]。經過多年的研究，才確認其主要病是因為在 FMR1 基因的 5’端非轉譯區出現大量的 CGG 重複序列；然而基因圖譜研究中，在正常人的體內中，CGG 重複序列除了在穩定的重複次數下；也可以發現 CGG 重複序列中會被 AGG 所打斷。大約每 9 至 10 個 CGG，就會出現一個 AGG。因此在正常人的體內中，(CGG)9AGG(CGG)9AGG......可以輕易的在 FMR1 的 5’端非轉譯區中發現[5]。因此 AGG 的插入對於結構及其動態有何影響是我們極欲想了解的。. 6.

(19) 1-3 致病原因在 1991 年 FMR1 的基因 Verkerk AJ 團隊轉殖出來。他們除了發現有大量重複 CGG 片段外，也發現病患 X 染色體 Xq27.3 位置的 CpG 島，如圖 7 所示。有過甲基化的現象 (hypermethylation) [12]。甲基化係指 DNA 上的胞嘧啶 (cytosine) 會經過甲基轉移酶修飾，增加一個甲基，如圖 8 所示。甲基化為生物體中一種調控基因表現的一種模式，經過甲基化的基因會變得不活化 (deactivation) ，抑制基因的表達。. 圖 7、 CpG 島示意圖。CpG 島是指 DNA 上的區域，此區域含有大量相鄰的胞嘧啶以及鳥嘌呤，兩者間以磷酸酯鍵相連，如圖中灰色區塊。大量通常是 50%以上，不同種的生物比例會有所不同，摘錄自[49]。. 圖 8、DNA 甲基化示意圖。左邊為胞嘧啶(cytosine)，右邊為經甲基化的胞嘧啶(methylated cytosine) ，摘錄自[42]。. 7.

(20) CpG 島的過甲基化是種人體中很重要的基因調控模式，最有名的例子是人類中的抑癌基因。在 1989 年時，被發現在人體中的視網膜母細胞癌中，恰好發生過甲基化的位置也在 CpG 島上。一但出現過甲基化，就會使基因失活化 [15]。恰好人體中的 5’端非轉譯區，都是富含 CpG 島，因此有著大量 CGG 片段會引起過甲基化的現象。過度的甲基化也就會引起另一種基因調控模式，稱為組蛋白修飾 (histone modification) [19]。組蛋白為一種存在於真核生物中的一種蛋白，其功能為包裝以及組織 DNA，DNA 與組蛋白的結合體稱為核小體。核小體對於基因的表現扮演著重要的角色。組蛋白可以藉由組蛋白乙醯轉移酶 (histone acetyltransferase, HAT) 進行乙醯化，乙醯化的後的組蛋白，會使得 DNA 纏繞變得鬆散，使得轉錄因子可以能夠與 DNA 結合，促進基因表現；經乙醯化的組蛋白也可以經過組蛋白去乙醯轉移酶(histone deacetylase) 去乙醯化，以抑制基因表達[20]，如圖 9 所示。這樣一系列的影響，就會讓 FMR1 的啟動子不易進行轉錄作用，使得患者體內失去基因產物，進而發生疾病[19]。. 圖 9、組蛋白乙醯化以及去乙醯化示意圖。黃色柱體為組蛋白；白色線條為 DNA 序列；HDAC 為組蛋白去乙醯化轉移酶；HAT 為組蛋白乙醯化轉移酶，摘錄自[20]。. 8.

(21) 1-4 已解出的 CGG/CCG 之二級結構有關於 CGG 三核苷酸重複序列的構型，一直以來都存在著爭議。不過總體而言可以分為兩派說法。一派的人認為，CGG 結構應該與 CNG (N 可以為 A、 T、C、G) 結構相同。會折成髮夾型結構[16]。但由於 CGG 重複序列富含鳥嘌呤 (guanine) ，因此也有人認為鳥嘌呤四聯體 (G-quadruplex) 也是一種 CGG 可能會形成的二級結構[21]，詳見 1-4.2。. 1-4.1 髮夾型結構髮夾型結構 (hairpin structure) ，又稱為莖環結構 (stem-loop structure) 為一種因分子內鹼基配對所形成的二級結構，在這個結構中，可以分作兩部份，主幹 (stem) 以及環 (loop) ，如圖 10 所示。主幹的部分是以雙股螺旋的配對；環的部分則無鹼基的配對。其結構穩定度取決於髮夾型結構的程度以及環的大小及位置。. 圖 10、髮夾型結構示意圖，摘錄自[44]。. 2006 年，Mergny 團隊去分析不同重複次數的 CGG 序列的穩定度以及構型。從實驗可以發現兩點。第一，不同重複次數的序列其熱穩定性不會有太大的變化。第二，從紫外-可見光吸收光譜 (UV/Vis absorbance spectroscopy) 發現 CGG 的結構與鳥嘌呤四聯體有相當大的差異。他們表示，CGG 序列的結構應該為髮夾型結構[24]。. 9.

(22) 2010 年，Sarah Delaney 團隊利用膠體電泳 (Gel electrophoresis) 與硫酸二甲酯分析 (dimethyl sulfate footprinting) 分析 d(CGG)19 以及 d(CGG)39 的構型。實驗結果顯示，這兩條序列皆會折疊成髮夾型結構；插入 AGG 的 CGG 序列，則有可能形成有兩個環 (loop) 的特殊髮夾型結構，如圖 11 所示[23]。. 圖 11、Delaney 團隊之研究成示意圖。(A)(B)d(CGG)19 之構型(C)插 AGG 的 CGG 序列所產生的特殊髮夾型結構，摘錄自[23]。. 10.

(23) 1-4.2 鳥嘌呤四聚體鳥嘌呤四聯體為一種富含鳥嘌呤的 DNA 序列在特定的離子條件下才會發生的二級結構，並以四個鳥嘌呤為單位形成 G-quartet，數個 G-quartet 堆積起來就會形成鳥嘌呤四聯體，如圖 12 所示。不同於典型的雙股螺旋結構，鹼基對以 Watson-Crick 鍵結模式鍵結。鳥嘌呤四聯體上的鳥嘌呤是以 Hoogsteen 的鍵結模式並且在平面的中心存在著陽離子，可以分散鳥嘌呤上的靜電力，減少負電的排斥力。目前也被證實，鉀離子對於穩定鳥嘌呤四聚體結構有相當好的效果[17]。. 圖 12、鳥嘌呤四聚體結構示意圖。左圖為四個鳥嘌呤經由Hoogsteen氫鍵所形成的G-quartet，中心具有陽離子穩定結構。右圖為 G-quartet 堆積而成的鳥嘌呤四聚體結構，摘錄自[43]。. 11.

(24) 1995 年，Usdin 團隊以膠體電泳 (Gel electrophoresis) 與硫酸二甲酯分析 (dimethyl sulfate footprinting) 分析 d(CGG)20 在不同離子條件下的構型。實驗結果顯示 d(CGG)20 在鉀離子的條件下會形成特殊的結構，並且會阻礙體外的 DNA 合成；而在其他的鈉離子以及銨離子的條件下不會阻礙 DNA 合成。利用硫酸二甲酯分析，更進一步的推測，在鉀離子的條件下會形成鳥嘌呤四聚體的結構；在其他離子條件則會形成類似頭對頭的髮夾型結構，如圖 13 所示，但他們也無法判斷出何者為主要構型[18]。. 圖 13、Usdin 團隊所解出(CGG)20 的構型。(A)髮夾型結構(B)鳥嘌呤四股結構，摘錄自 [18]。. 12.

(25) 2009 年，Michaela Vol 團隊利用圓二色光譜測定 CGG 重複序列的構型。他們發現，隨著序列的延長，鳥嘌呤四聯體的特性就越不顯著，這也與其他先前的研究相吻合[25]。但是在短序列中 (重複次數為 4 以及 8) ，可以在高鉀離子的濃度下誘導出鳥嘌呤四聚體。而插入 AGG 的 CGG 序列，在相同的條件下，也可以擁有相同的結果，其實驗結果如圖 14 所示[21]。. 圖 14、Michaela 團隊以圓二色光譜觀測 CGG 序列以及插入 AGG 之 CGG 序列的構型。(A)插入 AGG 之 CGG 序列(B)CGG 序列，兩者皆會形成平行結構的鳥嘌呤四聚體。. 13.

(26) 1-5 研究動機染色體為一種遺傳性疾病，其病因為 CGG 的不正常擴張。在 DNA 的擴張理論中，二級結構及其動態滑動扮演著重要的角色[26]。但是由於序列擴張所造成的遺傳疾病沒有一個有效的治療方式[3]。因此若能了解出其 DNA 構型，對於 CGG 擴張的模式會有相當大的幫助。在人體中常被發現的插入 AGG 的 CGG 序列來說，也沒有文獻清楚地指出 AGG 對於一般 CGG 序列的影響。由先前的研究可以得知 CGG 三重複序列雖然在不同條件下，構型會有所不同。大部分的文獻指出，CGG 的二級結構以髮夾型結構以及鳥嘌呤四聚體為主。但是以往的測量方法皆屬於巨觀的觀測結果，且 CGG 重複序列可能因同時具有不同構型狀態而不容易解析。因此，此研究以單分子螢光光譜去測定 CGG 以及插入 AGG 的 CGG 序列的構型及其動態，進行對 CGG 序列長度與 AGG 插入頻率做一系統性的研究，以找出 AGG 對於此擴張序列之影響。. 14.

(27) 第二章、實驗方法與儀器 2-1 單分子實驗技術在生物系統的研究中，往往因為系統的複雜性，而不能夠充分地了解其作用機制。隨著近年來物理技術的發展，例如光陷阱 (optical trap) 。光陷阱技術最早由 A. Ashkin 發展出來[29]，隨後他們就利用光鉗技術分離出單一細胞出來。在傳統的生物實驗，往往是巨觀的觀測的方式，所得到的結果接是多個分子平均的結果。若生物分子具有異質性 (heterogeneity) ，分子的動力學、結構以及動態學等詳細資訊在平均的過程之中被抹除。，因此若能觀察到個別分子的行為，可以重新獲得這些重要的資訊。以圖 15 來說，單分子技術大致可以分為兩類。其一是以力學做為觀測基礎的磁鉗 (magnetic tweezer) 以及光鉗 (optical tweezer) 。實驗中，會將目標分子修飾小球，再分別藉由磁力或是聚焦的雷射，控制修飾在目標分子上的小球，以達到對分子施力的效果。另一類則是以光譜學為基礎，藉由激發目標分子上的螢光基團，得到分子個別的行為，通常可以搭配全內反射 (total internal reflection fluorescence, TIRF) 以及共聚焦 (confocal) 顯微鏡[28]。本研究以單分子螢光共振能量轉移 (single-molecule fluorescence resonance energy transfer, smFRET) 搭配全內反射顯微鏡去研究 CGG 三重複序列的構型。. 15.

(28) 圖 15、單分子技術示意圖。(A)原子力顯微鏡(AFM)、(B)光鉗、(C)磁鉗、(D)單分子螢光光譜，摘錄自參考資料[28]。. 16.

(29) 2-1.1 螢光共振能量轉移螢光共振能量轉移 (fluorescence resonance energy transfer, FRET) ，為一種描述兩個發光團 (chromophore) 傳遞的關係。此系統中需要兩個螢光基團:供體 (donor) 以及受體 (acceptor) 。當供體發色團受到激發光激發後，電子獲得能量後會激發至激發態。若此時系統中存在另一個受體發光團，並結滿足下列特定的條件，處於激發態的供體發光團就會藉由偶極-偶極作用 (dipole-dipole interaction) 將能量傳至受體發光團上。發生螢光共振能量轉移條件如下: 1.. 供體發光團的吸收光譜與受體放射光譜有一定的重疊 (overlap). 2.. 兩發光團之間的距離要小於約 10 nm. 3.. 兩發光體的偶極矩向量不能為垂直. 兩發光團能量間傳遞的效率 (EFRET) 可以定義如下，並遵守下列關係式:. 𝐸𝐹𝑅𝐸𝑇. =𝐼. 𝐼𝐴 𝐷 +𝐼𝐴. =. 1. 6 1+(𝑅𝑅 ) 0. 式(1). EFRET 為螢光共振能量轉移的效率，IA 為受體放光強度，ID 為供體放光強度，R 為兩發光團的距離，R0 定義為產生 50%的能量轉移時，兩螢光分子的距離，其數值取決於兩發光團的性質。表格 2 上，有各種不同螢光分子配對之量子效率。當兩發光體距離越近時，轉移效率就越高；相反地，距離越遠則會得到較低的轉移效率。並且在兩發光團距離在 3-8 nm 時，會有最佳的敏感度，如圖 16 所示。. 17.

(30) 表格 2、不同螢光分子的配對與其物理性質一覽。(a)quantum yield of donor (b)extinction of acceptor (c) Förster distance，摘錄自[31]。. 圖 16、螢光共振能量轉移示意圖。(A)EFRET 與距離關係圖。(B)兩發光團的偶極矩方向，不為垂直才會發生能量轉移，摘錄自[30]。. 18.

(31) 2-1.2 全內反射螢光顯微鏡本篇研究所使用的儀器為實驗室所建立的稜鏡式全內反射顯微鏡 (total internal reflection fluorescence microscopy, TIRF-M) ，如圖 17 所示。當光由光密介質 (高折射率) 射入光疏介質 (低折射率) ，且入射角大於臨界角，就會產生全反射的現象。在兩介質的交界處，光密 (高折射率) 介質處會產生漸逝場 (Evanescent field) ，其光強度與深度會呈現指數性的下降。漸逝場的平均穿透深度大約是 100 nm，因此可用此激發被固定於表面上螢光分子，可以降低溶液中雜質與螢光分子所產生的背景雜訊，可以達到單分子條件所需的訊雜比 (signalto-noise ratio)。實驗上所使用的激發光光源分別為波長 532 nm 與 638 nm 的雷射光源，如此一來可以配合實驗上所使用的供體以及受體的激發波長。當雷射光激發供體發光體後，會將其能量轉移至受體發光體上。螢光會經由物鏡、濾鏡，為了能夠同時觀測這兩個螢光發光體的訊號，須使用雙視 (dual-view) 光學元件。先透過狹縫將螢光影像裁剪為直方形，再經過消色差透鏡 (abchromat) 組將影像投至向感光器，在消色差透鏡組中間放置有一雙色鏡 (dichroic mirror) ，雙色鏡會將供體所放出的光反射；使受體所放出的光通過。供體發出的光會再經由平面鏡反射，調整雙色鏡與反射鏡的角度可使供體與受體的影像相鄰排列並一起投至電子放大式電荷耦合器 (Electron Multiplied Charge Coupled Device, EMCCD) ，而可被同時觀測兩種螢光訊號[31]。. 19.

(32) 圖 17、稜鏡式全內反射顯微鏡示意圖。(a)在稜鏡與玻片交界處會發生全反射的現象，並且會激發漸逝場內的螢光分子；橘色點為固定於玻片表面的螢光分子，綠色部分為光現行徑的路線。(b)儀器架構圖，摘錄自[31]。. 20.

(33) 2-2 實驗樣品的製備 2-2.1 實驗樣品槽製作本實驗以觀察 DNA 分子的構型為主，必須將 DNA 分子固定於玻片表面，因此要先對玻片進行化學修飾。步驟如下: 1.. 先取 25 mm × 76 mm 的石英玻片，於玻片的兩側各鑽五個孔洞. 2.. 使用甲醇、丙酮、洗碗精、擦拭玻片，確認玻片無明顯的雜質。. 3.. 將玻片泡入食人魚試劑（雙氧水：硫酸＝1:3, 體積比），並且以超純水清洗殘留的食人魚試劑。. 4.. 使用本生燈將已洗淨的玻片燒烤過。. 5.. 分別將所要做修飾的玻片以及 24 mm × 40 mm 的蓋玻片裝入染色壺。. 6.. 配製 3 M 的氫氧化鉀以及 0.1 M 的碳酸氫鈉. 7.. 把已裝入玻片、蓋玻片的染色壺到入丙酮，再以超音波震 30 分鐘。. 8.. 承步驟 7，將玻片、蓋玻片以超純水洗淨，再倒入 3 M 的氫氧化鉀，再用超音波震盪 30 分鐘。. 9.. 承步驟 8，將玻片、蓋玻片以超純水洗淨，再倒入甲醇，再用超音波震盪 30 分鐘。震盪完後使用超純水洗淨。. 10. 取兩個染色壺以及一個錐形瓶，到入 3 M 的氫氧化鉀後，超音波震盪 30 分鐘。 11. 承步驟 10，倒出氫氧化鉀溶液後，用超純水洗淨並倒入甲醇，超音波震盪 30 分鐘。 12. 承步驟 11，倒出甲醇後，用乾淨的甲醇潤洗後，使用氮氣將溶氣吹乾，作為反應容器用。 13. 承步驟 9，清洗好的玻片用本生燈燒烤；蓋玻片則用電漿清洗機 (Harrick Plasma, PDC32G1051059) 以中等強度清洗 5 分鐘。 14. 將經步驟 13 處理後的玻片以及蓋玻片放入反應容器中。 21.

(34) 15. 取 100 mL 的甲醇、5 mL 的醋酸、1 mL 的三甲氧矽丙基乙二胺 (N-[3(Trimethoxysilyl)propyl]ethylwnwdiamine, aminosilane)，配製程反應溶液。其功能為修飾玻片表面，如圖 18 所示。 16. 取(玻片數+0.5) × 16 mg 的聚乙二醇 (mPEG-SVA, M.W. = 5000, Laysan Bio) 以及(蓋玻片數+0.5) × 0.3 mg 的生物素修飾之聚二乙醇 (biotin-PEG-SVA, M.W. = 5000, Laysan Bio) 放入 1.5mL 的離心管中。接著取(玻片數+0.5) × 64 μL 的 0.1M 碳酸氫鈉溶液。功能為將修飾好的玻片，產生鍵結。 17. 將步驟 15 的的反應溶液，倒入反應容器中，靜置 10 分鐘後，以超音波震盪 2 分鐘後，再靜置 10 分鐘。用超純水洗淨並用氮氣吹乾。 18. 用 pipette 取步驟 16 的反應溶液 70 μL，滴在玻片上並蓋上蓋玻片後靜置 4 小時。 19. 以超純水洗淨並用氮氣吹乾，裝入 50 mL 的離心管中(瓶身需以鋁箔紙包覆，瓶蓋則要打孔)，放入真空袋抽真空後，放入-20 ℃ 冰箱保存即可。. 圖 18、實驗用的玻片經化學修飾後的結構，摘錄自[32]。. 22.

(35) 圖 19、修飾玻片步驟示意圖。 23.

(36) 2-2.2 樣品槽的組裝將經化學修飾的玻片從冰箱中取出，並等待玻片回到室溫(避免水氣凝結在玻片上)，依照以下步驟組裝，如圖 20 所示。 1.. 將玻片修飾面朝上，以前後的小洞為一組通道，開出相對應寬度的雙面膠個開各通道。. 2.. 將蓋玻片修飾面朝下，覆蓋於玻片的各通道，並用 pipette tip 施壓於蓋玻片，使膠帶能夠與玻片及蓋玻片緊密結合。. 3.. 以環氧樹脂堵住通道前後，放置在暗處等待環氧樹脂乾硬。. 圖 20、實驗樣品槽組裝步驟示意圖。(a)將玻片修飾面朝上置放 (b)用雙面膠隔開各通道 (c)蓋上蓋玻片 (d)用環氧樹脂堵住通道，等到環氧樹脂乾硬後，即完成樣品槽的組裝，摘錄自[32]。. 24.

(37) 2-2.3 實驗與 DNA 序列的設計我們利用生物素 (biotin) 與中性親和素 (neutravidin, Thermo Fisher Scientific Inc.) 之間強大的鍵結力，將 DNA 分子固定於玻片表面上。序列的上的設計如同圖 21 所示，分為主序 (深藍色區域) 列與副序列 (紫色區域) 。主要序列包含目標序列以及副序列的互補股並且會 5’端的位置修飾 NH2C6，用來連接螢光基團「Cy3」。副序列則是用來固定 DNA，因此在 3’端的尾端有修飾上生物素 (biotin) ，可以與中性親和素 (neutravidin) 結合；在 A11 與 G12 的骨架上的磷酸根上會修飾另一個螢光基團「Cy5」。主序列上有副序列的互補股，彼此會形成雙股螺旋，因此並不會影響到我們的目標序列。. 圖 21、實驗序列設計圖。. . 下表為本研究所使用的序列: 序列名稱. 5’修飾. 序列. CGG4. NH2C6. (CGG)4GCCTCGCTGCCGTCGCCA. CGG5. NH2C6. (CGG)5GCCTCGCTGCCGTCGCCA. CGG6. NH2C6. (CGG)6GCCTCGCTGCCGTCGCCA. CGG7. NH2C6. (CGG)7GCCTCGCTGCCGTCGCCA. CGG8. NH2C6. (CGG)8GCCTCGCTGCCGTCGCCA. CGG9. NH2C6. (CGG)9GCCTCGCTGCCGTCGCCA 25.

(38) CGG10. NH2C6. (CGG)10GCCTCGCTGCCGTCGCCA. CGG12. NH2C6. (CGG)12GCCTCGCTGCCGTCGCCA. CGG16. NH2C6. (CGG)16GCCTCGCTGCCGTCGCCA. CGG19. NH2C6. (CGG)19GCCTCGCTGCCGTCGCCA. CGG20. NH2C6. (CGG)20 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. CGG29. NH2C6. (CGG)29 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. ca2. NH2C6. (CGGAGG)2GCCTCGCTGCCGTCGCCA. C3AC5. NH2C6. (CGG)3AGG(CGG)5GCCTCGCTGCCGTCGCCA. C4AC4. NH2C6. (CGG)4AGG(CGG)4GCCTCGCTGCCGTCGCCA. C9AC9. NH2C6. (CGG)9AGG(CGG)9GCCTCGCTGCCGTCGCCA. C13AC13. NH2C6. (CGG)13AGG(CGG)13 GCCTCGCTGCCGTCGCCA. C4AC9AC4. NH2C6. (CGG)4AGG(CGG)9AGG(CGG)4GCCTCGCTGCCGTCGCCA. C5AC9AC4. NH2C6. (CGG)5AGG(CGG)9AGG(CGG)4GCCTCGCTGCCGTCGCCA. C4AC10AC4. NH2C6. (CGG)4AGG(CGG)10AGG(CGG)4GCCTCGCTGCCGTCGCCA. C4AC9AC9. NH2C6. (CGG)4AGG(CGG)9AGG(CGG)9GCCTCGCTGCCGTCGCCA. C9AC9AC9. NH2C6. (CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)9GCCTCGCTGCCGTCGCCA. 表格 2、本研究所使用之 DNA 序列一覽。. 26.

(39) 2-2.4 螢光分子的標記我們在設計 DNA 時，將 5’端的第一個核苷酸的磷酸根接上 6 個碳的碳鏈，並在碳鏈末端加上胺基 (NH2C6) ，形成特殊的 DNA 分子。其中的胺基會與 Cy3 上的 NHS ester 反應，進而將 DNA 分子標記上螢光基團 Cy3。六個碳的碳鏈長度大約為 2nm，可以使 Cy3 遠離單雙股的交界並且使 Cy3 可以自由轉動，如圖 22 所示。在此條件下，我們可以假設 Cy3 與 Cy5 偶極矩之相對方向呈現隨機分佈，FRET efficiency 僅會受到距離影響。標記螢光分子的步驟如下: 1.. 將 0.2mg 的 Cy3 NHS ester (sulfo-Cyanine3 NHS ester, Lumiprobe) 加入 35μ L、0.1M、pH = 8.6 的四硼酸鈉 (sodium tetraborate decahydrate, SIGMAALDRICH)，即可配製出 Cy3 溶液。. 2.. 將配製好的 Cy3 溶液，全部加入乙胺基修飾好的主序列粉末中。將 Cy3 與 DNA 混合液用鋁箔紙包覆並在室溫下慢速轉動 12 小時。. 3.. 將轉動過得 DNA 溶液加入 87.6μL, 99.5% 乙醇與 3M, 氯化鈉水溶液，並且靜置於-20℃冰箱中 30 分鐘。. 4.. 將靜置好的 DNA 溶液放入冷凍離心機中，並以 4℃、11200rpm 下離心半小時。. 5.. 離心後，即可看到標記上 DNA 之固體，去掉上清液，並以氮氣吹乾。. 6.. 分別重複步驟 3、4、5，以確保溶液中不會有殘留的 Cy3。. 7.. 用水回溶固體以配製成 100μM 濃度的 DNA 母液，並放置於-20 度冰箱保存. 。. 圖 22、Cy3 NHS ester 與 NH2C6 modified DNA 進行交聯反應示意圖。. 27.

(40) 2-2.5DNA 黏合反應主序列標記好「Cy3」後，即可與副序列進行黏合反應，反應完成後，DNA 分子就可以用進行實驗。黏合反應的步驟如下: 1.. 取 4μL 的 100 μM 主序列溶液加入 1 μL 的 100 μM 副序列溶液，並加入 15μL 的超純水。. 2.. 將步驟 1 配製好的混合液，放入聚合酶連鎖反應 (Polymerase chain reaction， PCR) 機器。加熱程序如下；首先將溶液加熱至 95℃並維持 6 分鐘，接著以每分鐘降 1℃的速度，降溫至 22℃。. 3.. 反應結束後，即可得到實驗用之 DNA 樣品，如圖 23 所示；其濃度大約為 5 μM。未使用的 DNA 溶液，須保存於-20℃的冰箱中。. 圖 23、DNA 黏合反應示意圖。將加入主序列以及副序列之溶液，依照黏合反應之加熱程序，可以得到實驗用的特殊 DNA 構型。. 28.

(41) 2-2.6 分子內二聚體去除反應將 DNA 分子加熱至 90℃時，DNA 分子將會以散亂的長鏈形式存在於溶液中。這時如果將 DNA 溶液緩慢的降溫，分子會形成其最穩定的構型。但是本研究所使用的 CGG 序列，富含鳥嘌呤 (guanine) 以及胞嘧啶 (cytosine) ，兩者之間可能會產生鍵結。若 DNA 的濃度比較高時，有可能會讓兩個 DNA 分子形成二聚體，如圖 24 所示。為了將二聚體去除，可以將以稀釋至 pM 等級濃度溶液加熱至 50 度。在此溫度下可以解開 CGG 所產生的雙股結構而不會將副序列的雙股結構解開的溫度。一方面，可以去除二聚體的構型，另一方面可以讓單股的序列達到最穩定的構型。. 圖 24、高濃度的 DNA 分子，依照 DNA 黏合反應的加熱程序，可能會形成二聚體示意圖。. 29.

(42) 2-2.7 將分子固定於玻片表面經由黏合反應以及去二聚體反應的 DNA 樣品，即可固定於玻片表面上進行觀測。主要原理為：利用中性親和素以及修飾於副序列上的生物素 (biotin) 之間會有結合力。使得 DNA 分子能夠固定於玻片上的一側，如圖 25 所示。其步驟如下： 1.. 將組裝好的玻片以蓋玻片朝下的方式放置於桌面上，此時通道上的孔洞會面向朝上。並使用大約 40μL 的 T0 溶液(Tris 20mM, pH 7.8)，將迴流通道洗淨。. 2.. 將 40μL、0.2g/mL 的 Neutravidin 溶液，注入於迴流通道中，並靜置約 2 分 30 秒。靜置後隨即將 T0 溶液沖入迴流通道中，去除殘餘的 Neutravidin 溶液。. 3.. 將 40μL、10pM 的 DNA 溶液，注入迴流通道中，靜置約 3 分鐘 30 秒，靜置後使用 TK150 緩衝溶液 (Tris 20mM, pH 7.8, KCl 150mM) 溶液沖入迴流通道中，以去除過多的 DNA 分子，避免影響實驗結果。. 圖 25、經處理後的 DNA 分子固定於玻面上，摘錄自[41]。. 30.

(43) 2-2.8 光漂白與閃爍現象發光基團受到光照後，如圖 26 所示，電子會從基態 (ground state, S0) 激發至單重激發態 (excited singlet state) ，經由振動緩解 (vibrational relaxation) ，會回到較低能階的激發態(S1)。此時，電子會經過許多種途徑。若電子經由內部轉換 (internal conversion) 會到激態(S0)，多餘的能量就會以螢光 (fluorescence) 的形式放出；若電子經過系間跨越 (intersystem cross) ，電子會進入三重激發態 (excited triplet state, T1) ，回到基態 (S0) 能量會以磷光 (phosphorescence) 的形式放出。螢光的放光過程僅有 10-7~10-9 秒，視為亮態。磷光的放光機制是違反選擇律 (selection rule) ，其過程大約在 10-2~10-3 秒間，單位時間放出的光子量較低，可視為暗態 (dark state) 。在實驗過程中，若發生系間跨越 (intersystem crossing) 至三重態，螢光分子產會閃爍 (blinking) 現象。其解決方法是加入三重態淬熄劑 (triplet quencher) ，可以降低閃爍的發生[36]。. 圖 26、分子受激發後，電子進行躍遷的示意圖以及其時間尺度，摘錄自[35]。. 31.

(44) 在螢光共振能量轉移的實驗中，螢光分子的穩定度相當重要。但溶液中會有物質與螢光分子反應導致其失去活性，例如單重態的氧(1O2)，此種現象稱為光漂白現象 (photobleaching)，如圖 27 所示。若發生此種情況將無法繼續觀察。為了解決這樣的問題，因而發展出除氧系統以去除溶液中單重態的氧。除氧系統的主要原理為，將溶液中葡萄糖氧化葡萄醛酮糖，再與吡喃糖氧化作用產生過氧化氫，最後與過氧化氫酶作用，以減少溶液中的氧氣[37]。. 圖 27、放光過程以及光漂白機制，摘錄自[35]。. 32.

(45) 2-2.9 影像緩衝溶液為了避免光漂白以及光閃爍現象，我們進行實驗前需要配製含有三重態淬息劑以及具除氧效果緩衝溶液。影像緩衝溶液的配置方式如表格 4 所示。本實驗選用 Pryanose Oxidase in Combination with Catalase. (POC) 系統進行實驗，其主. 要機制如圖 28 所示。三重態的淬熄劑則是用水溶性維生素 E (Trolox) ，其母液會轉換為 Quinone，如圖 29 所示。可以有效地降低光閃爍 (blinking) 的現象。. 圖 28、POC 系統作用示意圖。(a)葡萄糖與喃糖氧化酶作用反應式[37](b)過氧化氫與過氧化氫酶反應式。. 圖 29、水溶性維生素反應示意圖。左圖為水溶性維生素 E (trolox) 結構式經過光照與氧氣的作用，會逐漸形成 quinone，可以做為三重態淬息劑。. 33.

(46) Chemical. Concentration of Stock. Volume (μL). Trolox. 3.08 mM. 50. Glucose. wt% = 25%. 2. Catalase. 108500 unit/ μL. 1. Pyranose Oxidase. 0.135 unit/ μL. 2. Salt (KCl). 1M KCl. 15. ddH2O. 30 表格 4、影像緩衝溶液配方。. 34.

(47) 2-3 數據處理與分析 2-3.1 數據處理實驗所取得的螢光訊號，會經由電子放大式電荷耦合器放大後，傳遞至電腦。本篇研究利用由 Taekjip Ha 團隊所提供的軟體 sm Camera 來紀錄獲得到的螢光訊號。每幀 30 張圖像，曝光時間為 30 毫秒，可以同時觀測到相同區域 Cy3 與 Cy5 的螢光訊號。每張圖像皆會以 IDL (Exelis Visual Information Solutions) 進行螢光訊號位置的校正與單分子的選取，如圖 30 所示。其方法為將圖像中 Cy3 與 Cy5 的訊號進行重疊後，再扣除背景訊號，以確認分子的位置[39]。. 圖 30、IDL 所選出之分子示意圖。經由 IDL 所圈選出的單分子位置，影像左右分別為單分子上 Cy3 與 Cy5 之螢光訊號。. 35.

(48) 接著利用 Matlab (The Math works, Inc.) 去針對每一個分子進行螢光效率轉換的計算，分析方法可以分為兩種。其中一種為短時間的分析方式為取第 3 到第 12 幀的影像，將每一個分子的螢光訊號對時間做平均，再利用螢光效率轉換的公式，即可得到各分子的 EFRET 值。但是供體的螢光訊號進入濾光片時，會部分有逸漏的現象 (leakage) 。因此實驗中觀察到的受體螢光訊號，會有部分來自於供體，必須使用下列關係式進行修正，修正後之關係式如式(2)所示：. 𝐼 −𝛼𝐼. 𝐸𝐹𝑅𝐸𝑇 = 𝐼𝐴+𝛽𝐼𝐷 𝐴. 𝐷. 式(2). 其中 IA 與 ID 分別為 Cy5 與 Cy3 的螢光放光強度；α為逸漏值 (donor leakage) 之修正項；𝛽值則為量子產率的校正，關係式如式(3)所示，本實驗系統的α值為 0.2，𝛽值約為 1。. 𝐸𝐹𝑅𝐸𝑇 =. 𝐼𝐴 −𝛼𝐼𝐷 𝐼𝐴 +𝐼𝐷. 式(3). 將所有的 EFRET 值以繪圖軟體 Origin 繪製成直方圖，如圖 31 所示。. 36.

(49) 圖 31、經過 Matlab 計算後的 EFRET，再由 Origin 會出的值方圖。. 另一種為長時間的分析方法，將每個分子的 Cy3 與 Cy5 訊號，進行螢光共振能量轉移公式，即可得各分子螢光能量轉移效率隨著時間的變化值。如圖 32 所示。. 圖 32、EFRET 軌跡圖，紅線以及綠線分別為 Cy5 與 Cy3 之螢光放射強度，藍線則為出算出的 EFRET 值。. 37.

(50) 2-3.2 擬合分析本研究中使用的擬合軟體是 HaMMy (由 Taekjip Ha 團隊所提供)，其操作介面如圖 33 所示。主要是以隱馬可夫模型 (Hidden Markov Model, HMM) 以及 Baum-Welch 演算法為基礎[40]。隱馬可夫模型可以找出隱藏於背景雜訊中的動態變化，Baum-Welch 演算法則是能夠計算出，在已知時間區間內，最有可能的狀態變化。由 HaMMy 軟體，可以判斷單分子是否具有狀態的變化。. 圖 33、HaMMy 程式介面圖，藍線為軌跡圖，綠線則為經演算法所模擬的狀態變化。. 38.

(51) 利用 HMM 擬合過的數據，可以利用軟體 TDP (由 Taekjip Ha 團隊所提供) 。可以統計擬合過狀態變化前後的數值，即起始值與最終值，將結果繪製成轉換密度圖 (transition density plot) 。在密度圖中，將已選定的兩狀態之轉換機率作加總後，使用高斯函數進行擬合，可以得到兩狀態變化得速率常數，如圖 34 所示。. 圖 34、TDP 軟體操作介面圖，橫軸為進行轉換前的 EFRET 值，縱軸為轉換後的 EFRET 值。顏色越接近暖色系，表示轉移機率越高。. 39.

(52) 第三章、實驗結果 3-1 實驗設計本研究之實驗設計圖如圖所示。依照先前研究，重複次數為 19、20 的 CGG 序列具有兩種的髮夾型結構: 對齊髮夾結構 (Blunt-end hairpin) 與露出單組 CGG 的髮夾型結構 (Single-repeat overhang hairpin) [18][23]。將供體螢光基團修飾在 5’端上，而受體螢光基團則修飾在副序列上，如圖 35 所示。這兩種不同的髮夾型結構會讓兩個供體以及受體距離差大約三個核苷酸的距離。因此，對齊的髮夾型結構預期會比與露出單組 CGG 的髮夾型結構得到較高的 EFRET 值，先前的研究也指出此 CGG 序列可能形成鳥嘌呤四聚體[21]，若有此結構的產生則會讓供體與受體距離更遠。因此可以藉由 EFRET 的差異，分辨出不同的構型。. 圖 35、單分子實驗設計圖。. 40.

(53) 3-2 結構鑑定首先以重複次數為 4 到 10、12、16、19、20 的序列進行實驗，實驗條件為 150mM 之鉀離子的環境下。實驗結果如圖 36 所示。實驗結果顯示，不論重複次數為奇數或是偶數，皆能夠得到相當高的 EFRET 值；偶數次數的序列，所得到的 EFRET 值為 0.82；奇數的序列所得到的 EFRET 則為 0.8。即使序列的重複次數增加，這種現象仍然不會有所改變，並且在所有重覆中都能夠發現在較低的 EFRET 區域，有些許的分佈。在這幾條序列中，較特別的序列為(CGG)4，除了在 0.82 有分佈外，在 0.66 上也有些許的分佈。由於其 EFRET 較低，因此有可能為鳥嘌呤四聚體的結構。. 圖 36、不同重複次數的 CGG 序列之直方圖，在鉀離子條件為 150mM 時，所呈現出來得直方圖。由圖可以看出，大部分的分子接呈現很高 EFRET(約在 0.8-0.82 之間)。. 41.

(54) 3-3 髮夾型結構鑑定 CGG 序列的主要構型，其主要的 EFRET 值分別落在 0.8 以及 0.82。依照先前文獻顯示，d(CGG)20 可能形成對齊型的髮夾型結構[18]；d(CGG)19 則是形成露出一個核苷酸的髮夾型結構[23]。依照 Usdin 等人的預測，我們使用 d(CTG)4、與 d(CTG)4T1 作為模擬其構型的序列。先前研究中指出，d(CTG)4 可以形成對齊型的髮夾型結構；d(CTG)4T1 中的胸腺嘧啶 (Thymine, T) 並不會參與前面 CTG 重複序列的折疊，因此會形成露出一個核苷酸之髮夾型結構[27]。將這兩條序列在相同離子濃度的條件下進行實驗，實驗結果如圖 37 所示。實驗結果顯示，單數組的序列與 d(CTG)4T1 之 EFRET 值相同；偶數組之 EFRET 值與 d(CTG)4 的 EFRET 結果較相近，僅相差 0.02，這樣的結果也與先前的預測相符合[18][23]。由於 T1(CTG)4 以及(CTG)4T1 兩條序列所造成的 EFRET 值相同，因此不能夠分辨出的核苷酸是位於 3’端或是 5’端。但實際上畫出序列可能形成的構型後，如圖 38 所示，可以發現若露出的核苷酸是位於 5’端時，鹼基對無法進行配對，不能形成髮夾型的結構。因此可以推斷出，重複次數為奇數的序列，其構型應與(CTG)4T1 相同。. 42.

(55) 圖 37、CGG 序列依重複次數不同分別與 d(CTG)4 以及 d(CTG)4T1 作比較圖。. 圖 38、CGG 序列依重複次數所產生結構示意圖。鹼基間有黑線的部分代表能夠配對。(a) 重複次數為偶數時，會形成對齊的髮夾型結構。(b)重複次數為奇數時畫出的兩種可能結構，類似(CTG)4T1 的結構能有較穩定的鹼基配對，而類似 T1(CTG)4 的構型的鹼基無法配對。. 43.

(56) 3-4 長時間軌跡圖分析各序列的直方圖後可以發現，除了主要的構型之外，在較低 EFRET 的也有些許的分佈。為了確認這些少量的事件是否真實存在，可以分析長時間軌跡圖 (3000 frames, 30fps)，如圖 39 所示。從圖中可以發現，在較短序列經由 HMM 擬合過後，約 90%的分子，其 EFRET 值呈現穩定在 0.82 以及 0.8 的位置。隨著重複次數的增加至 19 次時，開始出現 EFRET 跳動的現象，其跳動為 0.8 至 0.72 兩者間互相轉換。由於 0.72 的 EFRET 值較高，並且在鋰離子的條件下，也能夠發現這種跳動，我們根據先前文獻可知鳥嘌呤四聚體於鋰離子中不易形成[45]，因此可以推斷 EFRET 為 0.72 的結構不為鳥嘌呤四聚體，但可能為不對齊的髮夾型結構。這種跳動的模式，可能為三核苷酸重複序列的滑動現象，這種形式的滑動也能夠在 CTG 序列中觀察到[27]。. 圖 39、部分 CGG 序列長時間軌跡圖，紅線為 Cy5 的螢光放光強度；綠線為 Cy3 的螢光放光強度；灰線為計算出來的 EFRET 值；與灰線重疊的紅線則為利用 HMM 擬合出的結果。. 44.

(57) 3-5 鳥嘌呤四聚體結構鑑定為了確認 d(CGG)4 中 EFRET 為 0.66 的構型是否為鳥嘌呤四聚體，可以利用鳥嘌呤四聚體的特性。根據先前文獻，這種特殊的二級結構對於離子的種類相當敏銳。大部分只有在鉀離子存在下，才有可能會形成鳥嘌呤四聚體的結構：相對地，在離子半徑較小的鋰離子中，則無法形成[45]。利用這點特性，我們置換溶液中鹽類的條件，來判斷 DNA 構型是否真的為鳥嘌呤四聚體。實驗結果如圖 40 所示，d(CGG) 4 在鉀離子條件下出現 EFRET 值接近 0.82 以及 0.66 的兩種結構，而鋰離子的條件下僅有一個較高的 EFRET 值。如前所述，在鋰離子的環境中鳥嘌呤四聚體結構不易形成，因此我們可從這兩組實驗的比較中，推測 EFRET 值為 0.66 的構型，有可能為鳥嘌呤四聚體。為了做更近一步地確認，我們在進行實驗前，在 DNA 溶液中加入 PDS (pyridostatin)，PDS 可以誘發序列摺疊成鳥嘌呤四聚體 [46]，並且與實驗中的影像緩衝液有良好的相容性，因此可以用於本研究中。. 圖 40、d(CGG)4 在不同條件下，所得到的直方圖。藍色直方圖為僅含有金屬離子。粉紅色則為有加入 PDS 的情況。. 45.

(58) 首先在實驗進行時加入 10nM 的 PDS 並維持相同的鉀離子條件，可以發現 d(CGG)4 中，較低 EFRET 的分佈明顯有增加的趨勢。雖新增的 EFRET 分佈峰值位於 0.56，較我們認為的鳥嘌呤四聚體峰值 0.66 稍低，應為 PDS 嵌入在鳥嘌呤四聚體，而造成其結構些微的改變[47]，其結合方式如圖 41 所示。因此，相較於沒有小分子纏繞的情況，有 PDS 的鳥嘌呤四聚體構型會被撐開，造成更低的 EFRET 值。將 PDS 的濃度增加到 100nM，d(CGG)4 幾乎全部的分佈會集中在 EFRET 為 0.56 的狀態；這也顯示，隨著 PDS 濃度的增加，會更容易誘發出鳥嘌呤四聚體結構的生成。. 圖 41、PDS 嵌入於 DNA 序列中的示意圖。圖中的配體 (ligand) 為 PDS。圖中右側的複合體 (complex) 則為兩者結合後的構型[47]。. 46.

(59) 由這幾組實驗的結果，我們可以知道 d(CGG)4 中的兩個構型確實為對齊型的髮夾型結構以及鳥嘌呤四聚體。這兩種構型，也正是先前文獻中所做出的預測。為了進一步研究其鳥嘌呤四聚體的詳細結構，我們使用(CGGAGG)2 序列 (ca2，詳見表格 4) 進行實驗。先前的文獻中指出，這條序列的主要構型為平行結構的鳥嘌呤四聚體[27]，再加上其序列長度與 d(CGG)4 相同。因此最能夠模擬 d(CGG)4 的情況。從實驗結果也發現，ca2 的 EFRET 為 0.66，與 d(CGG)4 相同。為了進一步確認 ca2 的構型是否與鳥嘌呤四聚體，我們將 ca2 中加入 100nM 的 PDS 進入影像緩衝溶液中，實驗結果如圖 42 所示，EFRET 值也會從原本的 0.66 下降至 0.56。這樣的結果與 d(CGG)4 相同，因此也間接確認 d(CGG)4 的另一種構型為鳥嘌呤四聚體結構。. 圖 42、ca2 在鉀離子 150 mM 中以及加入 PDS 的直方圖。. 47.

(60) 由上述的實驗中，可以知道 d(CGG)4 可以形成鳥嘌呤四聚體。為了確認其他重複次數的序列是否也有相同的情況，也將其他序列加入 PDS 進行實驗。首先，在 10nM 的 PDS 中，實驗結果如圖 43 所示。由 EFRET 直方圖可以看到，相較於 d(CGG)4，其他的序列的 EFRET 值還是以 0.8 以及 0.82 為主。與之前的實驗中對照，可以發現即使加入 10nM 的 PDS，也不容易使 CGG 重複序列生成鳥嘌呤四聚體。若是將 PDS 的濃度上升至 100nM 進行實驗，實驗結果如圖 44 所示。在重複次數較小的序列當中，EFRET 值會出現比 0.56 低的數值。這也代表說其他序列有被 PDS 所誘導出鳥嘌呤四聚體的結構。其中 d(CGG)4 與 d(CGG)10 這兩條序列，摺疊成以鳥嘌呤四聚體構型為主的二級結構。一旦重複次數大於 12 時，僅會有 0.8 以及 0.82 的 EFRET，這樣的結果顯示，較長的序列即使在高濃度的 PDS 誘導下，仍不會產生鳥嘌呤四聚體，此結果也與先前的研究相符合[21]。另外，我們可以發現隨著序列增長，鳥嘌呤四聚體所產生的 EFRET 值也會下降，可能為部分序列未參與鳥嘌呤四聚體鍵結的片段則會突出於結構，而導致平均距離增長。. 圖 43、其他序列在 PDS 為 10nM 時的情況之實驗結果圖。從直方圖中可以發現，除了 d(CGG)4 以外，其他序列皆不易生成鳥嘌呤四聚體的結構。. 48.

(61) 圖 44、其他重複次數之 CGG 序列，在 100nM 的 PDS 進行實驗所得到的直方圖。. 49.

(62) 3-6 插入 AGG 之 CGG 序列 3-6.1 插入單組 AGG 之 CGG 序列在先前的文獻中，AGG 對於 CGG 序列的構型有一定的影響。首先，我們以 d(CGG)9 為模板，分別將第四段以及第五段 CGG 改變成 AGG，分別形成 (CGG)3AGG(CGG)5 和(CGG)4AGG(CGG)4，詳見表格 4 中的 C3AC5 與 C4AC4。藉此希望可以與正常的 CGG 序列作為比較，找出 AGG 如何影響正常 CGG 序列。從圖 44 可以發現，單純在鉀離子或是鋰離子的條件下，皆與正常的 CGG 序列不同。除了有 EFRET 為 0.8 的構型外，在較低 EFRET 的區域中，也出現不同分佈。以(CGG)4AGG(CGG)4 來說，在兩種離子的條件下，差異在於低 EFRET 的區域。如圖 45(A)所示，在鉀離子的條件下，兩個分佈可明顯區分；相對地，在鋰離子的條件下，兩個分佈相連而較不易區分。若加入 10nM 的 PDS，實驗的結果也與單純僅有鉀離子的情況相同。從這含有鉀離子與 PDS 的兩組實驗與鋰離子的實驗比較，可以推測可能(CGG)4AGG(CGG)4 仍有鳥嘌呤四聚體的生成，但由於鋰離子的實驗中，可能形成的其中一種髮夾型結構與鳥嘌呤四聚體所產生的 EFRET 值太過相近，以致於鋰離子的實驗中較低的 EFRET 值無法完全去除。為了進一步證明可能有鳥嘌呤四聚體的形成，我們再將含有 PDS 的 C4AC4 沖入鉀離子，經長時間的等待之後，仍發現 PDS 較低的 EFRET 值有削減的情形。因此我們推測此(CGG)4AGG(CGG)4 可能折疊成兩種髮夾型結構與鳥嘌呤四聚體，只是由於這兩種構型所貢獻出的 EFRET 非常相近，而無法直接於直方圖中將兩者峰值分開。另一方面，(CGG)3AGG(CGG)5 之實驗結果如圖 45(B)所示，在鋰離子條件下能夠觀察到觀察到的兩個髮夾結構分佈(EFRET=0.66 與 0.84)，但是在鉀離子的條件下多了一個 EFRET 峰值為 0.44 的構型。在 10nM 的 PDS 下，也能夠觀察到此. 50.

(63) 構型。經由這兩條序列，我們可以知道插入 AGG 的 CGG 序列，能夠產生出兩種髮夾型結構與鳥嘌呤四聚體。. 圖 45、(CGG)3AGG(CGG)5 與(CGG)4AGG(CGG)4 之實驗結果圖。. 51.

(64) 接著分別將 d(CGG) 19 與 d(CGG)27 的第九段以及第十四段 CGG 改成 AGG，形成(CGG)9AGG(CGG)9 與(CGG)13AGG(CGG)13 (詳見表格 4)，藉此去模擬重複序列增長的情況，實驗結果如圖 46 所示。不同於一般的 CGG 序列，在鉀或是鋰離子的條件下，其 EFRET 的分佈皆是相同的。這也代表，此兩種構型很有可能不為鳥嘌呤四聚體結構。為了做進一步地確認，我們將 PDS 加入這兩條序列之中。與單純的 CGG 序列相同，加入 100 nM 的 PDS 進入溶液中，並不會有太大的變化。直到加入的 PDS 變為 100nＭ時，才會出現鳥嘌呤四聚體結構，而且這種構型所貢獻的 EFRET 值大約在 0.1。從長時間軌跡圖中可以發現，如圖 47 所示，大約 95%的分子，其 EFRET 主要落在 0.82 或是 0.72，而且這兩種構型也會互相轉換。相較於正常的 CGG 序列，EFRET 的跳動也比正常序列頻繁，此一跳動極有可能是重複序列的滑動現象 [27]。由這些實驗結果得知，插入 AGG 後的序列，其結構的平衡會偏向以露出一組 CGG 之髮夾型結構。. 52.

(65) 圖 46、(CGG)9AGG(CGG)9 與(CGG)13AGG(CGG)13 在不同條件下所得到的直方圖。由圖可以看出，延長序列後，將不容易誘導出鳥嘌呤四聚體結結構。. 圖 47、(CGG)9AGG(CGG)與(CGG)13AGG(CGG)13 在鉀離子條件下的長時間軌跡圖。. 53.

(66) 將長時間軌跡圖進行 HMM 分析後，並繪製成轉換機率密度圖，如圖 48 所示。圖中為分析正常的 CGG 序列以及插入 AGG 之 CGG 序列的結果。左圖中可以看到，插入 AGG 之序列出現兩個主峰，兩者的發生次數也相當多。在右下角的主峰，起始值為 0.82，終點則是 0.72；另一個主峰則剛好相反，起始值為 0.72 而終點值為 0.82。這樣的分析結果也說明這兩種不同的構型，會彼此間進行互相轉換。而正常的 CGG 序列也有相同位置的兩主峰，也具有跳動的現象，但是其跳動事件較少。. 圖 48、d(CGG)19 與(CGG)9AGG(CGG)9 之機率轉換密度圖。X 軸為起始的 EFRET 值；Y 軸為變化後的 EFRET 值。. 54.

(67) 3-6.2 插入雙組 AGG 之 CGG 序列為了模擬在人體中真實的序列，我們將插入 AGG 的次數增多，設計出插入兩個 AGG 的 CGG 序列，分別是 (CGG)4AGG(CGG)9AGG(CGG)4 、 (CGG)4AGG(CGG)9AGG(CGG)9、(CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)9，三者有不同的插入頻率；進行實驗的條件也與先前實驗相同，實驗結果如圖 49 所示。從 EFRET 直方圖可以發現不同的插入次數，EFRET 直方圖皆與正常的 CGG 序列有所差異。一旦插入 AGG 後，會產生出 EFRET 較低的構型，並且隨著插入次數增加，比例會有所提升。. 圖 49、插入 AGG 之 CGG 序列與正常 CGG 序列之比較圖。淺藍色直方圖為插入 AGG 的 CGG 在鉀 150mM 下進行實驗所得到的直方圖。淺灰色線條為 d(CGG)9 在相同條件下的 EFRET 分佈。深灰色為 d(CGG)19 在相同條件下的 EFRET 分佈。. 55.

(68) 根據先前 Delaney 團隊的研究成果，(CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)9 擁有較低 EFRET 的構型髮夾型結構。為了確認此構型是否為鳥嘌呤四聚體結構，一樣可以在影像緩衝溶液中加入 PDS 來驗證。實驗結果如圖 50 所示。由實驗結果可以發現，不論是溶液中不論是有鉀離子或是鋰離子，其 EFRET 的分佈都相同的。若是加入 100nM 的 PDS 進入溶液中，僅僅只有 C4AC9AC4 會明顯多一個分佈出來，其 EFRET 值大約為 0.26。隨著重複次數的增加，所形成鳥嘌呤四聚體的 EFRET 值也會下降。這個數值也與較短的 CGG 序列的結果相同。從實驗結果可以推斷出，EFRET 為 0.68 的構型並不是鳥嘌呤四聚體。其結構應該為另一種髮夾型結構，根據實驗所得到的 EFRET 值以及先前的文獻，其結構有可能為露出一組 CGG 的髮夾型結構，如圖 11(B)所示。. 圖 50 、由左至右分別為 (CGG)4AGG(CGG)9AGG(CGG)4 、 (CGG)4AGG(CGG)9AGG(CGG)9 、 (CGG)9AGG(CGG)9AGG(CGG)9 這三條序列分別在鉀離子、鋰離子、PDS 中，所得到的 EFRET 直方圖。. 56.

(69) 從先前的實驗所得到的結果，有插入 AGG 的 CGG 序列會形成多種的髮夾型結構，這也符合 Delaney 團隊所發表的結果[23]。從長時間軌跡圖可以發現，如圖 51，AGG 的插入會使構型之間發生互相轉換的現象。一旦 AGG 插入的數目增加為兩組時，反而不會出現構型之間的轉換。這些序列會穩定在 EFRET 為 0.68 的結構。這較低的 EFRET 峰值，有可能是因為 AGG 序列並不會產生鍵結，因此結構較正常 CGG 鬆散，使得距離較遠，因此會產生出更低的 EFRET 值。有趣的是，即使插入 AGG 序列的頻率不同，序列所形成的構型也會相同；就動力學而言，這些序列也會有相同的行為。從這些實驗中我們可以發現，插入 AGG 的 CGG 與正常的 CGG 序列相同，並不會有產生鳥嘌呤四聚體的構型。. 圖 51、插入 AGG 之 CGG 序列在鉀離子 150mM 下錄製的長時間軌跡圖。當插入兩組 AGG 後，EFRET 就不會出現跳動的現象。. 57.