第一章、緒論
1-1 前言
現今許多遺傳疾病被發現是與三核苷酸的擴張有關，在正常人的體內中，
也可以發現這些三核苷酸重複序列，並且這些序列皆會保持在一定的數目，一 旦這些三核苷酸重複序列擴張到某一定的程度，就會產生遺傳疾病[1]，如表格 1 所示。現今臨床上最有名的例子為亨丁頓舞蹈症 (Huntington Disease) ，其對 應到的序列是由於位在人類第四對染色體上的編碼區出現 CAG 重複序列。在 正常人體內，CAG 重複序列的次數少於 26；當 CAG 重複次數超過 37 以上時 就會發病；在第 19 對染色體上的 DMPK 基因也有相似的情況，在這段基因中 可以找到 CTG 重複序列，而其對應到的疾病為強直性肌肉失養症(Myotonic dystrophy)。
表格 1、三重複序列與其對應到的疾病，摘錄自[1]。
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在人體的 FMR1 基因也存在著相似的序列(如圖 1)，在此基因上可以發現 CGG/CCG 重複序列。在正常人的體內中，CGG/CCG 三核苷酸的重複次數落在 5 至 44 間，在此重複次數下，序列會穩定的遺傳至子代;序列擴張至 60 到 200 之 間，則稱為前突變 (permutation) 。在這個狀態下，雖然個體不會產生疾病，但 是序列會發生不穩定的現象並且會遺傳至子代。一旦在個體內的序列超過 200 時，
就會產生 X 染色體易碎症 (Fragile X Syndrome)，簡稱為 FXS[5]。
圖 1、人類 X 染色體示意圖。鍵頭所指的位置是 Xq27.3，為 FMR1 所處的位置，摘錄自[5]。
對於遺傳疾病的研究，序列的擴張就顯得十分重要。DNA 的擴張，可以用以 下理論作解釋。在 DNA 複製過程中，DNA 解螺旋酶會先解開一般的雙股螺旋結 構；這個時候，就會形成複製叉 (replication fork) 的結構，如圖 2 所示[4]。
圖 2、複製叉(replication fork)示意圖，正六邊形為 DNA 解螺旋酶、橢圓為 DNA 聚合酶，摘錄 自[4]。
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圖 4、DNA 不正常複製之示意圖。DNA 複製過程中，因分別在領先股以及延遲股產生二級結 構，而造成不正常的擴張或縮短，摘錄自[3]。
隨著科學家針對 DNA 構型的深入研究，發現 DNA 除了典型的雙股螺旋外，
也會產生二級結構[3]，如圖 5 所示。以(CNG)n為例 (N = A, T, C, G) ，在先前的 研究中，(CTG)n與(CAG)n會折疊成類似髮夾型的二級結構。有趣的是(CTG)n的 類髮夾型結構間會有滑動的現象，而目前認為這樣的滑動現象是造成序列擴張的 一個關鍵因素[2][4]。因此，研究 CGG/CCG 三核苷酸序列的擴張原因，可以從 探討此三核苷酸序列會折疊成的二級結構開始。
圖 5、連續 DNA 可能形成之二級結構示意圖，摘錄自[1]。
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在 1977 年 Sutherland 對於 X 染色體的易碎做了更進一步的分析，他的研究 報告指出，在缺乏葉酸以及胸腺嘧啶的條件下培養，可以使這種 X 染色體易碎 的現象表達出來[11]。在 1985 年，Pembrey、Winter 以及 Davies 等人發現患者的 親代基因雖然有影響，但外表卻不會有任何的異常，染色體方面也沒有碎裂的情 況發生，這也顯示親代與子代間的差異[13]。經過多年的研究，才確認其主要病 是因為在 FMR1 基因的 5’端非轉譯區出現大量的 CGG 重複序列；然而基因圖譜 研究中，在正常人的體內中，CGG 重複序列除了在穩定的重複次數下；也可以 發現 CGG 重複序列中會被 AGG 所打斷。大約每 9 至 10 個 CGG，就會出現一 個 AGG。因此在正常人的體內中，(CGG)9AGG(CGG)9AGG...可以輕易的在 FMR1 的 5’端非轉譯區中發現[5]。因此 AGG 的插入對於結構及其動態有何影響 是我們極欲想了解的。
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1-3 致病原因
在 1991 年 FMR1 的基因 Verkerk AJ 團隊轉殖出來。他們除了發現有大量重複 CGG 片段外，也發現病患 X 染色體 Xq27.3 位置的 CpG 島，如圖 7 所示。有過 甲基化的現象 (hypermethylation) [12]。甲基化係指 DNA 上的胞嘧啶 (cytosine) 會經過甲基轉移酶修飾，增加一個甲基，如圖 8 所示。甲基化為生物體中一種調 控基因表現的一種模式，經過甲基化的基因會變得不活化 (deactivation) ，抑制 基因的表達。
圖 7、 CpG 島示意圖。CpG 島是指 DNA 上的區域，此區域含有大量相鄰的胞嘧啶以及鳥嘌呤，
兩者間以磷酸酯鍵相連，如圖中灰色區塊。大量通常是 50%以上，不同種的生物比例會有所不 同，摘錄自[49]。
圖 8、DNA 甲基化示意圖。左邊為胞嘧啶(cytosine)，右邊為經甲基 化的胞嘧啶(methylated cytosine) ，摘錄自[42]。
8 蛋白修飾 (histone modification) [19]。組蛋白為一種存在於真核生物中的一種蛋 白，其功能為包裝以及組織 DNA，DNA 與組蛋白的結合體稱為核小體。核小體 對於基因的表現扮演著重要的角色。組蛋白可以藉由組蛋白乙醯轉移酶 (histone acetyltransferase, HAT) 進行乙醯化，乙醯化的後的組蛋白，會使得 DNA 纏繞變 得鬆散，使得轉錄因子可以能夠與 DNA 結合，促進基因表現；經乙醯化的組蛋 白也可以經過組蛋白去乙醯轉移酶(histone deacetylase) 去乙醯化，以抑制基因表 達[20]，如圖 9 所示。這樣一系列的影響，就會讓 FMR1 的啟動子不易進行轉錄 作用，使得患者體內失去基因產物，進而發生疾病[19]。
圖 9、組蛋白乙醯化以及去乙醯化示意圖。黃色柱體為組蛋白；白色線條為 DNA 序列；HDAC 為組蛋白去乙醯化轉移酶；HAT 為組蛋白乙醯化轉移 酶，摘錄自[20]。
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1-4 已解出的 CGG/CCG 之二級結構
有關於 CGG 三核苷酸重複序列的構型，一直以來都存在著爭議。不過總體 而言可以分為兩派說法。一派的人認為，CGG 結構應該與 CNG (N 可以為 A、
T、C、G) 結構相同。會折成髮夾型結構[16]。但由於 CGG 重複序列富含鳥嘌 呤 (guanine) ，因此也有人認為鳥嘌呤四聯體 (G-quadruplex) 也是一種 CGG 可 能會形成的二級結構[21]，詳見 1-4.2。
第二，從紫外-可見光吸收光譜 (UV/Vis absorbance spectroscopy) 發現 CGG 的結 構與鳥嘌呤四聯體有相當大的差異。他們表示，CGG 序列的結構應該為髮夾型 結構[24]。
圖 10、髮夾型結構示意圖，摘錄自[44]。
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2010 年，Sarah Delaney 團隊利用膠體電泳 (Gel electrophoresis) 與硫酸二 甲酯分析 (dimethyl sulfate footprinting) 分析 d(CGG)19以及 d(CGG)39的構型。
實驗結果顯示，這兩條序列皆會折疊成髮夾型結構；插入 AGG 的 CGG 序列，
則有可能形成有兩個環 (loop) 的特殊髮夾型結構，如圖 11 所示[23]。
圖 11、Delaney 團隊之研究成示意圖。(A)(B)d(CGG)19之構型(C)插 AGG 的 CGG 序列所產生的 特殊髮夾型結構，摘錄自[23]。
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1-4.2 鳥嘌呤四聚體
鳥嘌呤四聯體為一種富含鳥嘌呤的 DNA 序列在特定的離子條件下才會發生 的二級結構，並以四個鳥嘌呤為單位形成 G-quartet，數個 G-quartet 堆積起來就 會形成鳥嘌呤四聯體，如圖 12 所示。不同於典型的雙股螺旋結構，鹼基對以 Watson-Crick 鍵結模式鍵結。鳥嘌呤四聯體上的鳥嘌呤是以 Hoogsteen 的鍵結模 式並且在平面的中心存在著陽離子，可以分散鳥嘌呤上的靜電力，減少負電的排 斥力。目前也被證實，鉀離子對於穩定鳥嘌呤四聚體結構有相當好的效果[17]。
圖 12、鳥嘌呤四聚體結構示意圖。左圖為四個鳥嘌呤經由Hoogsteen氫鍵所形成的G-quartet，
中心具有陽離子穩定結構。右圖為 G-quartet 堆積而成的鳥嘌呤四聚體結構，摘錄自[43]。
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1995 年，Usdin 團隊以膠體電泳 (Gel electrophoresis) 與硫酸二甲酯分析 (dimethyl sulfate footprinting) 分析 d(CGG)20在不同離子條件下的構型。實驗結果 顯示 d(CGG)20在鉀離子的條件下會形成特殊的結構，並且會阻礙體外的 DNA 合 成；而在其他的鈉離子以及銨離子的條件下不會阻礙 DNA 合成。利用硫酸二甲 酯分析，更進一步的推測，在鉀離子的條件下會形成鳥嘌呤四聚體的結構；在其 他離子條件則會形成類似頭對頭的髮夾型結構，如圖 13 所示 ，但他們也無法判 斷出何者為主要構型[18]。
圖 13、Usdin 團隊所解出(CGG)20的構型。(A)髮夾型結構(B)鳥嘌呤四股結構，摘錄自 [18]。
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2009 年，Michaela Vol 團隊利用圓二色光譜測定 CGG 重複序列的構型。他 們發現，隨著序列的延長，鳥嘌呤四聯體的特性就越不顯著，這也與其他先前的 研究相吻合[25]。但是在短序列中 (重複次數為 4 以及 8) ，可以在高鉀離子的濃 度下誘導出鳥嘌呤四聚體。而插入 AGG 的 CGG 序列，在相同的條件下，也可 以擁有相同的結果，其實驗結果如圖 14 所示[21]。
圖 14、Michaela 團隊以圓二色光譜觀測 CGG 序列以及插入 AGG 之 CGG 序列的構型。(A)插入 AGG 之 CGG 序列(B)CGG 序列，兩者皆會形成平行結構的鳥嘌呤四聚體。
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1-5 研究動機
染色體為一種遺傳性疾病，其病因為 CGG 的不正常擴張。在 DNA 的擴張 理論中，二級結構及其動態滑動扮演著重要的角色[26]。但是由於序列擴張所造 成的遺傳疾病沒有一個有效的治療方式[3]。因此若能了解出其 DNA 構型，對於 CGG 擴張的模式會有相當大的幫助。在人體中常被發現的插入 AGG 的 CGG 序 列來說，也沒有文獻清楚地指出 AGG 對於一般 CGG 序列的影響。
由先前的研究可以得知 CGG 三重複序列雖然在不同條件下，構型會有所不 同。大部分的文獻指出，CGG 的二級結構以髮夾型結構以及鳥嘌呤四聚體為主。
但是以往的測量方法皆屬於巨觀的觀測結果，且 CGG 重複序列可能因同時具有 不同構型狀態而不容易解析。因此，此研究以單分子螢光光譜去測定 CGG 以及 插入 AGG 的 CGG 序列的構型及其動態，進行對 CGG 序列長度與 AGG 插入頻 率做一系統性的研究，以找出 AGG 對於此擴張序列之影響。
15 振能量轉移 (single-molecule fluorescence resonance energy transfer, smFRET) 搭 配全內反射顯微鏡去研究 CGG 三重複序列的構型。