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一、 視神經萎縮症病人淋巴球細胞表現突變型的 OPA1 基因
分析 2 個視神經萎縮症家族病人的淋巴球細胞 OPA1 mRNA 基因 型態。發現視神經萎縮症家族(ADOA Family Ι)的病人在 OPA1 基因 第10 個外顯子(exon)上發生斷損(deletion)，利用 RT-PCR 技術，放大 OPA1 cDNA exon 8 (RT 10F)到 exon 13 (RT 10R)片段，除了產生正常
相較於正常人(normal control)或是家族中未發生 OPA1 基因突變的人 (internal control)，分別在兩個視神經萎縮症家族的病人淋巴球細胞中 均表現較低量的OPA1 mRNA(Fig. 6b,c)。分析第一個家族，相對於 control 組表現以及 F1C(ADOA Family Ι internal control)
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(92.68%±0.09%，n=3，p>0.05)的 OPA1 mRNA，F1P(ADOA Family Ι patient)則表現 70.73%±0.04%(n=3，p<0.05)低量的 OPA1 mRNA。分 析第二個家族，與 control 組，F2C1(ADOA Family ΙΙ internal control 1) (101.12%±0.81%，n=3，p>0.05)以及 F2C2(ADOA Family ΙΙ internal control 2) (93.92%±0.055% n=3，p>0.05) OPA1 mRNA 做比較，
F2P1(ADOA Family ΙΙ patient 1) 跟 F2P2(ADOA Family ΙΙ patient 2)表 現82.81%±0.02% (n=3，p<0.05) 與 84.42%±0.03%(n=3，p<0.05)相對 低量的OPA1 mRNA。
三、 視神經萎縮症病人淋巴球細胞影響 OPA1 蛋白的總表現量 視神經萎縮症病人淋巴球細胞表現突變型的OPA1 基因，不僅影響到 OPA1 mRNA 的總表現量，也影響 OPA1 蛋白的總表現量(Fig7.a,b)。
利用SDS-PAGE 所分出五個不同大小(85~98 Kd)的 OPA1 蛋白，在視 神經萎縮症病人淋巴球細胞表現量明顯偏低。分析第一個視神經萎縮 症家族的OPA1 蛋白表現量，F1P 的表現量 74.98%±0.004%(n=3，
p<0.01)明顯低於 control 組及 F1C (91.50%±0.07% ，n=3，p>0.05)所
表現的OPA1 蛋白。在第二個視神經萎縮症家族中也可以看到類似的 情形，F2P1 跟 F2P2 表現 87.36%±0.003%(n=3，p<0.01)與
86.98%±0.002%(n=3，p<0.01)的 OPA1 蛋白，也是低於 control 組、
F2C1(101.52%±0.31% ，n=3，p>0.05)以及 F2C2(101.58%±0.39%，n=3，
40 control 以及 F1C(86.24%±0.30% ，n=3，p>0.05)。第二個視神經萎縮 症家族病人細胞的膜電位，F2P1 為 49.97%±0.008%(n=3，p<0.01)，
F2P2 為 52.33%±0.02%(n=3，p<0.05)也是低於 control、F2C1
(84.67%±0.22%，n=3，p>0.05)以及 F2C2(90.33%±0.31%，n=3，p>0.05) 的膜電位。
五、
OPA1 基因突變使粒線體 DNA copy number 減少
進一步分析粒線體DNA copy number 是否會受 OPA1 基因突變的影響 (Fig. 9)。以 real-time PCR 偵測粒線體 DNA 序列中較不容易突變的一 段序列ND1，再以 house-keeping gene (β-globin) normalization，得到
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相對比值。與正常細胞(control)的比較，F1P 只有 control 的
0.71±0.03(n=3，p<0.05)倍，低於 F1C 的 0.96±0.71( n=3，p>0.05)倍。
F2P1 的 0.65±0.008 (n=3，p<0.01)倍跟 F2P2 的 0.66±0.005(n=3，p<0.01) 倍也都低於F2C1 的0.93±0.27( n=3，p>0.05)倍和 F2C2 的
0.89±0.05( n=3，p>0.05)倍。結果顯示，在視神經萎縮症病人淋巴球 細胞中，OPA1 突變會使粒線體 DNA copy number 減少。
六、
OPA1 基因突變使粒線體總數量(mitochondrial mass)減少
OPA1 基因突變也會造成粒線體總數量的減少(Fig. 10)。本實驗直接使 用染劑10-n-nonyl-acridine orange (NAO)，以流式細胞儀偵測細胞內 活性較好的粒線體數量。先比較第一個視神經萎縮症家族，control 組的螢光平均值(mean of fluorescence, MFI)為 1138±0.00，F1C 為 1141±0.74( n=3，p>0.05)，而 F1P 為 1084±0.02(n=3，p<0.05)則有些 微下降的情形。再比較第二個視神經萎縮症家族，F2P1 為1058±0.005(n=3，p<0.01)以及 F2P2 為 1080±0.02 (n=3，p<0.05)，也 都低於control 組的 1164±0.00，F2C1 的 1137±0.17( n=3，p>0.05)跟 F2C2 的 1179±0.48( n=3，p>0.05)。
七、 OPA1 基因突變影響粒線體 ATP 合成能力
為探討 OPA1 基因突變是否影響細胞中粒線體的功能，我們使用
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ATPlite kit 和冷光測定儀偵測細胞內 ATP 含量(ATP content) (Fig.11)。
第一個家族中，control 組每 2×105個細胞的ATP 含量為 28.53±0.00μM，
F1C 為 26.23±0.32 ( n=3，p>0.05) μM，在 F1P 則偵測到明顯低量的 ATP 含量，為 16.06±0.03 (n=3，p<0.05) μM。同樣在第二個家族中，
F2P1 跟 F2P2 的 ATP 含量 19.86±0.04(n=3，p<0.05)、15.54±0.01(n=3，
p<0.05)也是少於 control 的 26.87±0.00，F2C1 的 26.39±0.42( n=3，
p>0.05)跟 F2C2 的 24.25±0.20( n=3，p>0.05) ATP 含量(μM)。實驗結
果顯示，OPA1 基因突變確實也會影響粒線體生成 ATP 的功能，使產 量變少。
八、
OPA1 基因突變造成細胞脂質氧化性傷害增加
觀察OPA1 基因突變是否會使細胞氧化性傷害(oxidative damages)增 加，以 BODIPY 測定細胞膜脂質的過氧化性(lipid peroxidation)，經流 式細胞儀分析分析後(Fig.12)，第一個家族，在病人細胞中所偵測到 的螢光平均值為101±0.01(n=3，p<0.05)，高於 control 組的 85±0.00，
以及F1C 的 90±0.06( n=3，p>0.05)。在第二個家族裡，F2P1 跟 F2P2 的螢光平均106.33±0.007 (n=3，p<0.01)、103.67±0.009(n=3，p<0.01)，
也是高於control 組的 85±0.00、F2C1 的 87.33±0.11( n=3，p>0.05)跟 F2C2 的 90.67±0.107( n=3，p>0.05)。經由本實驗我們發現，OPA1 基 因突變會使得細胞的氧化性傷害增加的，在兩個家族中的視神經萎縮
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症病人細胞均看到這樣的情形。
九、
OPA1 基因突變對粒線體融合(fusion)與分裂(fission)的影響
另外我們使用雷射共軛焦顯微鏡來觀察各細胞粒線體的型(Fig.13a)，分別以絲狀(tubulan)、中間型(intermediated)、點狀(fragmented)各型態 比例作區分(Fig.13b)。Control 組細胞的粒線體呈現比例為
59%:18%:23%，大多數為絲狀的型態；F1C 細胞粒線體的比例
61%:13%:26%，以及 F2C 細胞的比例 55%:22%:23%，也和 control 組 相類似，都以絲狀的粒線體型態為主，少數才呈現中間型及點狀型態 的粒線體；而F1P 跟 F2P 細胞粒線體型態明顯不同於 control 組以及 各個家族的internal control 組，呈現大量點狀粒線體型態的細胞，分 別比例為14%:13%:73%以及 13%:15%:72%。依據觀察結果顯示，在 (113%)跟 control 組細胞。而 F2P1(45.2%)以及 F2P2(60.3%)也都明顯
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低於 control 組，以及 F2C1(94.3%)、F2C2(75.4%)的耗氧率。我們發 現OPA1 基因突變是會影響粒線體氧化磷酸化反應的進行，使得細胞 耗氧率降低。
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