第二章 藥品試劑…
五、 測定粒線體 DNA 拷貝數(mtDNA copy number)
收集1 x 106個細胞，離心吸去培養液，後先以PBS 清洗，加入 含有10mM Tris-HCl EDTA (pH 8.0)、1.5% SDS、10 mM RNase A 及 2 M butylated hydroxytoluene (BHT)的分解液在 37℃下作用 1 小時後，
再加入10 mM proteinase K 的分解液在 56℃下作用 2~12 小時，取等 體積的酚(phenol) 與標本混合均勻，以 8500×g 離心 5 分鐘後，萃取
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上清液，再取等體積的酚-氯仿(phenol：chloroform：isoamylalcohol , 25:24:1 , v:v:v) 均勻混合，以 8500×g 離心 5 分鐘後萃取上清液，重 複 此 步 驟 1 至 2 次 ， 之 後 再 取 等 體 積 的 氯 仿 (chloroform ： isoamylalcohol , 24:1 , v:v) 均勻混合，以 8500×g 離心 5 分鐘後萃取上 清液，以去除蛋白質等雜質。完成以上步驟的萃取液，再與等體積的 異 丙 醇(isopropanol) 及 1/10 (v/v) 的 3 M 醋 酸 鈉 (sodium acetate, (NH4)2SO4, NaOAc, pH 5.4)混合後，置於-20℃沉澱(precipitation) 8~12 小時。在 4℃下 8500×g 離心 10 分鐘，除去上清液後，以 75%酒精洗 去沉澱物中的殘留鹽類，經風乾後，將 DNA 溶於適量的二次水中。
測量DNA 吸光值 OD260與 OD280的比值，計算並定量DNA 濃度。
2.
Real-time Quantitative PCR取 50 ng/μl DNA 1μl 和下列試劑混合：10 pmole target-specific primer 2μl、SYBR Green I 1μl、MgCl2 1.2μl、H2O 4.8μl。Real-time quatitative PCR 設定條件如下：Heart start 94℃ 5 分鐘，接下來為 31 個循環週次的設定條件，94℃ 30 秒、62℃ 30 秒、72℃ 30 秒、79℃ 2 分鐘。結果使用 LightCycler Analysis 分析。所用 DNA 引子列於 Table 1.
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六、 分析細胞內
RNA 表現
1. RNA 的抽取與純化所 有 使 用 的 器 具 均 以 RNaesZAP 處 理 ， 以 除 去 RNaes ， 再 使 用 QIAGEN RNeasy Mini Kit，首先將Buffer RLT與β-mercaptoethanol以 100:1混合，加入350或600 μl 混合液於已處理好之細胞中，混合均勻 後，加入同體積的70%酒精，再次均勻混合，吸取到RNeasy mini column中，離心8000×g，15秒，倒掉濾液。加入700μl Buffer RW1到 mini column中，離心8000×g ，15秒，倒掉濾液。加入500 μl Buffer RPE 到mini column，離心8000×g，2分鐘，倒掉濾液，更換新的離心管，
再離心8500×g ，1分鐘，確保未殘留試劑於column。最後換新的離心 管，在column中加入30-50 μl RNase-free water，靜置一分鐘後，離心 10000×g 1分鐘，所得濾液即為RNA萃取液，可測量RNA 吸光值OD260
與OD280的比值，計算並定量RNA濃度。
2. 轉錄聚合酵素鏈鎖反應（Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）
以1μg RNA在50 μl反應混合液，反應混合液包括四種dNTP各200 μM、1× Reaction Buffer（25 mM Tris-HCl, 0.1 mM MgCl2, 0.75 M KCl, pH 8.3）、100 mM Oligo dT、dithiothreitol（DTT）與5U MMLV Reverse transcriptase，反應的溫度設定為37℃作用60分鐘。
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3. 聚合酵素鏈鎖反應（polymerase chain reaction, PCR）
本實驗以1 μg cDNA在50 μl反應混合液，最終反應混合液包括四種 dNTP mixture 200 μM、引子各0.8 μM、1.0 U Super-them DNA polymerase與1倍PCR reaction buffer（0.01% gelatin, 0.1% Triton X-100, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, and 10 mM Tris-HCl, pH 9.0）。反應的溫 度及時間設定為95℃變性（denaturation）5分鐘，95℃變性40秒、
51~56℃(依各引子而不同)進行引子接合（annealing）40秒、72℃延伸
（primer extension），以Mini cycleTMPCR machine（MJ Research Watertown City, MA）進行25或35個循環反應，而後以72 ℃引子延伸 5分鐘。使用引子列於 Table 1。
4. 電泳（electrophoresis）
取6 μl PCR產物，以1.2~2％ agarose gel、100伏特電壓下，在 Mupid-2J迷你水平電泳槽（Cosmo Bio, Tokyo, Japan），使用0.5倍TBE 緩衝液（0.1M Tris, 0.1M boric acid, 2 mM EDTA-Na2, pH8.0）進行瓊 膠電泳。再以ethidium bromide（50 μg/ml）進行5~10分鐘的染色，於 紫外光線透視燈（Viber Lourmat photo-print 008-SD, Cedex, France）
下檢視PCR產物的長度。
七、
ATP 含量測定
本實驗利用 ATPlite (PerkinElmer) kit, 依據 recombinant firefly
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luciferase 催化受質 D-luciferin 產生冷光(emission maximum 為 560 nm, pH 7.8)的過程需要 ATP 的原理，來偵測細胞內 ATP 的能力。將 1 x 106 個細胞，以 RPMI-1640(不含 pyruvate 及 uridine)培養 24 小時後收集 細胞，以PBS 沖洗後去上清液，再以 100μl PBS 打散細胞，加入 kit 所附的50μl cell lysis solution 及 50μl substrate solution 混和均勻，利 用多功能微盤分析儀(HIDEX Chameleon Microplate Reader, Finland, Turku)偵測冷光含量，並計量每一個標本產生的 ATP 含量。
八、 流式細胞儀(Flow cytometry)分析 1. 細胞處理
將1 x 106個細胞培養於10 cm 培養皿中，以 RPMI-1640(不含 pyruvate 及 uridine)培養 24 小時後，收集細胞至 15 ml 離心管，600×g 離心5 分鐘，丟棄上清液後再以 PBS 沖洗，於 600×g 離心 5 分鐘後，
丟棄上清液並以1ml PBS 均勻打散細胞，加入染劑後使用流式細胞儀 (BectonDickinson FACScan system, Mountain View, CA)進行分析。
2. 粒線體總數量(mitochondrial mass)偵測
10-n-nonyl-acridine orange (NAO; Molecular Probes, Eugene, OR) ， 不需藉助粒線體膜電位，可特異性與粒線體內膜的 cardiolipin 結合，
染劑即可堆積在粒線體的 lipid environment，是常用來偵測粒線體生 合成數量(mitochondrial mass)的螢光染劑。 將細胞以 PBS 清洗 2 次
33 membrane potential, ΔΨ) 的變化。粒線體在呼吸及氧化磷酸化過程中，
將產生的能量以電化學位能儲存於粒線體內膜(約 250mV)，稱之為 mitochondrial membrane potential (ΔΨ)，為外正內負的形式。JC-1 螢 光染劑為親脂性的陽離子化合物，加入細胞染色後，會和粒線體內膜 的負電荷結合，當ΔΨ 在低膜電位(＜100 mV)時會以 monomer 的形式 存在，excitation 在光源 488 nm 處，emission 在 525 nm 放出綠色螢光；
而當 ΔΨ 逐漸升高，JC-1 會行聚合作用(polymerization)在粒線體 IM 形成的J-aggregates，在 590 nm 放出橘紅色螢光。以紅綠螢光強度的 比值，便可算出細胞中粒線體膜電位差的高低。JC-1 因較傳統粒線體 膜電位的染劑有更高的敏感性和解析分辨能力(Smiley et al, 1991)。將 收集下來的細胞，加入1 ml PBS 均勻拍散細胞後，避光環境下加入 5 μM JC-1，作用 10 分鐘，於半小時內以流式細胞儀進行偵測。
4. 脂質過氧化傷害(lipid peroxidation)分析
BODIPY (4,4-difluoro-3a,4adiaza-s-indacene)是一種親脂性的螢光染
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劑，會和細胞膜上過氧化的脂質基團(lipid radical)結合，生成螢光化 合物，以500 nm~650 nm 的雷射光源激發(excitation)，可在 510 nm~665 nm 處放射(emission)最大的螢光值，藉流式細胞技術與螢光強度來偵
1. 雷射共軛顯微鏡 (confocal microscopy)
本實驗使用共軛焦顯微鏡(TCS SP5 AODS, Leica, Germany)來觀 察細胞內粒線體的型態(morphology)。共軛焦顯微鏡原理與光學顯微 (serum free medium)培養在 μ-slide(IBIDI)上 1 小時，使細胞貼附。以
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PBS 清洗 3 次停止細胞週期，再以 4% paraformaldehyde 室溫作用 20 分鐘固定細胞，用 PBS 清洗細胞 3 次，之後加入含有 0.2% Triton X-100 之 PBS 作用 10 分鐘，目的是將細胞膜打洞。再以 PBS 清洗 3 次後，加入blocking solution(3% BSA /PBS)作用 1 小時。去除 blocking solution 後，加入一級抗體 mouse anti-HSP 60Ab 於 4°C 反應一個晚 上。隔天移去一級抗體後，以 PBS 清洗細胞 3 次，再加入二級抗體 FITC-conjugated AffiniPure goat anti-mouse IgG 4°C 反應 1 小時，移 除二級抗體，以PBS 清洗細胞 3 次，加入 1 μM DAPI 約三分鐘後， 個人判斷其粒線體型態，包括絲狀的tubular form、點狀的 fragmented form 以及介於中間的 intermediated form，以統計出每組細胞粒線體的 主要型態。
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十、 細胞耗氧率測定(O2
consumption rate)
利用 Clark 式氧電極與生物性耗氧分析儀(Biological Oxygen Monitor, 5300A)(YSI,Clifton Gorge, OH)測定粒線體 RCR。儀器先經校 正後，將耗氧分析儀接上恆溫水浴循環系統，維持全程在37℃進行 實驗，調整Clark 氧電極，在氧氣測定槽(oxygraph chamber)中加入適 量Experimental buffer (EBc)(125 mM KCl, 10 mM Tris-MOPS, 0.1 mM EGTA/Tris ,1 mM KH2PO4,pH 7.4 )(Frezza et al, 2007)，使儀器穩定 8~10 分鐘，進行調節平衡，確保儀器設施良好可用於樣品的測定。
將106細胞收下後，以 0.1ml 細胞緩衝液(10mM Tris-MOPS, 10mM EGTA/Tris,10mM sucrose, pH 7.4) (Frezza et al, 2007)混合均勻，置於 冰上待測。開始進行耗氧量偵測，前五分鐘記錄緩衝液的含氧基值 (baseline)，隨後加入細胞待測液，測量 5 分鐘後的含氧值。比較每組 細胞在相同時間內的耗氧量。
十一、 統計分析
以 Student’s paried t test 作分析，p < 0.05 表示具有統計意義。實驗 結果以mean + standard deviation (S.D.)表示。
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第三章 實驗結果與分析
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一、 視神經萎縮症病人淋巴球細胞表現突變型的 OPA1 基因
分析 2 個視神經萎縮症家族病人的淋巴球細胞 OPA1 mRNA 基因 型態。發現視神經萎縮症家族(ADOA Family Ι)的病人在 OPA1 基因 第10 個外顯子(exon)上發生斷損(deletion)，利用 RT-PCR 技術，放大 OPA1 cDNA exon 8 (RT 10F)到 exon 13 (RT 10R)片段，除了產生正常
相較於正常人(normal control)或是家族中未發生 OPA1 基因突變的人 (internal control)，分別在兩個視神經萎縮症家族的病人淋巴球細胞中 均表現較低量的OPA1 mRNA(Fig. 6b,c)。分析第一個家族，相對於 control 組表現以及 F1C(ADOA Family Ι internal control)
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(92.68%±0.09%，n=3，p>0.05)的 OPA1 mRNA，F1P(ADOA Family Ι patient)則表現 70.73%±0.04%(n=3，p<0.05)低量的 OPA1 mRNA。分 析第二個家族，與 control 組，F2C1(ADOA Family ΙΙ internal control 1) (101.12%±0.81%，n=3，p>0.05)以及 F2C2(ADOA Family ΙΙ internal control 2) (93.92%±0.055% n=3，p>0.05) OPA1 mRNA 做比較，
F2P1(ADOA Family ΙΙ patient 1) 跟 F2P2(ADOA Family ΙΙ patient 2)表 現82.81%±0.02% (n=3，p<0.05) 與 84.42%±0.03%(n=3，p<0.05)相對 低量的OPA1 mRNA。
三、 視神經萎縮症病人淋巴球細胞影響 OPA1 蛋白的總表現量 視神經萎縮症病人淋巴球細胞表現突變型的OPA1 基因，不僅影響到 OPA1 mRNA 的總表現量，也影響 OPA1 蛋白的總表現量(Fig7.a,b)。
利用SDS-PAGE 所分出五個不同大小(85~98 Kd)的 OPA1 蛋白，在視 神經萎縮症病人淋巴球細胞表現量明顯偏低。分析第一個視神經萎縮 症家族的OPA1 蛋白表現量，F1P 的表現量 74.98%±0.004%(n=3，
p<0.01)明顯低於 control 組及 F1C (91.50%±0.07% ，n=3，p>0.05)所
表現的OPA1 蛋白。在第二個視神經萎縮症家族中也可以看到類似的 情形，F2P1 跟 F2P2 表現 87.36%±0.003%(n=3，p<0.01)與
86.98%±0.002%(n=3，p<0.01)的 OPA1 蛋白，也是低於 control 組、
F2C1(101.52%±0.31% ，n=3，p>0.05)以及 F2C2(101.58%±0.39%，n=3，
40 control 以及 F1C(86.24%±0.30% ，n=3，p>0.05)。第二個視神經萎縮 症家族病人細胞的膜電位，F2P1 為 49.97%±0.008%(n=3，p<0.01)，
F2P2 為 52.33%±0.02%(n=3，p<0.05)也是低於 control、F2C1
(84.67%±0.22%，n=3，p>0.05)以及 F2C2(90.33%±0.31%，n=3，p>0.05) 的膜電位。
五、
OPA1 基因突變使粒線體 DNA copy number 減少
進一步分析粒線體DNA copy number 是否會受 OPA1 基因突變的影響 (Fig. 9)。以 real-time PCR 偵測粒線體 DNA 序列中較不容易突變的一 段序列ND1，再以 house-keeping gene (β-globin) normalization，得到
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相對比值。與正常細胞(control)的比較，F1P 只有 control 的
0.71±0.03(n=3，p<0.05)倍，低於 F1C 的 0.96±0.71( n=3，p>0.05)倍。
F2P1 的 0.65±0.008 (n=3，p<0.01)倍跟 F2P2 的 0.66±0.005(n=3，p<0.01) 倍也都低於F2C1 的0.93±0.27( n=3，p>0.05)倍和 F2C2 的
0.89±0.05( n=3，p>0.05)倍。結果顯示，在視神經萎縮症病人淋巴球 細胞中，OPA1 突變會使粒線體 DNA copy number 減少。
六、
OPA1 基因突變使粒線體總數量(mitochondrial mass)減少
OPA1 基因突變也會造成粒線體總數量的減少(Fig. 10)。本實驗直接使 用染劑10-n-nonyl-acridine orange (NAO)，以流式細胞儀偵測細胞內 活性較好的粒線體數量。先比較第一個視神經萎縮症家族，control 組的螢光平均值(mean of fluorescence, MFI)為 1138±0.00，F1C 為 1141±0.74( n=3，p>0.05)，而 F1P 為 1084±0.02(n=3，p<0.05)則有些 微下降的情形。再比較第二個視神經萎縮症家族，F2P1 為1058±0.005(n=3，p<0.01)以及 F2P2 為 1080±0.02 (n=3，p<0.05)，也 都低於control 組的 1164±0.00，F2C1 的 1137±0.17( n=3，p>0.05)跟 F2C2 的 1179±0.48( n=3，p>0.05)。
七、 OPA1 基因突變影響粒線體 ATP 合成能力
為探討 OPA1 基因突變是否影響細胞中粒線體的功能，我們使用
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ATPlite kit 和冷光測定儀偵測細胞內 ATP 含量(ATP content) (Fig.11)。
第一個家族中，control 組每 2×105個細胞的ATP 含量為 28.53±0.00μM，
F1C 為 26.23±0.32 ( n=3，p>0.05) μM，在 F1P 則偵測到明顯低量的 ATP 含量，為 16.06±0.03 (n=3，p<0.05) μM。同樣在第二個家族中，
F2P1 跟 F2P2 的 ATP 含量 19.86±0.04(n=3，p<0.05)、15.54±0.01(n=3，
p<0.05)也是少於 control 的 26.87±0.00，F2C1 的 26.39±0.42( n=3，
p>0.05)跟 F2C2 的 24.25±0.20( n=3，p>0.05) ATP 含量(μM)。實驗結
果顯示，OPA1 基因突變確實也會影響粒線體生成 ATP 的功能，使產 量變少。
八、
OPA1 基因突變造成細胞脂質氧化性傷害增加
觀察OPA1 基因突變是否會使細胞氧化性傷害(oxidative damages)增 加，以 BODIPY 測定細胞膜脂質的過氧化性(lipid peroxidation)，經流 式細胞儀分析分析後(Fig.12)，第一個家族，在病人細胞中所偵測到 的螢光平均值為101±0.01(n=3，p<0.05)，高於 control 組的 85±0.00，
以及F1C 的 90±0.06( n=3，p>0.05)。在第二個家族裡，F2P1 跟 F2P2 的螢光平均106.33±0.007 (n=3，p<0.01)、103.67±0.009(n=3，p<0.01)，
也是高於control 組的 85±0.00、F2C1 的 87.33±0.11( n=3，p>0.05)跟 F2C2 的 90.67±0.107( n=3，p>0.05)。經由本實驗我們發現，OPA1 基 因突變會使得細胞的氧化性傷害增加的，在兩個家族中的視神經萎縮
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症病人細胞均看到這樣的情形。
九、
OPA1 基因突變對粒線體融合(fusion)與分裂(fission)的影響
另外我們使用雷射共軛焦顯微鏡來觀察各細胞粒線體的型(Fig.13a)，分別以絲狀(tubulan)、中間型(intermediated)、點狀(fragmented)各型態 比例作區分(Fig.13b)。Control 組細胞的粒線體呈現比例為
59%:18%:23%，大多數為絲狀的型態；F1C 細胞粒線體的比例
61%:13%:26%，以及 F2C 細胞的比例 55%:22%:23%，也和 control 組 相類似，都以絲狀的粒線體型態為主，少數才呈現中間型及點狀型態 的粒線體；而F1P 跟 F2P 細胞粒線體型態明顯不同於 control 組以及 各個家族的internal control 組，呈現大量點狀粒線體型態的細胞，分 別比例為14%:13%:73%以及 13%:15%:72%。依據觀察結果顯示，在
61%:13%:26%，以及 F2C 細胞的比例 55%:22%:23%，也和 control 組 相類似，都以絲狀的粒線體型態為主，少數才呈現中間型及點狀型態 的粒線體；而F1P 跟 F2P 細胞粒線體型態明顯不同於 control 組以及 各個家族的internal control 組，呈現大量點狀粒線體型態的細胞，分 別比例為14%:13%:73%以及 13%:15%:72%。依據觀察結果顯示，在