Taipei Medical University Institutional Repository:Item 987654321/6787

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(1)臺北醫學大學醫學科學研究所醫學檢驗暨生物技術組碩士論文. Taipei Medical University Graduate Institute of Medical Sciences for School of Medical Laboratory Science and Biotechnology Master Thesis. Effects of OPA1 Mutations on Mitochondrial Dysfunction OPA1 基因突變引發粒線體功能的影響. 研究生: 林安若(An-Lo Lin) 指導教授 : 高淑慧博士( Shu - Huei Kao, Ph.D. ). 中華民國九十八年六月. June, 2009 1.

(2) 致謝還記得 2007 年的暑假滿懷著理想與抱負來到了北醫高淑慧老師的實驗室，永遠不會忘記的是老師那天細心為我解說實驗室研究方向及熱情的介紹實驗室每位學姐，這兩年裡更要感謝高老師不厭其煩的教導與關心，總是為了我們的實驗操心，與我們一起努力的啃 paper，更為了突破瓶頸而想破頭，同時也要感謝與老師合作的榮總眼科部顏美媛主任，讓我有機會拿到如此珍貴的細胞，做為我碩士班研究主題，更提供了我豐富的資源讓我的實驗能如此順利的進行，另外也要感謝的是彰化基督教醫院劉青山副院長、謝榮鴻老師以及施純明老師，撥冗給予論文的指正，使我獲益良多，今後才能繼續在研究的道路上精益求精。碩士生涯除了老師們的指導，最功不可沒的就是我的兩位學姐怡蓉跟宜珮，從碩一開始她們總是我學習的榜樣，不吝嗇的教我所有的實驗，幫助我從什麼都哩哩辣辣到可以獨當一面的帶領學妹，再來就是我兩個超級好同學怡娟以及項詒，一路走來雖然我們總是不斷的鬥嘴，但真的也因為有你們陪在身邊，我才有繼續加油的動力，而顤珊、明芳更是實驗室不可多得的好學妹，有了她們的幫忙，讓我可以無後顧之憂的完成自己的實驗及論文。還要感謝的有顏主任的助理小萱、共儀中心的邱奕華小姐及醫技所的所有同學們，在我最需要的時候給我最多的幫助。最後更要感謝爸爸媽媽給予我最多的支持跟鼓勵還有包容我的情緒化及愛抱怨的個性。總之真的非常的謝謝大家在這兩年給我最重要也最寶貴的回憶，有你們也才有這本論文的誕生，謹將此論文獻給你們，我更期許自己在往後不論是工作生涯或是研究的路上能做得更好，讓你們能繼續以我為榮。安安 2009.07. 2.

(3) 目錄. 目錄………..…………………………………………………………………………..3 表目錄…………………………………………………………………………………5 圖目錄…………………………………………………………………………………5 中文摘要..……………………………………………………………………………..6 Abstract ……………………..…………………………………………………………8 研究目的………………………………………………………………………………9 第一章文獻回顧.................................................................................................... 12 一、顯性遺傳視神經萎縮症(Autosomal dominant optic atropy)…………... 錯誤! 尚未定義書籤。二、Optic Atropy 1 (OPA1)……………………..…………………………......13 三、粒線體(Mitochondria)……...…………………………………………….. 15 第二章藥品試劑…..……………………………………………………………..23 一、人類淋巴球細胞(lymphocytes)培養 ................................................. 25 二、細胞蛋白質製備(Preparation of cell lysate) .................................... 25 三、蛋白質定量法(Protein assay) ............................................................ 26 四、西方墨點法(Western blotting) .......................................................... 26 1. 電泳膠製備(SDS-PAGE gel preparation) ........................................... 26 2. 電泳(electrophoresis)........................................................................... 27 3. 轉印(transfer)....................................................................................... 27 4. 免疫轉漬(Immunoblot) ....................................................................... 28 五、 1.. 測定粒線體 DNA 拷貝數(mtDNA copy number) ........................... 28 DNA 的抽取與純化 ............................................................................ 28. 2.. Real-time Quantitative PCR ................................................................ 29 六、分析細胞內 RNA 表現 ....................................................................... 30 1.RNA 的抽取與純化 ................................................................................. 30 2.轉錄聚合酵素鏈鎖反應（Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）.................................................................................................... 30 3.聚合酵素鏈鎖反應（polymerase chain reaction, PCR） ....................... 31 4.電泳（electrophoresis） .......................................................................... 31 七、八、 1. 2. 3.. ATP 含量測定 ..................................................................................... 31 流式細胞儀(Flow cytometry)分析 .................................................... 32 細胞處理.............................................................................................. 32 粒線體總數量(mitochondrial mass)偵測 ........................................... 32 粒線體膜電位分析.............................................................................. 33 3.

(4) 九、 1. 2.. 雷射共軛焦顯微鏡 ............................................................................. 34 雷射共軛顯微鏡 (confocal microscopy) ........................................... 34 螢光染劑與細胞免疫螢光染色.......................................................... 34. 十、細胞耗氧率測定(O2 consumption rate) ........................................... 36 十一、統計分析 ......................................................................................... 36 第三章實驗結果與分析........................................................................................ 37 一、視神經萎縮症病人淋巴球細胞表現突變型的 OPA1 基因………….…..37 二、視神經萎縮症病人淋巴球細胞影響 OPA1 mRNA 的總表現量………..37 三、視神經萎縮症病人淋巴球細胞影響 OPA1 蛋白的總表現量…………..38 四、OPA1 基因突變對粒線體膜電位造成的影響…………….……………...39 五、OPA1 基因突變使粒線體 DNA copy number 減少……………………..39 六、OPA1 基因突變使粒線體總數量減少……………….…………………...40 七、OPA1 基因突變影響粒線體 ATP 合成能力…………………………..…40 八、OPA1 基因突變造成細胞脂質氧化性傷害增加……..…………………..41 九、OPA1 基因突變對粒線體融合(fusion)與分裂(fission)的影響………….42 十、 OPA1 基因突變對細胞耗氧率 (O2 consumption rate)的影響…………42 第四章討論............................................................................................................ 45 第五章參考文獻.................................................................................................... 52. 4.

(5) 表目錄 Table.1 Oligonucleotides used in the study .............................................................. 60. 圖目錄 Figure 1. Membrane structure and intra-organellar organization of mitochondrion. ................................................................................................................................. 62 Figure 2 Mitochondrial dynamics ........................................................................... 63 Figure 3. OPA1 gene structure ................................................................................. 64 Figure 4. The pedigree of ADOA family Ι & ΙΙ ....................................................... 65 Figure 5. OPA1 transcript analysis in ADOA family Ι & ΙΙ lymphocytes. .............. 66 Figure 6. Differential expression of OPA1 spliced variants .................................... 68 Figure7. Expression profiles of OPA1 protein. ....................................................... 69 Figure 8. Effects of OPA1 mutation on mitochondrial membrane potential(ΔΨ) ... 71 Figure 9. Effects of OPA1 mutation on mitochondrial DNA copy number. ............ 72 Figure 10. Effects of OPA1 mutation on mitochondrial mass. ................................ 73 Figure 11. ATP synthesis in the OPA1-mutated lymphocytes. ................................ 74 Figure 12. Effects of OPA1 mutation on the oxidative damages. ............................ 75 Figure 13. Effects of OPA1 mutation on mitochondrial networks. ......................... 77 Figure 14. Effects of OPA1 mutation on oxygen consumption. .............................. 78. 5.

(6) 中文摘要位在粒線體內膜上的第一型視神經萎縮蛋白(optic atrophy type 1, OPA1) 被證實具有 GTPase 的特性並參與調控粒線體的動態平衡 (mitochondrial dynamic)，同時和 cytochrome c 釋放有關，在細胞凋亡過程中扮演重要的角色。當位 OPA1 基因發生突變時，則會造成顯性遺傳視神經萎縮症(autosomal dominant optic atrophy, ADOA)，也就是由於視網膜神經節病變所導致的視力退化，為最常見的遺傳性視神經疾病。本論文主旨為了解在視神經萎縮症病人中，OPA1 基因的突變對於粒線體以及細胞功能上的影響。本實驗將兩個視神經萎縮症病人家族(ADOA Family Ι & ΙΙ)的淋巴球細胞經由 Epstein-Barr virus(EBV) 轉染製備成細胞株培養，並以正常人的淋巴球細胞同樣製備成的細胞株作為對照組比較。首先，於已發病視神經萎縮症病人的細胞確認 OPA1 基因突變位置，分別位在 OPA1 基因的 Exon 10 (Family Ι)及 Exon 12 (Family ΙΙ)，分析病人細胞 OPA1 mRNA 及 OPA1 蛋白的表現量較正常人或是同家族中未發生基因突變的人含量減少，mRNA 表現量下降約 16%~30%，蛋白質表現與正常含量相比下降約 13%~26%，但下降程度則因病患個人及基因突變位置而有所差異。我們發現 OPA1 的不正常表現分別降低了粒線體膜電位、ATP 生合成 27~43 百分比，並增加細胞的氧化性傷害 18%~24% ，更造成粒線體 DNA 套數 6.

(7) (mitochondrial DNA copy number)減少將近 29%~35%，以及粒線體總數量(mitochondrial mass)低於正常 10%。另外，利用雷射共軛交顯微鏡，在病人細胞中觀察到異常的粒線體型態(mitochondrial morphology)，病人細胞中的粒線體多表現分裂型態(fission form)佔 72%~73%，相較於正常人及同家族中未發生基因突變的人，其粒線體則表現較多的融合型態(fusion form)或是分裂及融合平衡的狀態，只有 23%~26%表現分裂型。由此我們確認 OPA1 在粒線體及細胞中確實扮演重要的角色。在 OPA1 基因突變的細胞中，不僅影響到粒線體網絡(networks)，在細胞能量的生合成(bioenergetics)方面亦有下降的趨勢。我們推測，OPA1 基因突變，可能是先藉由對粒線體網絡及細胞能量生合成上造成影響，導致細胞能量需求較大的視網膜神經細胞病變進而造成疾病。關鍵字: 第一型視神經萎縮蛋白、顯性遺傳視神經萎縮症、粒線體. 7.

(8) Abstract Optic atrophy type 1(OPA1) is a nuclear dynamin-related GTPase, targeted to the inner mitochondrial membrane, which plays a role in mitochondrial fusion. Mutations in the OPA1 gene on chromosome 3q28-qter are associated with autosomal dominant optic atrophy (ADOA), the most common inherited optic neuropathy, in which retinal ganglion cells (RGCs) are lost and visual acuity is impaired from an early age. Impaired mitochondrial biogenesis is central to the pathophysiology in ADOA. To understand the effects of OPA1 gene mutations on the mitochondrial function, the lymphocytes obtained from the affected ADOA individuals, non-affected ADOA family and normal subjects were collected and established into cell lines. Two ADOA family were enrolled in this study, one is ADOA family Ι with OPA1 exon 10 deletion and another is ADOA family ΙΙ with the deletion in exon 12. In the assessment of OPA1 mRNA levels and OPA1 protein profile, the ADOA shows reduced OPA1 expression depends on individuals with different mutations. The dissipation of mitochondrial membrane potential and a drop of ATP synthesis were evident in lymphocyte cultures carrying pathogenic OPA1 mutations. In addition, a decrease in mitochondria mass and mitochondrial DNA copy number and enhanced oxidative damages were also demonstrated. Moreover, confocal microscopy revealed increased mitochondrial fragmentation in the lymphocytes from ADOA patients. These findings indicated that OPA1 plays an important role in the mitochondrial bioenergetics and mitochondrial networks. The changes 8.

(9) in mitochondrial shape and mitochondrial bioenergetics may be effected of OPA1 mutations and a cause of the disease. Key words: autosomal dominant optic atrophy (ADOA), mitochondria, Optic atrophy type 1(OPA1). 9.

(10) 研究目的當位於人類第 3 號體染色體(3q28)的 OPA1 基因發生突變時，則會造成顯性遺傳視神經萎縮症(autosomal dominant optic atrophy, ADOA) (Alexander et al, 2000; Delettre et al, 2000)，也就是由於視網膜神經節病變所導致的視力退化，為最常見的遺傳性視神經疾病。由 OPA1 基因編碼(encoded)而成的蛋白為位在粒線體內膜上的第一型視神經萎縮蛋白(optic atrophy type 1, OPA1)，已經被發現具有 GTPase 的功能並參與粒線體動態平衡調控(Ishihara et al, 2006)，同時和 cytochrome c 釋放有關，在細胞凋亡途徑中扮演重要的角色(Frezza et al, 2006; Olichon et al, 2003; Yamaguchi et al, 2008)。之前大多數的研究都是將細胞株(cell line)的 OPA1 基因以 siRNA knock down 或使細胞株表現突變的 OPA1，來探討 OPA1 其主要功能以及致病機轉，已知的是細胞表現突變 OPA1 時除了影響 OPA1 蛋白的表現外，同時也會影響粒線體型態產生粒線體片段、或是碎裂 (fragmentation)的現象，甚至影響粒線體氧化磷酸化(oxidative phosphorylation)效能，及 ATP 合成等粒線體的功能，並且改變細胞在凋亡反應上的敏感度(Olichon et al, 2007b; Zanna et al, 2008)，但顯少以視神經萎縮症病人本身細胞(遺傳性造成的 OPA1 基因突變)做為研究的方向(Spinazzi et al, 2008; Zanna et al, 2008)，直到目前為止，OPA1 10.

(11) 基因突變所造成視神經萎縮症的病理現象，其機制仍不清楚。因此在這個實驗當中，我們利用視神經萎縮症病人的細胞，希望能夠針對先天遺傳性的 OPA1 基因突變，對細胞或是粒線體所造成的改變直接加以偵測。本實驗將兩個視神經萎縮症病人家族(ADOA Family Ι& ΙΙ)的淋巴球細胞經由 Epstein-Barr virus(EBV) 轉染製備成細胞株培養，並以隨機取樣正常人的淋巴球細胞同樣製備成的細胞株作為對照組比較，同時也與同家族中未發生 OPA1 基因突變即未發病的母親或是兄弟姊妹的細胞作比較，確定其粒線體遺傳基因的正常性。觀察在病人淋巴球細胞，OPA1 基因突變時是否如同之前報導會造成粒線體型態上的改變，以及確認 OPA1 基因突變對細胞氧化磷酸化效能、ATP 合成的影響，並希望能釐清造成這樣改變的機轉。. 11.

(12) 第一章文獻回顧. 12.

(13) 一、顯性遺傳視神經萎縮症(Autosomal dominant optic atropy) 1. 簡介顯性遺傳視神經萎縮症(autosomal dominant optic atropy, ADOA) 造成視神經萎縮最常見的遺傳性疾病，國外統計報告指出，其發生率約在五萬分之一到萬分之一(Bette et al, 2005; Eiberg et al, 1994)。顯性遺傳視神經萎縮症主要的臨床特徵為: (1)病人雙眼視力逐漸退化，產生輕度到重度不等的視力障礙 (2)視野檢查有中心暗點(central scotoma)或中心盲點間暗點(centrocecal)的現象 (3)眼底檢查可發現顳側視神經蒼白 (optic disc pallor) (4) 藍黃色色覺障礙 (blue-yellow dyschromatopsia) (5)腦部斷層檢查出視神經萎縮(optic nerve atropy ) 以及(6)病理檢查則有視網膜神經膠細胞(retinal ganglion cell)減少和神經出現去神經鞘(demyelination)等變化。. 2. 機轉顯性遺傳視神經萎縮症是一種家族遺傳性視神經病變，是由於位在人類第 3 號體染色體(3q28-q29)的 OPA1(optic atrophy 1)基因突變所造成的(Alexander et al, 2000; Delettre et al, 2000)，也由於基因突變方式及突變位置不同，其基因表現有很大的差異性(Toomes et al, 2001)。. 13.

(14) 二、 Optic Atropy 1 (OPA1) 1. 簡介 OPA1 為位在粒線體內膜(mitochondrial inner membrane)上的一個蛋白質(Fig.1)，包含 960 個胺基酸，由 30 個 exon 組成(Fig3)，表現於全身細胞，但在腦部、肌肉細胞及視網膜有較高的表現量，尤其是視網膜(Alexander et al, 2000; Wang et al, 2006)。並且經由 exon 4、4b、 5 和 5b 剪接(splicing)成 8 個不同的異型(isoform)(Fig.6a)，在不同的細胞、組織中有不同的分布及表現量(Olichon et al, 2007a)。 OPA1 依其功能可分成三個區域 (domain): (1)GTP 水解酵素區域 (GTPase domain)，位在 exon 8-16，也是 OPA1 最主要調控粒線體動態平衡的區域(central dynamin domain)，利用水解 GTP 來調控粒線體動態平衡 (dynamic balance) (2)C 端區域(C-terminal coiled coil domain)，是與其他蛋白形成交互作用(protein-protein interaction)的區域 (3)N 端區域 (N-terminal domain)，N 端的引導序列(targeting sequence)則引導 OPA1 朝著粒線體膜間腔(intermembrane space)運送而座落於粒線體內膜 (Olichon et al, 2002)。目前已有許多基因突變被發現在 OPA1 基因的不同基因序列上(Amati-Bonneau et al, 2009)，絕大多數是發生在最主要功能的區域 GTPase domain(Ferre et al, 2005)，而這樣的突變也造成轉譯出不成熟的 OPA1 蛋白(premature truncation protein)表現在 14.

(15) 細胞粒線體上。 2. 功能 OPA1 在粒線體中具有兩項十分重要的功能。其一，OPA1 藉由水解 GTP 調控粒線體的融合(fusion)(Cipolat et al, 2004)，使粒線體型態 (mitochondrial morphology)上達到動態(dynamic)的平衡(Ishihara et al, 2006)；第二，OPA1 可經由切割(proteolytic cleavage)在粒線體嵴(cristae) 的開口處形成大小不同的 isoform(L、S-isoform)控制粒線體嵴的開關，利用此方式調控粒線體嵴內 cytochrom c 的釋放，因此 OPA1 也與細胞內所誘導的細胞凋亡(apoptosis)有關(Frezza et al, 2006; Olichon et al, 2003; Yamaguchi et al, 2008)。又當 OPA1 被切割(proteolytic cleavage) 時除了引發細胞的凋亡反應外，也會使得粒線體失去膜電位 (membrane potential) 以及粒線體呈線片段狀(fragmentation) (Griparic et al, 2007)。可知 OPA1 在細胞及粒線體內的重要性。近年來更有相關研究指出，細胞若表現突變的 OPA1 基因，除了影響 OPA1 蛋白的表現外，同時也會影響粒線體型態產生粒線體片段狀 (fragmentation) 的現象，甚至影響粒線體氧化磷酸化 (oxidative phosphorylation)的效率及呼吸功能，以及改變細胞在凋亡反應上的敏感度(Amati-Bonneau et al, 2009; Olichon et al, 2007; Zanna et al, 2008)。但至目前為止，OPA1 基因突變所造成視神經萎縮症的病理現象，其 15.

(16) 機制仍不清楚。三、粒線體(Mitochondria) 1. 簡介粒線體在構造方面主要分為內膜(inner membrane) 、外膜(outer membrane)、間質(matrix)以及膜間腔(intermembrane space)等四大部份。外膜平滑；而內膜為增加表面積，以凹陷皺褶的方式在粒線體內形成嵴(cristae)的構造，內膜上有許多酵素鑲嵌，其中負責執行電子傳遞鏈的五個呼吸酵素複合體，分別為 complex I (NADH-ubiquinone oxidoreductase)、complex II (succinate-ubiquinone oxidoreductase)、 complex III (ubiquinol- cytochrome c oxidoreductase) 、complex IV (cytochrome c oxidase) 和 complex V(ATP synthase)(Taanman, 1999)。除了五個呼吸酵素複合體外，在電子傳遞鏈上尚有對於維持正常電子傳遞鏈相當三個重要的蛋白質，包括 dihydroorotate: CoQ-oxidoreductase; electron transfer flavoprotein: CoQ oxidoreductase 及 adenine nucleotide translocator(Wallace, 1992)。藉由氧化磷酸化 (oxidative phosphorylation,OXPHOS)的過程，將所產生的能量以電化學位能儲存於粒線體內膜 (約 250 mV/5~10 nm)，稱之為 mitochondrial membrane potential (ΔΨm)，並以此位能來進行電子傳遞鏈，產生人體細胞賴以維生的能量－ATP。 16.

(17) 2. 粒線體 DNA(mtDNA) 人類體內的每個細胞中，大約有 1000~10000 個粒線體。粒線體有自己的基因(genome)，而每個粒線體中均帶有 2~10 組拷貝(copy)的雙股環狀的粒線體 DNA。每個粒線體 DNA，包含 16569 個鹼基對(base pair, bp)(Anderson et al, 1981)，共有 37 個基因區，其中 13 個是製造參與呼吸酵素複合體的多胜肽，2 個為 rRNA 基因區及另外 22 個 tRNA 基因區。執行電子傳遞鏈酵素複合體大多還是由細胞核 DNA 在細胞質中合成，再經由訊號胜肽 (signal peptide sequence)，輸送至粒線體內膜，與其它 13 條由粒線體 DNA 在粒線體間質所合成的多胜肽，共同組裝成具有功能的呼吸酵素複合體。除了上述參與轉錄的基因區(coding region)，另外還含有非轉錄基因區(non-coding region)，稱為 displacement loop (簡稱 D-loop 區)，此區域為粒線體 DNA 複製及轉錄的控制區域，其間包含了粒線體 DNA 的複製起點(origin of replication)，以及 RNA 合成的起動子部位 (promoter region)(Leonard & Schapira, 2000)。其他參與粒線體內氧化磷酸化蛋白的合成者，如 DNA 聚合酶 γ (polymerase γ)、RNA 聚合酶、核醣體蛋白(ribosomal protein)，及粒線體 DNA 調節因子(mtDNA regulatory factors)，則均由細胞核 DNA 所轉譯合成(Chinnery & 17.

(18) Turnbull, 2000)。 3. 粒線體融合(fusion)及分裂(fission) 粒線體是動態的胞器，在不同的細胞或是不同的外界刺激下，其型態跟數量都是可變的。粒線體在細胞內會進行頻繁的融合(fusion)與分裂(fission)，形成絲狀或是點狀形態，以維持本身動態的平衡(Chen & Chan, 2004; Karbowski & Youle, 2003)。粒線體利用融合作用進行膜電位的傳遞及交換粒線體基質的內容物，透過粒線體基因組交換，有效的修補突變的粒線體 DNA(Nakada et al, 2001)，而絲狀的粒線體連結成網路也有利於能量(ATP)在其中傳遞(Skulachev, 2001)。粒線體可利用分裂作用增加粒線體的數量，分散在細胞內不同的區域執行不同的功能(Collins et al, 2002)，而在細胞分裂的過程中，粒線體的分裂作用可以使粒線體平均分配到子代細胞中(Barni et al, 1996)。而這樣的動態平衡直接影響到粒線體的外觀型態與粒線體功能。研究中也發現，增加負責粒線體分裂的 Drp1 或 Fis1 蛋白的表達，可以促進粒線體分裂，同時誘導細胞凋亡；而抑制 Drp1 或 Fis1 則可以抑制細胞凋亡(James et al, 2003; Lee et al, 2004)。同樣的，大量表達負責粒線體融合的 OPA1 或 Mfn1/2 蛋白可以促進粒線體融合，同時抑制 cytochrome c 的釋放與細胞凋亡；反之則可促進細胞凋亡(Lee et al, 2004; Olichon et al, 2003; Sugioka et al, 2004)。因此可看出粒線體的 18.

(19) 融合分裂與細胞凋亡有密切的關係，在細胞走向細胞凋亡時，粒線體型態會呈現明顯的片段狀(Desagher & Martinou, 2000; Frank et al, 2001; Jagasia et al, 2005)。 4. 活性氧分子(Reactive oxygen species, ROS ) 氧化壓力(oxidative stress)是指組織或細胞中過氧化物(peroxidants) 大量產生，或是抗氧化物(antioxidant)降低，造成體內狀態不平衡 (Gutteridge & Halliwell, 1989)。活性氧自由基是由以氧為中心所組成的分子，包括氫氧自由基 (hydroxyl radical, OH) 、超氧陰離子 (superoxide. anion,. ‧. O2. －. ) 和過氧化氫 (hydrogen. peroxide,. H2O2)(Fridovich, 1999)。 ROS 會在氧化代謝及能量代謝的過程中產生，在人體中扮演重要角色。在所有耗氧生物體(aerobic organisms)內，約有 95%的氧氣應用在粒線體內膜的呼吸鏈(Cadenas & Davies, 2000)，在 ATP 的過程中約有 1~2%的氧會轉變成超氧陰離子、過氧化氫及其他活性氧自由基。正常的生理狀況下，ROS 維持細胞的正常功能，包括氧化還原調節以及細胞內的訊息傳遞等(Fleury et al, 2002)。ROS 所進行的氧化還原反應也會對蛋白結構產生破壞性傷害，破壞細胞的正常生理狀態。而粒線體是細胞內主要的氧氣濃度感受器官，不同的氧氣濃度也會影響 ROS 的生成，氧氣濃度過高會促使 ROS 的增加，對細胞產生毒性； 19.

(20) 過低的氧氣濃度則會造成細胞中 ATP 產量減少，甚至影響細胞的存活率(De Marco & Caniggia, 2002)。此外，ROS 可能參與早期調節細胞凋亡過程，當細胞中產生 ROS 時，可能抑制抗凋亡分子 Bcl-2 分子出現，促使粒線體膜的去極化與 Δψ 下降，釋放出 cytochrome c，活化下游的 caspase，促使細胞趨向凋亡(apoptosis)(Huang et al, 2000; Kroemer et al, 1995; Nishimura et al, 2001; Simon et al, 2000)。而氧化壓力可能造成細胞內訊息傳遞混亂、細胞膜的損害、細胞離子溝通損傷、引發細胞膜脂質過氧化(Halliwell & Chirico, 1993) 、影響細胞內所有含 SH 基的分子 (sulfhydryl-containing molecules)，包含蛋白質、DNA 等皆會受到影響而減少。(Cadenas & Davies, 2000; Finkel & Holbrook, 2000; Nordberg & Arner, 2001) 5. 粒線體呼吸控制率(respiratory control ratio, RCR) 粒線體是細胞呼吸鏈和氧化磷酸化中心胞器，呼吸控制率也稱為呼吸調節比，常作為衡量粒線體架構、功能完整性及氧化磷酸化效率的指標。RCR 的定義為:加入氧化磷酸化基質 ADP 後得到的呼吸率 (state 3)與 ADP 被粒線體利用耗盡後的呼吸率(state 4)之比值(RCR= state 3 respiration/ state 4 respiration)(Chance & Williams, 1955)。State 3 是指粒線體體基極呼吸狀態，state 4 是指粒線體的基礎呼吸率，當粒線體有充分基質可供利用時，電子傳遞形成的質子梯度不斷被消耗， 20.

(21) 氧氣被快速利用，測得較大的耗氧率，此時的呼吸作用稱為 state 3; 而當 ADP 消耗後，氧氣消耗減少，這時的呼吸作用稱 state 4。如果是粒線體架構與功能完整，這樣的狀態下所得到的 RCR 就會比較大，故可藉由呼吸控制率(RCR)偵測粒線體完整程度(Trounce et al, 1996)。本實驗以細胞直接偵測在相同時間內氧氣消耗情形，故稱為細胞耗氧率 (O2 consumption rate)，同樣可以在擁有功能較好粒線體細胞中，測得較大的值，藉以比較粒線體完整度跟氧化磷酸化效率。. 21.

(22) 第二章實驗材料與方法. 22.

(23) 藥品試劑廠商 Abnova. 藥劑 OPA1 polyclonal antibody Ammonium persulfate (APS). Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). Enhanced chemiluminescence (ECL) N,N,N-tetramethylethylenediamine (TEMED) Polyvinylidene difluoride membrane (PVDF membrane) Agarose. Amresco (Solon, OH). Phenol Phenol : Chloroform : Isoamyl alcohol, 25:24:1, v:v:v. Ambion (Lakewood, NJ). Proteinase K. Ambion (Austin, TX). RNaseZAP. BD Biosciences(Bedford, MA) Bio-Rad (London, UK) Fluka (Buchs, CH). Mouse anti-HSP60 antibody Protein assay dye reagent 40% Acrylamide/bis solution (N’,N’-methylene-bis-acrylamide solution) Antibiotic-antimycotic. Gibco (Grand island, NY). Penicillin-streptomycin Trypsin-EDTA. Invitrogen (Carisbad, CA). SeeBlue® Plus2 prestained protein standard 1,4-dithiothreitol, DTT Acetic acid, CH3COOH Chloroform Citric acid, HOC(COOH)(CHCOOH)2•H2O Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate, Na2HPO4 EDTA. J.T.Baker (Phillipsburg, NJ). Glycerol 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid, HEPES Hydrogen chloride, HCl Isoamylalcohol Magnesium Chloride, MgCl2 Methanol, CH3OH Phosphoric acid, H3PO4. J.T.Baker (Phillipsburg, NJ). Potassium chloride, KCl Sodium acetate, (NH4)2SO4 23.

(24) Sodium bicarbonate, NaHCO3 Sodium carbonate, Na2CO3 Sodium chloride, NaCl Sodium hydroxide, NaOH Sodium tartrate Sucrose Tris-HCl Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA). Anti- mouse IgG conjugated horse radish peroxidase(HRP) Fluorescein(FITC) conjugated affinipure goat anti-mouse IgG. Life Technologies (Gaithersburg, MD). Fetal bovine serum (FBS) 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbo. Molecular Probes (Leiden, NL). cyanine iodide (JC-1) Mito Tracker® Green FM MitoTracker® Red COXRos. Perkin Elmer(Waltham,USA) Qiagen (Hilden,Germany) Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Luminescence ATP detection assay system QIAGEN RNeasy Mini Kit Mouse anti-actin antibody Butylated hydroxytoluene (BHT) Bovine serum albumin(BSA) Dihydrochloride(DAPI) Dimethysulfide oxide (DMSO) Ethidium bromide (EtBr). Sigma (St. Louis, MO). Ethylene-bis(oxyethylenenitrilo)tetraacetic acid (EGTA) Glycine Phenylmethylsulphonyl floride (PMSF) Potassium phosphate monobasic, KH2PO4 paraformaldehyde RPMI-1640 medium Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sodium pyruvate Triton X-100 uridine 24.

(25) 一、人類淋巴球細胞(lymphocytes)培養本篇實驗使用的細胞來源如圖 4(fig.4)所示，分成第一部分為正常人，包含 Normal control 1(C1)以及 Normal control 2(C2)；第 2 部分為神經萎縮症家族(Ι)，包括 OPA1 基因未發生突變的 ADOA family Ι internal control (F1C)跟 OPA1 基因突變且發病病人 ADOA family Ι patient (F1P)的細胞；第三部分是另一個神經萎縮症家族(ΙΙ)，包含兩株 OPA1 基因未發生突變的細胞 ADOA family ΙΙ internal control 1(F2C1)、ADOA family ΙΙ internal control 2(F2C2)跟另兩株 OPA1 基因突變且發病病人 ADOA family ΙΙ patient 1(F2P1)跟 ADOA family ΙΙ patient 2(F2P2)。將其血液中淋巴球細胞已 Epstein-Barr virus 轉染成細胞株培養，為懸浮性的細胞株，培養於 100 unit/ml penicillin、0.1 mg/ml streptomycine 以及 15%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的 Roswell Park Memorial Institute-1640(RPMI-1640)培養液(medium)，並外加 100μg/mL pyruvate, 50μg/mL uridine，放置於 5% CO2 的 37℃培養箱加以培養。二、細胞蛋白質製備(Preparation of cell lysate) 將細胞培養於 10cm 培養皿中，待 48 小時之後長滿，離心除去培養液，再以 PBS 清洗，均勻加入 30 μl 至 80 μl 的 protein lysis buffer ( 20 mM Tris-HCl, pH 7.4, 125 mM NaCl, 1mM MgCl2, 25 mM 25.

(26) β-glycerophosphate, 100 μM PMSF, 1% Triton, 1 μg/ml leupeptin, 1 μg/ml apotininn, 50 mM NaF, 1 mM sodium orthovanadate )，將細胞打散，再置於冰上作用 30 分鐘待細胞膜溶解後，以 8500×g 於 4℃，離心 20 分鐘，收集上清液為蛋白質萃取液，經過蛋白質定量後進行西方墨點法測定蛋白質表現的變化。三、蛋白質定量法(Protein assay) 定量的原理是利用 Coomassie Brilliant Blue G-250 和蛋白質結合的特性。當 G-250 與蛋白質結合後，其顏色會從紅色轉變成藍色，以光源 595 nm 波長進行偵測，蛋白質濃度愈高，得到的吸光值愈高。 Bio-Rad protein assay dye 先以去離子水依 1：4 之比例稀釋五倍後，用 Whatman No.1 濾紙過濾後，於每一試管中加入 1 ml 過濾液。以 0.4 mg/ml、0.8 mg/ml 及 0.16 mg/ml 之 BSA 作為標準液，測量各點吸光值後用來製定吸光值與蛋白質濃度的標準曲線。在裝有過濾液之試管中加入 1~3 μl 待測物並紀錄添加體積，經震盪混合後，待測物之顏色深淺須介於 standard 0.2~0.8 mg/ml BSA 標準液間，以 595 nm 波長測定吸光值，比對標準曲線計算待測物之蛋白質濃度。四、西方墨點法(Western blotting) 1. 電泳膠製備(SDS-PAGE gel preparation) Gel 分為兩層，下層為 8% separating gel，配置方法為在 4.8 ml 26.

(27) ddH2O 中，分別加入 0.937ml 的 3 M Tris-HCl (pH8.9)、1.5 ml 的 40% acrylamide/bis、75 μl 的 10% sodium dodecyl sulfate (SDS)、37.5 μl 的 10% ammonium persulfate 及 7.5 μl 的 N, N, N´, N´tetramethylenediamine，待凝固後製作 stacking gel，其配置方法為 3.2 ml ddH2O 中，分別加入 0.5 ml 的 40%的 acrylamide/bis、0.5 ml 的 1.5 M Tris-HCl (pH6.7)、 50 μl 的 10% SDS、50 μl 的 10% APS 及 10 μl 的 TEMED。 2. 電泳(electrophoresis) 將電泳膠片置於電泳槽中並填滿電泳緩衝液(running buffer)，取 60μg 量的待測蛋白質萃取液與 0.35 M protein loading dye 混合後，於 95℃下加熱 5 分鐘，進行蛋白質的變性作用(denature)，作用後隨即置於冰上冷卻，以 8% SDS-PAGE gel 調整電壓至 80 voltage 進行電泳分析。約 3.5 小時後停止電泳，並進行蛋白質的轉印。 3. 轉印(transfer) 剪裁適當大小之 PVDF membrane，以 methanol 潤濕後，以去離子水洗淨浸泡備用。電泳結束後將 SDS-PAGE gel 由玻片上取下放在 3 M paper 上，再將 PVDF membrane 覆蓋於 SDS-PAGE gel 上，以油性筆在 PVDF membrane 上將 marker 的位置及所需分子量標示清楚，再蓋上一層 3 M paper，以塑膠棒趕走其間之氣泡後置於轉印槽，於 27.

(28) 4℃低溫環境以 400 mA 之電流轉印 100 分鐘即完成。 4. 免疫轉漬(Immunoblot) 轉印完成後，將 PVDF membrane 以含 5%脫脂奶粉的 TBST (tris buffered saline with Tween-20) blocking buffer 作用 1 小時後，去除 blocking buffer，以 1×TBST 清洗三次，每次 5 分鐘。清洗完畢之後，加入 primary antibody，如 OPA1，β-actin 特異性抗體作用 2 小時，再以 1×TBST 清洗三次，每次 10 分鐘，接著加入 secondary antibody，如 anti-mouse IgG conjugated horse radish peroxidase (HRP)或 anti-goat IgG conjugated horse radish peroxidase (HRP)等特異性抗體作用 1 小時，再以 1×TBST 清洗三次，每次 10 分鐘，最後以 enhanced chemiluminescence (ECL)做呈色，在 PVDF membrane 上覆蓋 ECL buffer 作用 1 數分鐘，再放入含有 X-film 的卡匣以底片曝光顯影。五、測定粒線體 DNA 拷貝數(mtDNA copy number) 1. DNA 的抽取與純化收集 1 x 106 個細胞，離心吸去培養液，後先以 PBS 清洗，加入含有 10mM Tris-HCl EDTA (pH 8.0)、1.5% SDS、10 mM RNase A 及 2 M butylated hydroxytoluene (BHT)的分解液在 37℃下作用 1 小時後，再加入 10 mM proteinase K 的分解液在 56℃下作用 2~12 小時，取等體積的酚(phenol) 與標本混合均勻，以 8500×g 離心 5 分鐘後，萃取 28.

(29) 上清液，再取等體積的酚-氯仿(phenol：chloroform：isoamylalcohol , 25:24:1 , v:v:v) 均勻混合，以 8500×g 離心 5 分鐘後萃取上清液，重複此步驟 1 至 2 次，之後再取等體積的氯仿 (chloroform ： isoamylalcohol , 24:1 , v:v) 均勻混合，以 8500×g 離心 5 分鐘後萃取上清液，以去除蛋白質等雜質。完成以上步驟的萃取液，再與等體積的異丙醇 (isopropanol) 及 1/10 (v/v) 的 3 M 醋酸鈉 (sodium acetate, (NH4)2SO4, NaOAc, pH 5.4)混合後，置於-20℃沉澱(precipitation) 8~12 小時。在 4℃下 8500×g 離心 10 分鐘，除去上清液後，以 75%酒精洗去沉澱物中的殘留鹽類，經風乾後，將 DNA 溶於適量的二次水中。測量 DNA 吸光值 OD260 與 OD280 的比值，計算並定量 DNA 濃度。 2. Real-time Quantitative PCR 取 50 ng/μl DNA 1μl 和下列試劑混合：10 pmole target-specific primer 2μl、SYBR Green I 1μl、MgCl2 1.2μl、H2O 4.8μl。Real-time quatitative PCR 設定條件如下：Heart start 94℃ 5 分鐘，接下來為 31 個循環週次的設定條件，94℃ 30 秒、62℃ 30 秒、72℃ 30 秒、79℃ 2 分鐘。結果使用 LightCycler Analysis 分析。所用 DNA 引子列於 Table 1.. 29.

(30) 六、分析細胞內 RNA 表現 1. RNA 的抽取與純化所有使用的器具均以 RNaesZAP 處理，以除去 RNaes ，再使用 QIAGEN RNeasy Mini Kit，首先將Buffer RLT與β-mercaptoethanol以 100:1混合，加入350或600 μl 混合液於已處理好之細胞中，混合均勻後，加入同體積的70%酒精，再次均勻混合，吸取到RNeasy mini column中，離心8000×g，15秒，倒掉濾液。加入700μl Buffer RW1到 mini column中，離心8000×g ，15秒，倒掉濾液。加入500 μl Buffer RPE 到mini column，離心8000×g，2分鐘，倒掉濾液，更換新的離心管，再離心8500×g ，1分鐘，確保未殘留試劑於column。最後換新的離心管，在column中加入30-50 μl RNase-free water，靜置一分鐘後，離心 10000×g 1分鐘，所得濾液即為RNA萃取液，可測量RNA 吸光值OD260 與OD280的比值，計算並定量RNA濃度。. 2. 轉錄聚合酵素鏈鎖反應（Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）以1μg RNA在50 μl反應混合液，反應混合液包括四種dNTP各200 μM、1× Reaction Buffer（25 mM Tris-HCl, 0.1 mM MgCl2, 0.75 M KCl, pH 8.3）、100 mM Oligo dT、dithiothreitol（DTT）與5U MMLV Reverse transcriptase，反應的溫度設定為37℃作用60分鐘。 30.

(31) 3. 聚合酵素鏈鎖反應（polymerase chain reaction, PCR）本實驗以1 μg cDNA在50 μl反應混合液，最終反應混合液包括四種 dNTP mixture 200 μM、引子各0.8 μM、1.0 U Super-them DNA polymerase與1倍PCR reaction buffer（0.01% gelatin, 0.1% Triton X-100, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, and 10 mM Tris-HCl, pH 9.0）。反應的溫度及時間設定為95℃變性（denaturation）5分鐘，95℃變性40秒、 51~56℃(依各引子而不同)進行引子接合（annealing）40秒、72℃延伸（primer extension），以Mini cycleTMPCR machine（MJ Research Watertown City, MA）進行25或35個循環反應，而後以72 ℃引子延伸 5分鐘。使用引子列於 Table 1。 4. 電泳（electrophoresis）取6 μl PCR產物，以1.2~2％ agarose gel、100伏特電壓下，在 Mupid-2J迷你水平電泳槽（Cosmo Bio, Tokyo, Japan），使用0.5倍TBE 緩衝液（0.1M Tris, 0.1M boric acid, 2 mM EDTA-Na2, pH8.0）進行瓊膠電泳。再以ethidium bromide（50 μg/ml）進行5~10分鐘的染色，於紫外光線透視燈（Viber Lourmat photo-print 008-SD, Cedex, France）下檢視PCR產物的長度。七、 ATP 含量測定本實驗利用 ATPlite (PerkinElmer) kit, 依據 recombinant firefly 31.

(32) luciferase 催化受質 D-luciferin 產生冷光(emission maximum 為 560 nm, pH 7.8)的過程需要 ATP 的原理，來偵測細胞內 ATP 的能力。將 1 x 106 個細胞，以 RPMI-1640(不含 pyruvate 及 uridine)培養 24 小時後收集細胞，以 PBS 沖洗後去上清液，再以 100μl PBS 打散細胞，加入 kit 所附的 50μl cell lysis solution 及 50μl substrate solution 混和均勻，利用多功能微盤分析儀(HIDEX Chameleon Microplate Reader, Finland, Turku)偵測冷光含量，並計量每一個標本產生的 ATP 含量。八、流式細胞儀(Flow cytometry)分析 1. 細胞處理將 1 x 106 個細胞培養於 10 cm 培養皿中，以 RPMI-1640(不含 pyruvate 及 uridine)培養 24 小時後，收集細胞至 15 ml 離心管，600×g 離心 5 分鐘，丟棄上清液後再以 PBS 沖洗，於 600×g 離心 5 分鐘後，丟棄上清液並以 1ml PBS 均勻打散細胞，加入染劑後使用流式細胞儀 (BectonDickinson FACScan system, Mountain View, CA)進行分析。 2. 粒線體總數量(mitochondrial mass)偵測 10-n-nonyl-acridine orange (NAO; Molecular Probes, Eugene, OR) ，不需藉助粒線體膜電位，可特異性與粒線體內膜的 cardiolipin 結合，染劑即可堆積在粒線體的 lipid environment，是常用來偵測粒線體生合成數量(mitochondrial mass)的螢光染劑。將細胞以 PBS 清洗 2 次 32.

(33) 後，加入 1μM NAO 染劑，避光下作用 10 分鐘，在半小時內以流式細胞儀偵測螢光反應。 3. 粒線體膜電位分析 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide (JC-1) 可利用於偵測細胞中粒線體膜電位 (mitochondrial membrane potential, ΔΨ) 的變化。粒線體在呼吸及氧化磷酸化過程中，將產生的能量以電化學位能儲存於粒線體內膜(約 250mV)，稱之為 mitochondrial membrane potential (ΔΨ)，為外正內負的形式。JC-1 螢光染劑為親脂性的陽離子化合物，加入細胞染色後，會和粒線體內膜的負電荷結合，當 ΔΨ 在低膜電位(＜100 mV)時會以 monomer 的形式存在，excitation 在光源 488 nm 處，emission 在 525 nm 放出綠色螢光；而當 ΔΨ 逐漸升高，JC-1 會行聚合作用(polymerization)在粒線體 IM 形成的 J-aggregates，在 590 nm 放出橘紅色螢光。以紅綠螢光強度的比值，便可算出細胞中粒線體膜電位差的高低。JC-1 因較傳統粒線體膜電位的染劑有更高的敏感性和解析分辨能力(Smiley et al, 1991)。將收集下來的細胞，加入 1 ml PBS 均勻拍散細胞後，避光環境下加入 5 μM JC-1，作用 10 分鐘，於半小時內以流式細胞儀進行偵測。 4. 脂質過氧化傷害(lipid peroxidation)分析 BODIPY (4,4-difluoro-3a,4adiaza-s-indacene)是一種親脂性的螢光染 33.

(34) 劑，會和細胞膜上過氧化的脂質基團(lipid radical)結合，生成螢光化合物，以 500 nm~650 nm 的雷射光源激發(excitation)，可在 510 nm~665 nm 處放射(emission)最大的螢光值，藉流式細胞技術與螢光強度來偵測細胞的氧化性傷害(oxidative damages)，評估細胞整體氧化壓力的程度。將收集下來的細胞，加入 1 ml PBS 均勻拍散細胞，避光環境下加入 1μ M BODIPY，作用 10 分鐘，在半小時內以流式細胞儀進行偵測。九、雷射共軛焦顯微鏡 1. 雷射共軛顯微鏡 (confocal microscopy) 本實驗使用共軛焦顯微鏡(TCS SP5 AODS, Leica, Germany)來觀察細胞內粒線體的型態(morphology)。共軛焦顯微鏡原理與光學顯微鏡相似，主要差別在於共軛焦顯微鏡以不同波長雷射光作為光源，由於雷射光波長較可見光長短，使得共軛焦顯微鏡的解析力介於光學與電子顯微鏡之間，解析度達 0.18 μm，可以讓我們穿透細胞的表層組織，運用多次及多面的切片式掃描，可進行胞器體積的測量，觀察細胞中的胞器功能與位置分佈，深入了解細胞內部的三度空間結構。 2. 螢光染劑與細胞免疫螢光染色將 1 x 106 細胞培養 24 小時後，改以不含血清的 RPMI-1640 培養液 (serum free medium)培養在 μ-slide(IBIDI)上 1 小時，使細胞貼附。以 34.

(35) PBS 清洗 3 次停止細胞週期，再以 4% paraformaldehyde 室溫作用 20 分鐘固定細胞，用 PBS 清洗細胞 3 次，之後加入含有 0.2% Triton X-100 之 PBS 作用 10 分鐘，目的是將細胞膜打洞。再以 PBS 清洗 3 次後，加入 blocking solution(3% BSA /PBS)作用 1 小時。去除 blocking solution 後，加入一級抗體 mouse anti-HSP 60Ab 於 4°C 反應一個晚上。隔天移去一級抗體後，以 PBS 清洗細胞 3 次，再加入二級抗體 FITC-conjugated AffiniPure goat anti-mouse IgG 4°C 反應 1 小時，移除二級抗體，以 PBS 清洗細胞 3 次，加入 1 μM DAPI 約三分鐘後， 1X PBS 清洗三次，即可將玻片加入少許的抗退劑 VECTASHIELD® Mounting Medium 延緩螢光時間減退（photobleaching）的速度。處理好後便可以雷射共軛顯微鏡觀察。 HSP60 是持續表現在粒線體的蛋白，經由免疫螢光染色，以波長 488nm 激發（excitation），放射波長（emission）為 518nm，經藍光源照射後發散青綠色螢光，可用來標定粒線體，觀察粒線體型態。同時也利用 DAPI 染料來來標定細胞核的位置。DAPI 是針對細胞核之 DNA 染色，在紫外光濾鏡下呈現藍色。每組拍約 50 顆細胞，再由 4 個人判斷其粒線體型態，包括絲狀的 tubular form、點狀的 fragmented form 以及介於中間的 intermediated form，以統計出每組細胞粒線體的主要型態。 35.

(36) 十、細胞耗氧率測定(O2 consumption rate) 利用 Clark 式氧電極與生物性耗氧分析儀(Biological Oxygen Monitor, 5300A)(YSI,Clifton Gorge, OH)測定粒線體 RCR。儀器先經校正後，將耗氧分析儀接上恆溫水浴循環系統，維持全程在 37℃進行實驗，調整 Clark 氧電極，在氧氣測定槽(oxygraph chamber)中加入適量 Experimental buffer (EBc)(125 mM KCl, 10 mM Tris-MOPS, 0.1 mM EGTA/Tris ,1 mM KH2PO4,pH 7.4 )(Frezza et al, 2007)，使儀器穩定 8~10 分鐘，進行調節平衡，確保儀器設施良好可用於樣品的測定。將 106 細胞收下後，以 0.1ml 細胞緩衝液(10mM Tris-MOPS, 10mM EGTA/Tris,10mM sucrose, pH 7.4) (Frezza et al, 2007)混合均勻，置於冰上待測。開始進行耗氧量偵測，前五分鐘記錄緩衝液的含氧基值 (baseline)，隨後加入細胞待測液，測量 5 分鐘後的含氧值。比較每組細胞在相同時間內的耗氧量。十一、統計分析以 Student’s paried t test 作分析，p < 0.05 表示具有統計意義。實驗結果以 mean + standard deviation (S.D.)表示。. 36.

(37) 第三章實驗結果與分析. 37.

(38) 一、視神經萎縮症病人淋巴球細胞表現突變型的 OPA1 基因分析 2 個視神經萎縮症家族病人的淋巴球細胞 OPA1 mRNA 基因型態。發現視神經萎縮症家族(ADOA Family Ι)的病人在 OPA1 基因第 10 個外顯子(exon)上發生斷損(deletion)，利用 RT-PCR 技術，放大 OPA1 cDNA exon 8 (RT 10F)到 exon 13 (RT 10R)片段，除了產生正常大小 504 bp 的基因片段外，也會同時做出 423 bp 大小的突變型片段 (Fig. 5a)。而另一個視神經萎縮症家族(ADOA Family ΙΙ)的病人則是在 OPA1 基因第 12 個外顯子(exon)上發生斷損(deletion)，放大 OPA1 cDNA exon 9 (RT 12F)到 exon 16 (RT 12R)片段，也會產生兩個不同大小的基因片段，一個為 604bp 的正常基因型；另一個是 532bp 的突變基因型(Fig . 5b)。. 二、視神經萎縮症病人淋巴球細胞影響 OPA1 mRNA 的總表現量視神經萎縮症病人淋巴球細胞表現突變型的 OPA1 基因，會影響到 OPA1 mRNA 的總表現量。利用 RT-PCR 技術，放大不包含基因斷損位置的 OPA1 cDNA ，自 exon 3 (K5 S)到 exon 9 (K5 AS)片段(Fig. 6a)。相較於正常人(normal control)或是家族中未發生 OPA1 基因突變的人 (internal control)，分別在兩個視神經萎縮症家族的病人淋巴球細胞中均表現較低量的 OPA1 mRNA(Fig. 6b,c)。分析第一個家族，相對於 control 組表現以及 F1C(ADOA Family Ι internal control) 38.

(39) (92.68%±0.09%，n=3，p>0.05)的 OPA1 mRNA，F1P(ADOA Family Ι patient)則表現 70.73%±0.04%(n=3，p<0.05)低量的 OPA1 mRNA。分析第二個家族，與 control 組，F2C1(ADOA Family ΙΙ internal control 1) (101.12%±0.81%，n=3，p>0.05)以及 F2C2(ADOA Family ΙΙ internal control 2) (93.92%±0.055% n=3，p>0.05) OPA1 mRNA 做比較， F2P1(ADOA Family ΙΙ patient 1) 跟 F2P2(ADOA Family ΙΙ patient 2)表現 82.81%±0.02% (n=3，p<0.05) 與 84.42%±0.03%(n=3，p<0.05)相對低量的 OPA1 mRNA。. 三、. 視神經萎縮症病人淋巴球細胞影響 OPA1 蛋白的總表現量. 視神經萎縮症病人淋巴球細胞表現突變型的 OPA1 基因，不僅影響到 OPA1 mRNA 的總表現量，也影響 OPA1 蛋白的總表現量(Fig7.a,b)。利用 SDS-PAGE 所分出五個不同大小(85~98 Kd)的 OPA1 蛋白，在視神經萎縮症病人淋巴球細胞表現量明顯偏低。分析第一個視神經萎縮症家族的 OPA1 蛋白表現量，F1P 的表現量 74.98%±0.004%(n=3， p<0.01)明顯低於 control 組及 F1C (91.50%±0.07% ，n=3，p>0.05)所表現的 OPA1 蛋白。在第二個視神經萎縮症家族中也可以看到類似的情形，F2P1 跟 F2P2 表現 87.36%±0.003%(n=3，p<0.01)與 86.98%±0.002%(n=3，p<0.01)的 OPA1 蛋白，也是低於 control 組、 F2C1(101.52%±0.31% ，n=3，p>0.05)以及 F2C2(101.58%±0.39%，n=3， 39.

(40) p>0.05)的 OPA1 蛋白。接下來我們將更進一步去觀察 OPA1 基因突變除了影響 OPA1 mRNA 及蛋白的表現量外，是否也會影響其他粒線體或是細胞的功能。. 四、 OPA1 基因突變對粒線體膜電位造成的影響本實驗以 JC-1 染色比較在兩個視神經萎縮症家族中，OPA1 基因突變是否造成粒線體膜電位的變化。圖中(Fig8.a)，病人淋巴球細胞在右下角以 monomer 形式存在並發出綠色螢光的細胞增加，表示粒線體膜電位在病人淋巴球細胞中有降低的趨勢即(Fig8.b)。在第一個視神經萎縮症家族中，F1P 膜電位為 68.27%±0.02%(n=3，p<0.05)低於 control 以及 F1C(86.24%±0.30% ，n=3，p>0.05)。第二個視神經萎縮症家族病人細胞的膜電位，F2P1 為 49.97%±0.008%(n=3，p<0.01)， F2P2 為 52.33%±0.02%(n=3，p<0.05)也是低於 control、F2C1 (84.67%±0.22%，n=3，p>0.05)以及 F2C2(90.33%±0.31%，n=3，p>0.05) 的膜電位。. 五、 OPA1 基因突變使粒線體 DNA copy number 減少進一步分析粒線體 DNA copy number 是否會受 OPA1 基因突變的影響 (Fig. 9)。以 real-time PCR 偵測粒線體 DNA 序列中較不容易突變的一段序列 ND1，再以 house-keeping gene (β-globin) normalization，得到 40.

(41) 相對比值。與正常細胞(control)的比較，F1P 只有 control 的 0.71±0.03(n=3，p<0.05)倍，低於 F1C 的 0.96±0.71( n=3，p>0.05)倍。 F2P1 的 0.65±0.008 (n=3，p<0.01)倍跟 F2P2 的 0.66±0.005(n=3，p<0.01) 倍也都低於 F2C1 的 0.93±0.27( n=3，p>0.05)倍和 F2C2 的 0.89±0.05( n=3，p>0.05)倍。結果顯示，在視神經萎縮症病人淋巴球細胞中，OPA1 突變會使粒線體 DNA copy number 減少。. 六、 OPA1 基因突變使粒線體總數量(mitochondrial mass)減少 OPA1 基因突變也會造成粒線體總數量的減少(Fig. 10)。本實驗直接使用染劑 10-n-nonyl-acridine orange (NAO)，以流式細胞儀偵測細胞內活性較好的粒線體數量。先比較第一個視神經萎縮症家族，control 組的螢光平均值(mean of fluorescence, MFI)為 1138±0.00，F1C 為 1141±0.74( n=3，p>0.05)，而 F1P 為 1084±0.02(n=3，p<0.05)則有些微下降的情形。再比較第二個視神經萎縮症家族，F2P1 為 1058±0.005(n=3，p<0.01)以及 F2P2 為 1080±0.02 (n=3，p<0.05)，也都低於 control 組的 1164±0.00，F2C1 的 1137±0.17( n=3，p>0.05)跟 F2C2 的 1179±0.48( n=3，p>0.05)。. 七、 OPA1 基因突變影響粒線體 ATP 合成能力為探討 OPA1 基因突變是否影響細胞中粒線體的功能，我們使用 41.

(42) ATPlite kit 和冷光測定儀偵測細胞內 ATP 含量(ATP content) (Fig.11)。第一個家族中，control 組每 2×105 個細胞的 ATP 含量為 28.53±0.00μM， F1C 為 26.23±0.32 ( n=3，p>0.05) μM，在 F1P 則偵測到明顯低量的 ATP 含量，為 16.06±0.03 (n=3，p<0.05) μM。同樣在第二個家族中， F2P1 跟 F2P2 的 ATP 含量 19.86±0.04(n=3，p<0.05)、15.54±0.01(n=3， p<0.05)也是少於 control 的 26.87±0.00，F2C1 的 26.39±0.42( n=3， p>0.05)跟 F2C2 的 24.25±0.20( n=3，p>0.05) ATP 含量(μM)。實驗結果顯示，OPA1 基因突變確實也會影響粒線體生成 ATP 的功能，使產量變少。. 八、 OPA1 基因突變造成細胞脂質氧化性傷害增加觀察 OPA1 基因突變是否會使細胞氧化性傷害(oxidative damages)增加，以 BODIPY 測定細胞膜脂質的過氧化性(lipid peroxidation)，經流式細胞儀分析分析後(Fig.12)，第一個家族，在病人細胞中所偵測到的螢光平均值為 101±0.01(n=3，p<0.05)，高於 control 組的 85±0.00，以及 F1C 的 90±0.06( n=3，p>0.05)。在第二個家族裡，F2P1 跟 F2P2 的螢光平均 106.33±0.007 (n=3，p<0.01)、103.67±0.009(n=3，p<0.01)，也是高於 control 組的 85±0.00、F2C1 的 87.33±0.11( n=3，p>0.05)跟 F2C2 的 90.67±0.107( n=3，p>0.05)。經由本實驗我們發現，OPA1 基因突變會使得細胞的氧化性傷害增加的，在兩個家族中的視神經萎縮 42.

(43) 症病人細胞均看到這樣的情形。. 九、 OPA1 基因突變對粒線體融合(fusion)與分裂(fission)的影響另外我們使用雷射共軛焦顯微鏡來觀察各細胞粒線體的型(Fig.13a)，分別以絲狀(tubulan)、中間型(intermediated)、點狀(fragmented)各型態比例作區分(Fig.13b)。Control 組細胞的粒線體呈現比例為 59%:18%:23%，大多數為絲狀的型態；F1C 細胞粒線體的比例 61%:13%:26%，以及 F2C 細胞的比例 55%:22%:23%，也和 control 組相類似，都以絲狀的粒線體型態為主，少數才呈現中間型及點狀型態的粒線體；而 F1P 跟 F2P 細胞粒線體型態明顯不同於 control 組以及各個家族的 internal control 組，呈現大量點狀粒線體型態的細胞，分別比例為 14%:13%:73%以及 13%:15%:72%。依據觀察結果顯示，在 OPA1 基因突變的細胞當中，細胞粒線體融合跟分裂的進行確實受到影響，而表現出迥異的粒線體型態。. 十、 OPA1 基因突變對細胞耗氧率 (O2 consumption rate)的影響利用 Clark 式氧電極與生物耗氧分析儀偵測細胞耗氧率，觀察 OPA1 基因突變對細胞呼吸作用的影響(Fig.14)，在相同時間內，記錄各細胞消耗氧的程度。F1P 的耗氧率僅有 control 組的 56.6%，低於 F1C (113%)跟 control 組細胞。而 F2P1(45.2%)以及 F2P2(60.3%)也都明顯 43.

(44) 低於 control 組，以及 F2C1(94.3%)、F2C2(75.4%)的耗氧率。我們發現 OPA1 基因突變是會影響粒線體氧化磷酸化反應的進行，使得細胞耗氧率降低。. 44.

(45) 第四章討論. 45.

(46) OPA1 基因突變造成視神經膠細胞(retinal ganglion cell, RGC)萎縮，直至目前其致病機制仍是大家最想知道的答案。雖然 OPA1 廣泛的分部在全身細胞，但據研究指出，相較於其他細胞，OPA1 在視神經膠細胞分佈是最多的(Aijaz et al, 2004; Bette et al, 2005; Kamei et al, 2005; Pesch et al, 2004)，而視神經膠細胞是能量需求極高的一種細胞，它必須藉由足夠的能量供給作為訊息傳導之用。因此有科學家推測，或許如同其他粒線體疾病，視神經膠細胞萎縮可能是因為 OPA1 基因突變以直接或間接方式造成粒線體能量供給不足，所引發的疾病(Huizing et al, 2005)。而 OPA1 位在粒線體內膜，也就是呼吸傳遞鏈酵素複合體所在主要位置，OPA1 突變也很可能經由直接或是間接方式影響，坐落於 OPA1 蛋白附近的呼吸鏈酵素執行氧化磷酸化的效能，以及 ATP 的合成(Lodi et al, 2004)。因此為了驗證以上假說，先前便有學者以視神經萎縮症病人的 fibroblast 作為研究工具，測試其 ATP 合成能力及粒線體膜電位的變化，但都未在病人的 fibroblast 發現有明顯下降的情形(Spinazzi et al, 2008)。或許是因為 fibroblast 富含粒線體，因此看不到 OPA1 基因突變在能量代謝上有明顯的影響。因此在我們的實驗則改以淋巴球細胞，作為研究的細胞模式。首先，在我們建立的視神經萎縮症病人的淋巴球細胞發現，OPA1 基因突變除了造成 OPA1 蛋白(Fig. 5)及 mRNA(Fig. 6)表現量降外(其降幅 70~80%)，其細胞粒 46.

(47) 線體總數(mitochondrial mass) (Fig. 10)及粒線體 DNA copy number(Fig. 9)都是減少的狀態。這點發現相類似於 Dr. Kim 的研究，他們在病人血液中看到粒線體 DNA 是減少的現象(Kim et al, 2005)。這樣的現象則可能與我們後來的發現相關聯。另外，不同於先前研究團隊針對病人 fibroblasts、muscle cells、 myotubes、或是 lymphoblasts 的研究(Mayorov et al, 2008; Spinazzi et al, 2008)，我們更在病人的淋巴球細胞中發現，粒線體膜電位(Fig. 8)、 ATP 合成能力(Fig. 11)、耗氧率(Fig. 14)等粒線體功能都是屬於低落的情形，且有統計學上的意義。除了使用細胞不同外;所使用的培養液也不同，為避免病人細胞長期處在 mtDNA 合成不足造成細胞提早老化或是死亡的情況，平時我們以培養 Rho-zero(ρ0)細胞的培養液培養細胞，讓細胞也可以藉由 salvage pathway 來維持細胞能量和成及存活，彌補 mtDNA 的不足，在這樣的情況下更能表現 OPA1 影響粒線體的情形，而不是由於粒線體本身 DNA 缺陷所造成的。但在之前的文獻當中，仍然有部分看到病人細胞產生 ATP 的能力有下降的情形(Zanna et al, 2008)，因此這樣的結果仍不能排除 OPA1 基因突變對於細胞進行氧化磷酸化反應、ATP 合成等細胞能量代謝過程的關聯性。值得一提的是，我們在視神經萎縮症病人的淋巴球細胞中偵測到相 47.

(48) 較於正常細胞高的氧化性傷害(Fig. 12)，這樣的氧化性傷害也許正代表著細胞無法正常代謝氧氣，順利產生細胞所需的能量，而使得細胞堆積過多的過氧化物，產生氧化性壓力而造成傷害。不同於在細胞能量代謝上的爭議，我們同樣也在視神經萎縮症病人的淋巴球細胞看到粒線體網絡(mitochondrial network)上的變化，患者細胞大多呈現大量的片段以及碎裂型(Fig. 13)，跟 control 相比增加了約有 50%，與其他研究中使用不同種病人細胞如: fibroblasts、myotubes 均有相類似的結果。這可能和 OPA1 本身最主要的功能，調控粒線體融合有關，因此當 OPA1 基因產生突變時，最先也最直接影響到的即是粒線體動態網絡(mitochondrial network dynamics)，因此在視神經萎縮症病人其他細胞裡也都可以發現這樣的現象(Spinazzi et al, 2008; Zanna et al, 2008)。在 Dr. Spinazzi 的文章中他也提到，ADOA 患者的 myotubes 可觀察到粒線體有分佈不均的現象，但在 fibrobalsts 則看不到同樣的現象，他也推論這樣的情形可能和細胞特異性相關。在我們的研究中，除了使用細胞不同外，也許是由於細胞屬於立體球狀的關係，因此也無法觀察到粒線體分佈上的差異。由以上結果我們知道，OPA1 基因突變對於細胞所造成的各方面的影響，具有細胞特異性，可能跟不同細胞表現在不同組織時，有不同能量需求有關；也可能跟不同組織細胞表現不同 OPA1 isoform 有關， 48.

(49) 因此之前就已經有學者提出，針對這樣具有細胞特異性的表現的現象，研究時不應只針對某種細胞型(cell type)，應更廣泛的加以觀察、實驗。否則難以做確切的判定。另外，視神經萎縮症的臨床症狀也由於其突變位置不同，被證實其影響 OPA1 蛋白表現程度不同，因而具有家族間(inter-family)甚至家族內(intra-family)的差異，由本研究中亦出現這樣的現象。ADOA Family Ι 與 ADOA Family ΙΙ 基因突變位置不同(Fig. 5)，其蛋白質與 mRNA 表現量下降的程度也不同， ADOA Family Ι 病人(F1P)表現量均少於 ADOA Family ΙΙ 病人(F2P1、 F2P2)的表現，但我們也發現這不一定與我們其他的實驗結果呈正相關，例如：雖然 F1P 表現較少量的蛋白質及 mRNA，但在粒線體膜電位、粒線體總數量、mtDNA copy number 及耗氧量上並不是都低於 F2P1、F2P2 的表現；此外 F2P1 跟 F2P2 在粒線體相關實驗結果的表現也不盡相同。我們推測視神經萎縮症病人細胞中，細胞的異常、缺損，不只是由於 wt-OPA1 不足所導致(haploinsufficiency)的，也可能是由於表現 mut-OPA1 所造成，所以在各方面的影響程度才會不盡相同。在本篇研究中，我們目前可以確認的是， OPA1 基因突變在視神經萎縮症病人的淋巴球細胞中會造成(1)粒線體總數量及粒線體 DNA copy number 減少(2) 粒線體網絡、型態的改變(3)細胞能量和成、代 49.

(50) 謝的異常等現象，但我們仍然不能確定的是分子調控機制及其因果關係。 OPA1 基因突變是先傷害 mtDNA 使之數量減少，再經由改變粒線體型態、網絡，間接影響到粒線體氧化磷酸化酵素進行能量和成的過程；還是因為 OPA1 蛋白構型改變，直接影響位於 OPA1 附近粒線體內膜的酵素，干擾氧化磷酸化酵素產生能量，使粒線體功能缺乏數量下降，最後才表現出異常的粒線體型態；亦或者 OPA1 基因突變對於粒線體型態、網絡以及能量和成過程的這兩方面的影響過程是分開的，也就是 OPA1 有可能會同時影響粒線體型態與粒線體能量和成。這部分的問題仍值得之後做更進一步的確認。也有些研究指出在視神經萎縮症細胞中，OPA1 功能的異常會使得細胞增加對 staurosporine 引起細胞凋亡反應的敏感度(Olichon et al, 2007b)，這樣的說法有則又與 OPA1 調控粒線體 cristae 開關、 cytochrome c 釋放有關，雖然在我們實驗中並沒有做到這部分，但也很有可能是造成疾病的原因之一。在未來的研究中，我們計畫分別以 wild type-OPA 1 與 mutant type-OPA1 transfect 到細胞，若細胞是由於正常 OPA1 不足所引發疾病(haploinsufficiency)，那麼在 transfect wild type-OPA 1 後，則可因補足 OPA1 量使得細胞及粒線體功能得到補償、回復的作用；但如果細 50.

(51) 胞是由於存在突變型的 OPA1 所導致疾病(dominant negative effect)，在 transfect mutant type-OPA1 後，便會使細胞及粒線體功能缺失更加嚴重。以這樣的方式我們期望能夠釐清 OPA1 基因突變造成視神經膠細胞萎縮的機制，初步確定是由 haploinsufficiency 還是 dominant negative effect 所造成，往後才能更進一步針對這個疾病加以治療。. 51.

(52) 第五章參考文獻. 52.

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