吸光值先扣除293nm 處基準線(baseline)之吸光值，以增加推得濃度之準確性。其 中D7A、D7H 及 H6R 三種蛋白質有明顯較高之基準線，可推測此三種突變型 β-類澱粉蛋白產生聚集之速率相對較快。
為確保濃度量測之精確性，每次配製之β-類澱粉蛋白皆離心並重新測量濃
度，實驗過程中皆存放在冰上冷卻以避免聚集現象發生，未使用完之溶液保存在 4℃並且不存放超過三天。
為確保蛋白質濃度定量之正確性，除使用Tyrosine 螢光以外也試著以 Bradford assay 測試相同濃度之蛋白質，以比較不同方法定量之一致性。在 Bradford assay 中我們以牛血清蛋白(BSA)為標準品，在 96 孔盤中分別配置成 3、6、9、12、15μg/ml 之不同濃度，與足量之assay dye 混合以後以 Elisa reader 測量 595nm 之吸光值，利 用其獲得之吸光值對濃度做成一校正曲線，再將待測樣品稀釋足夠倍數後與同樣 濃度assay dye 混合，測量吸光值並利用內插法代入校正曲線得到相對應之濃度。
圖5-1-2 為利用 BSA 所得到之校正線。比較表 5-1-2 之 Bradford assay 與光譜法定 量結果，發現同樣利用DU800 定量並調整成 60μM 之 β-類澱粉蛋白，利用 Bradford
測量所得到之濃度約略皆只有一半之大小，可見使用不同定量方法得到之濃度差 不盡相同，中間差異可能來自操作過程中體積誤差等等。儘管其獲得之濃度並不 完全相同但不同蛋白間差異並不大，由於Bradford assay 為定量整體蛋白濃度易受 雜質影響，且光譜法之定量較Bradford assay 來的迅速，因此之後仍以光譜法之濃 度定量為基準。
圖5-1-1、原生型及突變型 β-類澱粉蛋白單體溶液 DU800 吸收光譜。每組溶液皆 取0.2mg 之蛋白質以 200μl 20mM NaOH 溶解後以 800μM HEPES 緩衝溶液再折 疊，取80μl 以 1cm 光徑 cuvette 測量 250~450nm 之吸光值，已扣除 HEPES 緩衝溶 液之空白曲線(blank curve)。
圖5-1-2、利用牛血清蛋白為標準品所獲得之 Bradford assay 校正曲線。在透明 96 孔盤中分別加入3、6、9、12、15μg/ml 之 BSA，並與 40μl Bradford assay dye 混合，
每個孔之最終體積為200μl，混合均勻並避免氣泡產生影響吸光值。
5-2 鋅、銅離子對原生型及突變型 β-類澱粉蛋白單體滴定之自身螢光光譜
為減少緩衝溶液差異造成之實驗誤差，金屬離子溶液皆以與配製蛋白單體溶 液相同批次之緩衝溶液配製。由於鋅、銅離子皆可與溶液中之氫氧根離子反應形 成沉澱，此現象會造成濃度導致的實驗誤差，因此參考文獻在金屬離子中加入四 倍濃度之甘胺酸(Glycine)分子與之形成微弱結合之錯合物60。此結合為非共價性之 結合，很容易就可以將金屬離子釋放出來，因此仍可將此狀態之金屬離子當作自
將各組重複實驗之數據平均後，選取不同金屬濃度下之305nm 螢光讀值，並 且透過下列正規化公式將其正規化後得到銅離子及鋅離子之滴定曲線圖5-2-8 及 5-2-9。
正規化公式：
Data− minimum signal Maximum signal − minimum signal
圖5-2-8 可發現，加入銅離子時 WT、D7N、H6A 三組所得到之滴定曲線較為 接近，D7A、D7H、H6R 三組則可觀察到不同的結合關係。圖 5-2-9 中則發現，H6A 及H6R 兩組與鋅離子之結合不同於其他組，可推測在與鋅離子結合的情況下 Histidine6具有舉足輕重的關係。
圖5-2-1、銅離子對緩衝溶液滴定曲線。銅離子與甘胺酸預先以 1:4 之比例混合以避免形成沉澱物。
圖5-2-2、鋅離子對緩衝溶液滴定曲線。鋅離子與甘胺酸預先以 1:4 之比例混合以避免形成沉澱物。
圖5-2-3、原生型 β-類澱粉蛋白單體溶液濃度改變對自身螢光強度影響測試。比較 25μM 下及加入 10% 體積之緩衝溶液下自身螢光強 度變化。
圖5-2-4、原生型及突變型 β-類澱粉蛋白單體溶液以銅離子滴定之自身螢光光譜。以 270nm 為激發光，讀取 290~360nm 螢光讀值，實 心線條分別為25μM 原生型、H6A、H6R、D7A、D7H、D7N β-類澱粉蛋白之光譜，虛線分別為 25μM 原生型、H6A、H6R、D7A、D7H、
D7N β-類澱粉蛋白加入 200μM 銅離子之光譜。
圖5-2-5、原生型及突變型 β-類澱粉蛋白單體溶液以鋅離子滴定之自身螢光光譜。以 270nm 為激發光，讀取 290~360nm 螢光讀值，實 心線條分別為25μM 原生型、H6A、H6R、D7A、D7H、D7N β-類澱粉蛋白之光譜，虛線分別為 25μM 原生型、H6A、H6R、D7A、D7H、
D7N β-類澱粉蛋白加入 200μM 鋅離子之光譜。
圖5-2-6、原生型及突變型 β-類澱粉蛋白單體溶液銅離子滴定前後自身螢光改變之比例。將 200μM 銅離子下之 305nm 螢光訊號除以 0μM 下之305nm 螢光訊號。
圖5-2-7、原生型及突變型 β-類澱粉蛋白單體溶液鋅離子滴定前後自身螢光改變之比例。將 200μM 鋅離子下之 305nm 螢光訊號除以 0μM 下之305nm 螢光訊號。
圖5-2-8、原生型及突變型 β-類澱粉蛋白單體溶液以自身螢光測定之銅離子滴定曲線。各組資料皆為三重複以上實驗平均值，選取 305nm
圖5-2-9、原生型及突變型 β-類澱粉蛋白單體溶液以自身螢光測定之鋅離子滴定曲線。各組資料皆為三重複以上實驗平均值，選取 305nm
5-3 鋅、銅離子對原生型及突變型 β-類澱粉蛋白單體滴定之 Bis-ANS 光譜
除了自身螢光以外，疏水性螢光染劑Bis-ANS 也被用來檢驗 β-類澱粉蛋白與 金屬離子的結合關係，為了避免Bis-ANS 與溶液中其他分子結合影響實驗結果，
實驗中僅使用極低濃度的Bis-ANS(5μM) ，並且在 β-類澱粉蛋白單體溶液與金屬 離子溶液內皆預先加入等濃度Bis-ANS，使其濃度在滴定過程中保持恆定避免影響 螢光強弱。
加入銅離子Bis-ANS 之螢光圖譜如圖 5-3-1，可發現加入銅離子時 Bis-ANS 之
螢光也會發生淬滅的現象，意味著加入銅離子時將會使β-類澱粉蛋白疏水性區域
裸露減少，可見銅離子確有促進β-類澱粉蛋白聚集之可能。圖 5-3-2 中則可發現，
加入鋅離子時，WT、D7A、D7H、D7N、H6R 之訊號皆上升，代表鋅離子的影響
與銅離子相反，將促使β-類澱粉蛋白之疏水性區域裸露增加。比較其訊號改變大
小如圖5-3-3 及圖 5-3-4，加入銅離子時 WT 與 D7H 有較大的訊號改變，加入鋅離 子則為WT、D7N、D7H 變化最為明顯。
將500nm 之訊號經前述正規化處理後得到圖 5-3-5 及圖 5-3-6 的滴定曲線，觀
察可發現，銅離子的加入對原生型及突變型β-類澱粉蛋白影響之差異不大。但在
加入鋅離子時，除了訊號強度增加而非減少之外，值得特別注意的是，H6A 及 H6R 兩組，在鋅離子存在的情況下表現之行為明顯與其他β-類澱粉蛋白不同，H6A 沒 有顯著的訊號改變發生，H6R 則可觀察到先下降後上升的情況，雖然此結果也再 次告訴我們Histidine6對β-類澱粉蛋白與鋅離子之結合有很大的影響。
圖5-3-1、原生型及突變型 β-類澱粉蛋白單體溶液以銅離子滴定之 Bis-ANS 光譜。以 400nm 為激發光，讀取 450~550nm 螢光讀值，Bis-ANS 濃度為5μM，實心線條分別為 25μM 原生型、H6A、H6R、D7A、D7H、D7N β-類澱粉蛋白之光譜，虛線分別為 25μM 原生型、H6A、
H6R、D7A、D7H、D7N β-類澱粉蛋白加入 200μM 銅離子之光譜。
圖5-3-2、原生型及突變型 β-類澱粉蛋白單體溶液以鋅離子滴定之 Bis-ANS 光譜。以 400nm 為激發光，讀取 450~550nm 螢光讀值，Bis-ANS 濃度為5μM，實心線條分別為 25μM 原生型、H6A、H6R、D7A、D7H、D7N β-類澱粉蛋白之光譜，虛線分別為 25μM 原生型、H6A、
H6R、D7A、D7H、D7N β-類澱粉蛋白加入 200μM 鋅離子之光譜。
圖5-3-3、原生型及突變型 β-類澱粉蛋白單體溶液銅離子滴定前後 Bis-ANS 螢光改變之比例。將 200μM 銅離子下之 500nm 螢光訊號除 以0μM 下之 500nm 螢光訊號。
圖5-3-4、原生型及突變型 β-類澱粉蛋白單體溶液銅離子滴定前後 Bis-ANS 螢光改變之比例。將 200μM 鋅離子下之 500nm 螢光訊號除 以0μM 下之 500nm 螢光訊號。
圖5-3-5、原生型及突變型 β-類澱粉蛋白單體溶液以 Bis-ANS 螢光測定之銅離子滴定曲線。各組資料皆為三重複以上實驗平均值，選取
圖5-3-6、原生型及突變型 β-類澱粉蛋白單體溶液以 Bis-ANS 螢光測定之鋅離子滴定曲線。各組資料皆為三重複以上實驗平均值，選取 500nm 波長經正規化處理作圖。
5-4 鋅、銅離子對原生型及突變型 β-類澱粉蛋白單體滴定之圓二色光譜
圓二色光譜所測定為蛋白質之二級結構變化，此處先以原生型β-類澱粉蛋白
進行測試。圖5-4-1 為利用 NaOH 法所獲得之原生型 β-類澱粉蛋白單體對銅離子滴 定之曲線，可發現以此方法獲得之β-類澱粉蛋白單體傾向 random coil 的二級結 構，在滴定銅離子時雖可發現光譜之變化但二級結構仍未有顯著變化。
觀察圖5-4-1 發現 220nm 附近不同濃度下之 CD 訊號差異較為明顯，因此試著 以time course 測量 220nm 之 CD 訊號 120 秒，重複量測三組後取平均，並將不同 金屬離子下之CD 訊號正規化處理完成滴定曲線。圖 5-4-2 為鋅、銅離子滴定原生
型β-類澱粉蛋白之結果，觀察其滴定曲線未能有顯著的狀態變化。可推測在此實
驗條件下β-類澱粉蛋白與金屬離子結合的過程中並沒有顯著的二級結構變化，因
此不適合用來當作檢測其結合狀態之探子(probe)。
圖5-4-1、以銅離子對原生型 β-類澱粉蛋白滴定之圓二色光譜。β-類澱粉蛋白之濃度為 25μM，重複量測 180~250nm 之光譜並平均
210 215 220 225 230 235 240 245 250
ellipticity(mdeg)
圖5-4-2、以圓二色光譜獲得之鋅、銅離子對原生型 β-類澱粉蛋白之滴定曲線。原生型 β-類澱粉蛋白之濃度為 25μM，以 1 秒間隔測量 220nm 之 CD 訊號 120 秒，並重複三次後平均，正規化後作滴定曲線。
5-5 不同方法獲得之滴定曲線比較與自身螢光滴定曲線之 fitting
前述5-2~5-4 的部分，分別使用 Intrinsic fluorescence、Bis-ANS fluorescence、
及Circular dichroism 三種光譜法來檢驗原生型及突變型之 β-類澱粉蛋白與金屬結 合的關係，將其正規化之訊號做比較如圖5-5-1~5-5-12。比較發現，以不同光譜法 所獲得之滴定曲線雖不相同，然而差異並不大，大致上可看出相同趨勢，圖5-5-10 及圖5-5-12 中鋅離子對 H6A、H6R 突變型可能因蛋白質本身性質改變造成 Bis-ANS 之訊號異常。
於此，我們試著將變化較為一致intrinsic fluorescence 結果，利用 Origin 軟體 以不同的方程式fitting，以試著解釋各種不同 β-類澱粉蛋白與金屬結合之可能機 制。
One-site specific binding equation：
Y =B ∗ X
合的情況下，D7位置突變型與H6位置突變型有明顯的差異，可見與突變之胺基酸
合的情況下，D7位置突變型與H6位置突變型有明顯的差異，可見與突變之胺基酸