2-1 神經退化性疾病(neurodegenerative disease)
神經退化性疾病泛指因神經元(neurons)的結構或功能喪失甚至死亡所造成的 疾病。神經元為構成腦部及脊髓(spinal cord)的重要成分，且不易再生，一旦受損 將對人體造成永久性的傷害。依照外顯症狀，神經退化性疾病可分為造成運動問 題的運動失調症(ataxia)及造成記憶問題的失智症(dementia)1。
2-1-1 類澱粉症(Amyloidosis)
部分神經退化性疾病與不正常摺疊的蛋白質(misfolded proteins)有關，蛋白質 在體內合成的過程中有時會發生錯誤摺疊(misfolding)而造成蛋白質構形
(conformation)改變，通常體內的蛋白酶(protease)會將這些蛋白質分解(digest)，然 而類澱粉蛋白通常會形成具有β-曲折平面(β-pleated sheets)的構型，此種構形具有 疏水性(hydrophobic)的特質，使蛋白酶無法作用，進一步造成類澱粉蛋白的不正常 聚集(aggregation)與沉積(deposition)，最後導致細胞的死亡2,3。
此沉積現象可能是全身性(systematic)也可能是局部性(organ-specific)的發生，大部 分的類澱粉症具有遺傳性，肇因於前驅蛋白(precursor protein)基因的突變。
直到2010 年為止已發現至少三十種以上澱粉症與相關之蛋白，如 α-synuclein、
β-amyloid、β2-microglobulin、Insulin 等，各種類澱粉蛋白及相關疾病列於表 2-1-1 中。
表2-1-1、類澱粉症與致病蛋白一覽表
類澱粉症名稱 致病蛋白
神經退化性疾病(neurodegenerative disease)
Alzheimer’s disease Amyloid-β peptide Parkinson’s disease α-synuclein
Huntington’s disease Huntingtin with polyQ expansion
Amyotrophic lateral sclerosis Superoxide dismutase 1 Spinocerebellar ataxias Ataxins with polyQ expansion
Spinocerebellar ataxia 17 TATA box-binding protein with polyQ expansion
Spinal and bulbar muscular atrophy Androgen receptor with polyQ expansion
Hereditary dentatorubral-pallidoluysian atrophy Atrophin-1 with polyQ expansion Familial British dementia ABri
Familial Danish dementia ADan 非神經全身性疾病(Non-neuropathic systematic
amyloidoses)
AL amyloidosis Immunoglobulin light chains or fragments
AA amyloidosis Fragments of serum amyloid A protein
Senile systemic amyloidosis Wild-type transthyretin Familial amyloidotic polyneuropathy Mutants of transthyretin
Hemodialysis-related amyloidosis b2-Microglobulin Finnish hereditary amyloidosis Fragments of gelsolin mutants Lysozyme amyloidosis Mutants of lysozyme
Fibrinogen amyloidosis Variants of fibrinogen α-chain Icelandic hereditary cerebral amyloid
angiopathy
Mutant of cystatin C
表2-1-1、類澱粉症與致病蛋白一覽表(續) 非神經局部性疾病(Non-neuropathic
localized diseases)
Medullary carcinoma of the thyroid Calcitonin
Type II diabetes Amylin (islet amyloid polypeptide, IAPP)
Atrial amyloidosis Atrial natriuretic factor Hereditary cerebral hemorrhage with
amyloidosis Mutants of amyloid-b peptide Pituitary prolactinoma Prolactin
Injection-localized amyloidosis Insulin Aortic medial amyloidosis Medin
Hereditary lattice corneal dystrophy Mainly C-terminal fragments of kerato-epithelin
Corneal amyloidosis associated with trichiasis Lactoferrin
Cataract γ-Crystallins
Pulmonary alveolar proteinosis Lung surfactant protein C Inclusion-body myositis Amyloid-b peptide Cutaneous lichen amyloidosis Keratins
2-1-2 阿茲海默症
阿茲海默症(Alzheimer’s disease，AD)是由德國病理學家 Alois Alzheimer 發現並以 其命名。一般好發於65 歲以上年長者，約占失智症病例的 60%~80%。
阿茲海默症的病理特徵包含大腦皮質(cerebral cortex)及部分皮質下神經元(neurons) 及突觸(synapses)的損失，進而造成腦組織萎縮。此外患者的腦部可發現由 β-類澱 粉蛋白聚集成的類澱粉纖維斑塊(amyloid plaque)沉積與過度磷酸化
(hyperphosphorylated )之 tau 蛋白聚集成的神經纖維糾結(neurofibrillary tangles)，此 二者皆被認為是阿茲海默症的可能致病因素4,5。
2-1-3 類澱粉前驅蛋白(amyloid precursor protein，APP)與 β-類澱粉蛋白之形成
β-類澱粉蛋白是由類澱粉前驅蛋白代謝形成，類澱粉前驅蛋白為一種穿膜蛋白 (transmembrane protein)，因其部分胺基酸序列位於細胞膜內，另一部分則暴露在細 胞膜外。
此蛋白質因mRNA 的 alternative splicing 造成五種不同的蛋白質異構物(isoform)，
分別為APP593、APP695、APP714、APP751 及 APP770，其中又以 APP695 及 APP751 在人類腦部出現最多。此蛋白在人體的功能眾說紛紜，目前已知其可與金屬結合 (鋅、銅)，APP751 及 APP770 具有 Kunitz 蛋白脢抑制，並具有神經營養(neurotrophy) 與吸附區域等等，但其真正主要功能至今仍無人知曉。
類澱粉前驅蛋白會受α-secretase、β-secretase、及 γ-secretase 三種不同的蛋白 酶分解，因而產生兩個不同的代謝路徑。
第一種代謝途徑中，α-secretase 將類澱粉前驅蛋白切成可溶性的 N 端 APPsα 及C 端 APP-CTFα，其中 APPsα 被認為具有保護神經的作用，而留在細胞膜上的 APP-CTFα 則接著被 γ-secretase 切成 N-端的可溶 p3 片段及接在膜上的 C 端 AICD (APP intracellular domain)，AICD 被認為是一種與細胞核訊息傳遞有關的蛋白質。
在產生β-類澱粉蛋白的途徑中，β-secretase 先將類澱粉前驅蛋白切成可溶性的 N 端 APPsβ 及 C 端 APP-CTFβ，緊接著 γ-secretase 將 APP-CTFβ 切成 β-類澱粉蛋 白與AICD 兩個部分。
α-secretase 與 β-secretase 在這個代謝的過程中處於競爭的狀態，因此不少學者 亦致力於如何增加α-secretase 的效率以減少 β-類澱粉蛋白的產生6。
圖2-1-1、APP 之結構與各區域之功能7
圖2-1-2、APP 代謝之兩種不同途徑示意圖8
2-1-4 類澱粉蛋白致病假說(amyloid cascade hypothesis) 與 β-類澱粉蛋白之聚集
如2-1-2 所述，在阿茲海默患者腦部中，可以發現被大量神經纖維糾結包圍的 類澱粉纖維斑塊，以及顯著的神經細胞損失，然而究竟何者才是最初的致病因素，
一直以來仍是極具爭議性的問題。
1991 年 John A. Hardy 和 Gerald A. Higgins 在 science 上發表了著名的類澱粉蛋 白致病假說9，他們認為β-類澱粉蛋白的形成與聚集是阿茲海默症的起始因素，並 直接導致了之後的神經纖維糾結、細胞死亡及失智症。而許多其他因素皆有可能 啟始β-類澱粉蛋白的沉積，並間接導致阿茲海默症的發生。
如2-1-4 所述，β-類澱粉蛋白由類澱粉前驅蛋白代謝形成，隨 C 端長度不同可
形成Aβ38~42之不同形式。大部分的Aβ 皆以 Aβ40的形式存在，然而Aβ42較容易聚
集與纖維化，為構成腦部斑塊的最主要成分，可見儘管只是數個胺基酸的差異也 會對其性質造成極大影響。目前也有許多研究試著以斑塊中Aβ40 與 Aβ42的比例 做為阿茲海默症診斷的依據10,11。
β-類澱粉蛋白的單體(monomer)在溶液中呈現隨機狀之構形，然而在聚集的過 程中轉變成為β-sheet 之構形。並經由數個單體的結合形成寡體(oligomer)，此過程 稱為成核反應，需要較長的時間，一旦形成之後將快速結合形成纖維(fibril)並沉澱。
目前研究證據指出，類澱粉蛋白形成的斑塊可能並不是造成細胞死亡的主要原因
而是結果，反而是β-類澱粉蛋白形成之可溶性寡體被發現對細胞具有較高毒性，
可能是真正導致細胞死亡的元兇12,13。
圖2-1-3、β-類澱粉蛋白之序列與 β-sheet 結構
圖2-1-4、β-類澱粉蛋白聚集示意圖14
圖2-1-5、類澱粉蛋白致病假說示意圖16
2-1-5 家族性阿茲海默症(Familial alzheimer’s disease)
一般主要發生在六十五歲以上患者的稱為偶發性(sporadic)阿茲海默症，然而 有部分的患者因為Presenilin1、Presenilin2、或類澱粉前驅蛋白之基因突變
(mutation)，這些基因的突變會影響 α、β、γ 三種酵素的活性，影響 APP 的代謝途 徑，導致家族遺傳性的阿茲海默症發生，此類型患者通常發病年齡較早，因此又 稱為早發性(early onset)阿茲海默症。
表2-1-2 為類澱粉前驅蛋白上之各種突變型，其名稱是由發現該病例之地點而 決定。目前已發現的所有早發性突變基因可以在Alzheimer Disease &
Frontotemporal Dementia Mutation Database17之網站找到。
其中在類澱粉前驅蛋白上之突變如果正好在β-類澱粉蛋白的序列上就會產生
突變型的β-類澱粉蛋白，這些突變型的蛋白往往會有不同的聚集機制甚至結構進
而導致阿茲海默症的發生。表2-1-3 為突變型 β-類澱粉蛋白之整理。
表2-1-2、類澱粉前驅蛋白之基因突變與形成之蛋白質序列
突變型 APP 序列 形成 Aβ 序列 造成影響
Swedish K670N
M671L - 顯著增加β-類澱粉蛋白之產生18 English H677R H6R 加速 β-類澱粉蛋白纖維形成19,20 Japanese-Tottori D678N D7N 加速β-類澱粉蛋白纖維形成19-21 Taiwanese D678H D7H 增加 β-類澱粉蛋白寡體形成22
Flemish A692G A21G 抑制β-secretase 作用23 Dutch E693Q E22Q 加速 β-類澱粉蛋白聚集23,24
Italian E693K E22K 抑制蛋白脢降解25
Arctic E693G E22G 抑制蛋白脢降解25,26
Iowa D694N D23N 加速 β-類澱粉蛋白聚集27
French V715M - 造成 truncated form β-類澱粉蛋白28 German V715A - Aβ42/Aβ40比例升高29
Florida I716V - 影響γ-secretase 作用30,31 London V717I - 影響γ-secretase 作用31 Indiana V717G
V717F - 影響γ-secretase 作用32 Australian L723P - 增加β-類澱粉蛋白之產生33
表2-1-3、突變型 β-類澱粉蛋白支鏈性質變化
突變型 胺基酸變化 支鏈性質變化
English H6R 鹼性→更鹼，較大支鏈造成立體障礙
(stereo hinderance) Japanese-Tottori D7N 酸性→中性
Taiwanese D7H 酸性→鹼性
Flemish A21G 疏水→疏水，支鏈較小
Dutch E22Q 酸性→中性 Italian E22K 酸性→鹼性 Arctic E22G 酸性→疏水 Iowa D23N 酸性→親水
圖2-1-6、已發現類澱粉前驅蛋白序列上之各種突變型34
2-1-6 金屬離子對阿茲海默症之影響 自由基(reactive oxygen species, ROS)兩種角色，就算只是小於 μM 濃度的金屬離子 也被發現可幫助β-類澱粉蛋白的聚集。 技術研究，如核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)圖譜、電子順磁共振 (electron paramagnetic resonance, EPR)圖譜、圓二色光圖譜(circular dichroism, CD) 及質譜儀(mass spectrometry, MS)等等。雖詳細的結構仍未有定論，然可以確定的
是，各種實驗證據皆顯示β-類澱粉蛋白上的三個組胺酸(histidine)：H6, H13, H14 與N 端蛋白質與金屬離子鍵結有密不可分的關係41。
研究認為β-類澱粉蛋白與金屬的鍵結位置在 1~16 個胺基酸42-44，因此部分研究選 用Aβ1-16來進行此種實驗，因為此β-類澱粉蛋白片段不會發生聚集影響實驗。Aβ1-28
也被廣泛的使用於研究之中，此片段包含了金屬離子結合區間，並且可以在溫和 的環境下緩慢的發生聚集，因此在進行相關實驗時蛋白質的選擇是必須先考量的 問題。表2-1-4 至 2-1-6 為與金屬離子結合相關的文獻整理。
儘管金屬離子對阿茲海默症真正的影響仍無人知曉，已有許多研究設計可進入血 腦屏障(blood brain barrier,BBB)的小分子金屬螯合劑(chelator)45，試圖以回復腦中 金屬離子濃度恆定的方式達到延緩或治療阿茲海默症的目的，其中部分藥品如 clioquinol 已進入第二階段的試驗，說明了此理論確實有治療阿茲海默症的潛力，
但為了能夠真正找出此世紀絕症解藥，更多研究仍等待進行。
表2-1-4、β-類澱粉蛋白與金屬離子配位結構文獻整理46-54
Cu Asp1, Ala2, Glu3, Phe4, His6, His13, His14
NMR Aβ16 Zn Asp1, His6, Tyr10, His13, His14
表2-1-5、β-類澱粉蛋白與銅離子結合常數估算文獻整理43,47,55-64
實驗方法 β-類澱粉蛋白 緩衝溶液 解離常數(nM)
Potentiometry Aβ16,28 0.21/0.024
Tyrosine
fluorescence Aβ40,42 10mM Tris 1600-2000 Tyrosine
fluorescence Aβ16,28 Gly(His) 100 Tyrosine
fluorescence Aβ16,28,40 100mM Tris 11000-47000 Tyrosine
fluorescence Aβ16 Gly(His) 10-100
Tyrosine
表2-1-5、β-類澱粉蛋白與銅離子結合常數估算文獻整(續) Tyrosine
fluorescence Aβ40 20/50/100mM Tris 1200/3800/30000
ITC Aβ16,28 50mM Hepes 100
ITC Aβ16,40 Gly 0.4
NMR Aβ40 5mM PO4- 16000
表2-1-6、β-類澱粉蛋白與鋅離子結合常數估算文獻整理43,47,50-56
實驗方法 β-類澱粉蛋白 緩衝溶液 解離常數(nM)
Tyrosine
fluorescence Aβ40,42 10mM Tris 300000/57000 Tyrosine
fluorescence Aβ40 10/100mM Tris 60000/184000 Tyrosine
fluorescence Aβ40 20mM Hepes 65000 Tyrosine
fluorescence Aβ16,40,42 100mM Tris 1000-10000 ITC Aβ16,28,40 Hepes/Tris 22000/10000/7000
圖2-1-7、β-類澱粉蛋白與金屬結合之可能結構示意圖65
2-2 蛋白質檢測方法簡介與原理 2-2-1 自身螢光光譜
形成蛋白質的氨基酸裡，其中三種胺基酸帶有苯環，分別是：色胺酸
(Typtophan)、酪胺酸(Tyrosine)、苯丙胺酸(Phenylalanine)，因其苯環的結構，在特 定波長的激發光下可使其產生螢光，此現象稱為蛋白質的自身螢光(Intrinsic fluorescence)。
如表2-2-1 所示，這三種胺基酸各自有不同的螢光特徵，一個蛋白質所發出的 螢光為其包含的所有芳香族胺基酸螢光之總和，一般使用280nm 或 295nm 的激發 光來誘導自身螢光產生。
色胺酸的螢光是三者裡最強的，且其螢光強度、最大螢光發生波長皆與溶劑 有很大相關性，當色胺酸附近的溶劑極性下降，可觀測到螢光藍移及強度上升的
色胺酸的螢光是三者裡最強的，且其螢光強度、最大螢光發生波長皆與溶劑 有很大相關性，當色胺酸附近的溶劑極性下降，可觀測到螢光藍移及強度上升的