中文名稱 廠商 型號
蛋白質分光測定儀 eppendorf BioPhotometer
螢光分光光譜儀 Horiba Jobin Yvon FluroMax-3
圓偏極光分光譜儀 Jasco J-815
微量分光光度計 J&H ND-1000
紫外光光譜儀 BeckManCoulter DU800
快速蛋白質液相層析儀 GE AKTA UPC-900
震盪器 Fine-votex FINEPCR
超音波震盪器 BRANSON 3510
乾浴槽 BasicLife BL3001
低溫震盪培養箱 YIH DER LM570-R
可調式微量吸管 Eppendorf
電泳槽 Bio-Rad Mini protean tetra system
自動分注器 Hamilton Microlab500
快速高壓滅菌器 Tomin TM-329
微量盤分析儀 Molecular Devices SpectraMax-M5
電磁加熱攪拌器 LMS HTS-1003
真空冷凍乾燥機 PANCHUM FD-1240-85H
聚合酶連鎖反應器 eppendorf Autorisierter thermocycler
高壓微流細胞粉碎機 Microfluidics M-110L
全自動洗片機 Kodak Medical X-ray processor 微量電子天平 METTLER TOLEDO AX105
電子天平 METTLER TOLEDO PB3002-S
4℃冰箱 DEI DEI-635
-20℃冷凍櫃 SANYO MDF-U730
-80℃冷凍櫃 Thermo Forma700
4-2 實驗藥品
4G8 antibody CHEMICON
6E10 antibody COVANCE
Ampicillin sodium salt Calbiochem Ammonium persulfate (APS) Bio-Rad
Acetic acid Merck
Acetonitrile Lab-scan Ammonium chloride (15N labeled) Cambridge Isotope Laboratories
Brovine serum albumin (BSA) Sigma 4,4'-bis(1-anilino-8-naphthalene sulfonate)
[Bis-ANS]
Sigma
Coomassie brilliant Blue G250 J.T.Baker Copper(II) chloride Riedel-de Haen
DNaseI Sigma 1,4 Dithiothreitol (DTT) Merck
Electrochemiluminesence (ECL) kit PerkinElmer
Ethanol Merck Glycine J.T.Baker Glycerol J.T.Baker D-Glucose Merck Goat anti mouse IgG antibody invitrogen
Hydrochloric acid Merck
HEPES free acid Merck
Isopropylthio-β-galactoside (IPTG) amresco
Imidazole Merck Luria-Bertani (LB) broth, miller Protech
Mercaptoethanol Sigma
Magnesium sulfate‧7H2O Merck
Methanol 友和
Protease inhibitor Roche
Potassium dihydrogen phosphate Merck
RNaseA Roche Sodium dihydrogen phosphate anhydrous Merck
Sodium dodecyl sulfate (SDS) amresco
Sodium chloride Protech
Sodium hydroxide Merck
Sodium azide ACROS
TFA(Trifluoroacetatic acid) Sigma
Tween-20 Merck Tetramethylethylenediamine (TEMED) Merck
Tricine Sigma Tris Bioman Tris(2,2'-Bipyridyl)Ruthenium(II)Chloride,
Hexahydrate (Rubpy)
Aldrich
Urea Protech
Zinc chloride Riedel-de Haen
Synthetic amyloid beta protein
(Aβ40 Wild type, D7H, D7N, D7A, H6A, H6R)
余惠敏博士實驗室協助合成
TEV-protease 楊安綏博士實驗室提供
4-3 實驗步驟
4-3-1 溶液配製
4-3-1-1 HEPES buffer 配製
1. 以 ddH20 配置含有 150mM NaCl 之 25mM HEPES 緩衝溶液。 20mM NaOH 溶液中使其去摺疊(unfolding)。
2. 將其置於冰浴中以超音波震盪 5 分鐘以幫助溶解並避免沉澱。
(A = ε‧L‧C，ε280 = 1280 M-1 cm-1， L = 1 cm)。 20ml 及 50μg/ml ampicillin。
4-3-1-7 Lysis buffer 配製
1. 取足量之 Tris 以 ddH2O 配置成 20mM 濃度。
4-3-1-9 Transfer buffer 配製
1. 取 28.8g Glycine 與 6.06g Tris。
2. 加入 200ml methanol。
3. 加 ddH2O 至 2L。
4. 以 0.22μm filter 過濾後儲存於 4℃。
4-3-1-10 Tricine-SDS-PAGE buffer 配製 4-3-1-10-1 cathode buffer 配製
1. 取 Tris 及 Tricine 以 ddH2O 調整至 0.1M。
2. 加入 0.1% SDS。
3. 將 pH 值調整至 8.25。
4. 以 0.22μm filter 過濾後儲存於室溫。
4-3-1-10-2 anode buffer 配製 1. 以 ddH2O 配製 0.1M Tris。
4-3-1-10-4 4x reducing sample buffer 配製 1. 配製 150mM Tris。
2. 將 pH 值調整至 7.0
3. 加入 12% SDS、6% mercaptoethanol、30% glycerol 及 0.05% coomassie blue G-250。
4. 儲存於室溫。
4-3-1-10-5 Coomassic blue 染劑配製
1. 取 2.5g Coomassie brilliant Blue G250。
2. 加入 500ml Methanol 及 100ml acetic acid。
3. 加 ddH2O 至 1L。
4. 儲存於室溫。
4-3-1-10-6 Destaining buffer 配製
1. 將 250ml ethanol 與 70 ml acetic acid 混合。
2. 加水至 1L。
3. 儲存於室溫。
4-3-1-11 FPLC buffer 配製 4-3-1-11-1 Running buffer 配製 1. 以 ddH2O 配製 20mM Tris。
2. 加入 150mM NaCl、5M urea。
3. 將 pH 值調整至 8.0。
4. 以 0.22μm filter 過濾後儲存於 4℃。
4-3-1-11-2 Elution buffer 配製 1. 以 ddH2O 配製 20mM Tris。
2. 加入 150mM NaCl、5M urea。
3. 加入 500mM imidazole。
4. 將 pH 值調整至 8.0。
5. 以 0.22μm filter 過濾後儲存於 4℃。
4-3-1-12 HPLC buffer 配製 4-3-1-12-1 Buffer A 配製
1. ddH2O 配製 20% acetonitrile。
2. 加入 0.05%TFA。
3. 以 0.22μm filter 過濾。
4-3-4 以圓偏極光觀察金屬離子與 β-類澱粉蛋白及其突變種之鍵結關係
2. 將保存在-80℃中之 pET14b-Aβ DH5α 取少許塗盤在含有 50μg/ml ampicilin
抗生素的agarose plate 上並在培養箱中 37℃隔夜培養。
3. 取出長出的單一菌株(single colony)放入 5ml LB broth，並以 37℃, 200rpm 振盪 在培養箱中隔夜培養。
4-3-6-2 以定點突變(site-directed mutagenesis)獲得突變型 pET14b-Aβ40表現型菌株 1. 利用 Agilent Technologies company 的 Quick Change Primer Design Program 網
頁功能設計各突變型之適當正/反引子(sense/anti-sense primer)，詳見附錄 A。
2. 向 genomics company 訂購設計之引子。
3. 將先前抽取之原生型質體稀釋至 10ng/ml。
4. 混合 1μl dNTPmix、2μl sense/anti-sense primer、3μl plasmid、5μl pfuUltraII reaction buffer、36μl ddH2O 以及 1μl 去氧核醣核酸聚合酶。
5. 以聚合鏈反應器進行鏈聚合反應(polymerase chain reaction)。
6. 加入 1μl DpnI 酵素在 37℃下反應 1 小時以去除原生型質體留下突變後質體。
7. 取出 1.5μl 反應後之質體，與 20μl DH5α 勝任細胞(competent cell)混合。
8. 在 42℃中加熱 45 秒進行熱刺激(heat shock)以幫助細胞轉殖(transform)。
9. 加入 200μl LB Broth 並以培養箱 37℃培養 1 小時以幫助細胞恢復(recover)。
10. 取出 100μl 菌液將其塗盤在含有 50μg/ml ampicillin 之 agarose plate 上並在培養
箱中 37℃隔夜培養以篩選成功轉殖菌株。 ampicillin 之 agarose plate 上，37℃隔夜培養。
2. 選取單一菌株，加入 50ml LB broth，以 37℃，200rpm 震盪培養箱隔夜培養。
10. 加入 0.5mM IPTG 誘導(induction)菌體表現(expression)目標蛋白。
11. 以 37℃，200rpm 隔夜培養。
18. 加入 20ml lysis buffer，1mM DTT、50mM MgCl2、0.02mg DNaseI 及足量 protease inhibitor，以攪拌子室溫下攪拌一小時。
19. 以 4℃，15000g 離心 30 分鐘，去除上清液。
20. 加入含有 5M urea 之 Lysis buffer 5ml，4℃下攪拌一小時。
21. 以 4℃，15000g 離心 30 分鐘，去除殘餘細胞碎片。
22. 將上清液以 0.22μm filter 過濾後，以 FPLC 進行純化並收集純化之蛋白質。
23. 以 SDS-PAGE 確認目標蛋白之位置。
24. 收集含有目標蛋白之溶液，加入 lysis buffer 以 20kDa cut-off 之 Centricon 透析 並濃縮目標蛋白。
25. 以 Branford assay 測試濃縮後蛋白濃度。
26. 加入足量 TEV-protease 及 1mM DTT，與目標蛋白均勻混合，4℃下隔夜反應 以除去目標蛋白上之His-tag。
27. 將反應後溶液以 0.22μm filter 過濾，以超音震盪除氣(degas)後使用 reverse phase 之 HPLC 純化。
28. 以離心管蒐集純化之蛋白質，以液態氮冷卻後凍乾。
29. 秤重並儲存於-20℃，並以 Tricine-SDS-PAGE、免疫轉漬法確認目標蛋白質之 位置及純度。
4-3-6-4 以 SDS-聚丙烯醯胺膠體電泳(SDS-PAGE)進行蛋白質成份分析
4-3-6-4-3 以直流電源供應器進行 Tris-SDS-PAGE
1. 將待分析蛋白以 ddH20 溶解，並與 sample buffer 混合。
4-3-6-4-4 以直流電源供應器進行 Tricine-SDS-PAGE
4-3-6-5 以免疫轉漬法(immunoblot)分析蛋白質之成分
4-3-6-5-1 以 dot-blotting 進行蛋白質成份分析
12. 將 ECL kit 中 500μl enhance luminor reagent 與 500μl oxidizing reagent 混合後均 勻滴在薄膜上使其與 GM 抗體結合。
13. 將底片暴露在薄膜上 5 分鐘成像，並以自動洗片機顯影。
4-3-6-5-2 以 western-blot 進行蛋白質成分分析 1. 重複 4-3-6-4-4 中步驟 1~6。
2. 裁剪 6cm x 10cm 之 PVDF(Polyvinylidene difluoride) membrane，並以甲醇浸泡 以活化(activate)。
3. 將電泳後膠片與 PVDF membrane 重疊，放入電泳槽，並加入 transfer buffer 與冷卻劑。
4. 以 250 毫安培，30 分鐘進行橫向電泳，將膠片蛋白質上之蛋白質轉移(transfer) 到PVDF 薄膜上。
5. 將 10%的奶粉溶解在 TBST 溶液中。
6. 將 PVDF membrane 浸泡在上述溶液半小時以封閉(blocking)薄膜上未結合的 位置。
13. 將 ECL kit 中 500μl enhance luminor reagent 與 500μl oxidizing reagent 混合後取 均勻滴在薄膜上使其與GM 抗體結合。
4-3-7 以光誘導交聯法檢驗蛋白質形成寡體差異性
1. 將 25μM 原生型 β-類澱粉蛋白單體溶液與不同濃度之金屬離子混合。
2. 在避光情況下取 18μl 加入 1μM 之 Tris(2,2'-bipyridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate (Ru(bpy)) 1μl。
3. 加入 1μl 10mM APS。
4. 以 LED 燈照射 30 秒使其反應交聯。
5. 反應完成之蛋白質以 4-3-6-5-2 步驟進行 western blot 以確認其成分。
6. 改為突變型蛋白並重複步驟 1-5。
4-3-8 以自動滴定儀進行去摺疊及再折疊實驗
1. 將溶解於 130mM Tris 緩衝溶液之 0.3mg/ml 去氧核醣核酸酶 A 溶液 600μl 放入 1cm 光徑 700μl 之 micro cuvette.
2. 將去活性劑(尿素/胍鹽酸)與去氧核醣核酸酶 A 混合至與 cuvette 相同濃度。
3. 將含有去氧核醣核酸酶 A 之去活性劑裝載入自動分注器之管柱 A，並去除管中 多餘氣泡避免影響實驗。
4. 將 cuvette 放入螢光光度儀。
5. 將與管柱 A、B 連結之注入管放入 cuvette 約至液面下 2cm 處，並緊靠邊緣避 免影響光徑。
6. 將滴定體積、混合體積、次數，激發光波長及吸收光波長設定完成後開始實驗。