3-1 實驗藥品
藥品名 廠牌
2-Mercaptoethanol (2-ME) Sigma-Aldrich 4-Mercapto-1-butanol (4-MB) Sigma-Aldrich 6-Mercapto-1-hexanol (6-MCH) Fluka 11-Mercapto-1-undecanol (11-MUD) Sigma-Aldrich 16-Mercaptohexadecanoic acid (16-MHA) Sigma-Aldrich
Acetone (DMK) Fisher Methanol (MeOH) Fisher Ammonium hydroxide solution (NH3) 28.0-30.0% Sigma-Aldrich
Biotin (C10H16N2O3S) Sigma-Aldrich D-Glucose anhydrous (C6H12O6) Fisher
Dimethylformamide (DMF) Fisher Ethanol (EtOH) Fisher Hydrochloric acid fuming 37% Merck Streptavidin (IRDye 800CW ) LI-COR N,N’-Dicyclohexylcarbodiimide，99% (DCC) Alfa Aesar
N,N-Diisopropylethylamine，98+% (DIPEA) Acros N-Hydroxysuccinimide (NHS) Sigma-Aldrich PEG Amine 8 arm (tripentaerythritol)，MW10000 Jenkem Technology
Phosphate buffered saline (PBS) Fisher Polysine slides Thermo Silver nitrate (AgNO3) Acros Sodium borohydride (NaBH4) Acros Sodium hydroxide-pearl (NaOH) Fisher Succinic anhydride (C4H4O3)，99% Alfa Aesar Tetrachloroauric(III) acid trihydrate (HAuCl4 · 3H2O) Acros
表格 1 實驗藥品
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3-2 實驗器材及儀器介紹
3-2-1 恆溫循環水槽(FIRSTEK B401H)
勢動科技有限公司 (ACTTR Technology) B400 系列低溫循環水槽數位式 顯示基本型，加熱功率可提供1KW，降溫能力 600Kcal/hr。工作溫度範圍通常 為0~100℃。循環能力 7L/min;0.2Kg/cm2。內槽容積6.7L。可搭配迴轉式恆溫 水槽，可將迴轉式恆溫水槽降至室溫以下的溫度。為實驗室常用控制溫度儀器 設備。
圖 16 恆溫循環水槽
3-2-2 迴轉式恆溫水槽(B601D)
益之堂科技公司(Firstek)微電腦全自動 PID 控制器，觸控薄膜數位式設定 及顯示可提供 1.2KW 的加熱功率。工作溫度範圍 5℃~100℃。震盪速度 20~200rpm。提供反應固定溫度及震盪速度。
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圖 17 迴轉式恆溫水槽
3-2-3 玻片迷你微量離心機(LP-1414)
勤研科技有限公司製作，可快速離心轉乾兩片玻璃片。關蓋自動運轉，開 蓋自動停止運轉。最高轉速/離心力：4800rpm/1750xg。較為方便、簡單快速，
不需要氮氣吹乾。具有ON / OFF 開關，操作方便。
圖 18 玻離片迷你微量離心機
3-2-4 紫外光-可見光光譜儀(UV-Visible spectrophotometer)
UV/VIS 光譜，當分子中的電子間遭受到光線的照射時，會吸收特定的 能量，一般而言，不同的光線能量會造成不同的電子躍遷，在紫外光/可見光 的範圍，即形成UV/VIS 光譜。由於每一特定的官能基，均會有特定波長的 吸收，因此可藉由UV 光譜做為分子官能基定量測量工作
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圖 19 紫外光-可見光/近紅外光光譜儀
3-2-5 迴轉式震盪器(OS-701)
雙鷹企業有限公司(DEAGLE)製作。一般廣泛應用於組織培養之震盪實 驗。採用無噪音馬達，載重量大，運轉平穩無聲，並具緩慢啟動設計。提供 固定的搖晃速率，轉速範圍10-250 r.p.m.，以維持反應穩定。
圖 20 迴轉式震盪器
3-2-6 掃描式電子顯微鏡
(Scanning Electron Microscope，SEM)主要用於研究樣品表面形貌狀態，使用高能電子束經過透鏡聚焦於樣品 上，此時樣品表面受到電子束撞擊後，產生二次電子，使用接收器收集檢測 到的二次電子的數量，以產生樣品之形貌狀態。當內層電子被擊出後，外層 電子掉入原內層電子軌道而放出X 光，由此可以分析樣品元素成分。
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3-2-7 16 孔盤(FAST frame slide holders)
可剛好和79mm x 25.4mm 之玻璃片配對穩和，且每片有 16 個小分隔且彼 此獨立互不干擾，每格大小為7mm x 7mm x4 mm(L x W x D)。每格體積量約 為100μL。因此可以滴入不同濃度之螢光物質，以達到一片多用途的功能。
圖 21 多功能檢驗用 16 孔盤
3-2-8 微陣列螢光掃描儀
(Microarray Fluorescence Scanning Device) 是一種雙通道近紅外共聚焦顯微鏡掃描儀，用在標準玻璃或載玻片上成像 組織，細胞和微陣列。主要掃描固態螢光物質，包含波長為 647nm 及 785nm 兩雷射。用於高靈敏度檢測的定制分析開發，可在玻片點上超低樣品量（<5 ul）不同濃度之螢光物質，達到螢光成像檢測目的。
圖 22 微陣列螢光掃描儀
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3-3 實驗步驟
3-4-1 清洗玻璃載玻片及羧酸化
將玻璃載玻片表面由胺基(NH2) 修飾為羧酸(-COOH)：
1. 先清洗數片玻璃載玻片(polysine slides)，依序使用丙酮(Acetone)、甲醇 Methanol (MeOH)及去離子蒸餾水(Distilled De-Ionized water)經過超音波 震盪五分鐘後，使用載玻片離心機將玻璃載玻片轉10~15 秒後，放入圓形 培養皿中備用。
2. 使用100mL 之 sample 瓶，將丁二酸酐(succinic anhydride 4.5mmol，0.45g) 溶於25mL 二甲基甲醯胺(DMF)中經過超音波震盪 1~2 分鐘後再加入二異 丙基乙基胺(DIPEA 3.5mmol，606μL)，經過超音波震盪 1 分鐘後，到入圓 形培養皿中。
3. 將含有乾淨玻璃載玻片及所配置溶液之培養皿放在迴轉式震盪器上迴轉 震盪。控制固定轉速25rpm，調控反應溫度在室溫 25。C 下反應 18 小時。
使玻璃載玻片表面由胺基(NH2) 修飾為羧酸(-COOH)
4. 迴轉震盪反應18 小時之後，在以乙醇(Ethanol) 沖洗後最後使用去離子蒸 餾水(DDI) 多次沖洗後使用載玻片離心機將玻璃載玻片轉乾，放入玻璃載 玻片盒中，保存備用。
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3-4-2 一次生長晶製備奈米金屬粒子之薄膜
將金離子(Au3+)還原沉積(deposition)在玻璃載玻片上行程晶種：
1. 將已修飾丁二酸酐(succinic anhydride) 羧酸化之玻璃載玻片放入反應槽 中(使用乾淨玻璃保鮮盒為反應槽中)。
2. 將32.25mL 的 10℃DDI 去離子水、0.75mL 的氨水溶液(NH4OH)以及 4.5mL 的 25mM 四氯合金酸(HAuCl4)在乾淨塑膠離心管中均勻混合後倒 入玻璃保鮮盒反應槽中。
3. 將玻璃保鮮盒放入迴轉式恆溫水槽中迴轉震盪，控制固定轉速40rpm，
調控反應溫度在低溫10。C 下反應 20 分鐘。
4. 反應20 分鐘之後，分別以兩杯去 DDI 離子水簡單潤洗後，將多餘而無法 與玻璃載玻片表面吸附之離子洗去，緊接著放入另一含有50mL DDI 去離 子水之玻璃保鮮盒反應槽中。
5. 將40mL DDI 去離子水(10℃)、10mL NaBH4(10mM)在乾淨塑膠離心管中 均勻混合後倒入步驟4 之玻璃保鮮盒反應槽中使金離子(Au3+)還原沉積。
6. 在迴轉式恆溫水槽中迴轉震盪，控制固定轉速40rpm，調控反應溫度在 低溫10。C 下反應一分鐘。
7. 反應一分鐘之後，分別以兩杯去DDI 離子水簡單潤洗後，將多餘而無法 與玻璃載玻片表面吸附之離子洗去，緊接著放入另一含有250mL DDI 去 離子水之玻璃燒杯中。
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3-4-3 二次生長晶製備奈米金屬之島狀薄膜
A:將金離子還原成長於含有金奈米粒子之玻璃載玻片[16]：1. 將已長完金的晶種之玻璃載玻片置於裝有50mL 去 DDI 離子水(30℃)之 玻璃保鮮盒反應槽中。
2. 將43mL DDI 去離子水(30℃)、2mL 的 25mM 四氯合金酸(HAuCl4)、5mL 的NH2OH 在乾淨塑膠離心管中均勻混合後倒入玻璃保鮮盒反應槽中。在 乾淨塑膠離心管中均勻混合後倒入反應槽中。
3. 在迴轉式恆溫水槽中迴轉震盪，控制固定轉速40rpm，調控反應溫度在高 溫30。C 下反應 10 分鐘。
4. 反應10 分鐘後，玻璃片由淡紫色逐漸轉為淡黃色，再轉為金色，以兩杯 去離子水潤洗，即完成金奈米島狀薄膜。
圖 23 製作奈米島狀薄膜金片示意圖
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B:將銀離子還原成長於含有金奈米粒子之玻璃載玻片[21]：
1. 將已長完金的晶種之玻璃載玻片置於裝有50mL 去 DDI 離子水(30℃)之 玻璃保鮮盒反應槽中。
2. 將37.75mL DDI 去離子水(30℃)、10mL 硝酸銀、0.25mL 氨水、1mL 氫氧 化鈉、1mL D-glucose 在乾淨塑膠離心管中均勻混合後倒入反應槽中。[22]
3. 在迴轉式恆溫水槽中迴轉震盪，控制固定轉速40rpm，調控反應溫度在高 溫30。C 下反應五分鐘。反應 5 分鐘後，玻璃片由淡紫色逐漸轉為橘色，
再轉為銀色，以兩杯去離子水潤洗，即完成銀奈米島狀薄膜。
C:製備奈米合金之島狀薄膜：
1. 首先，先利用A 方法，製備奈米金之島狀薄膜後。
2. 在以此玻璃片為基底再製備奈米銀之島狀薄膜後，方可製得製備奈米合金 之島狀薄膜。（玻璃片為銀金色）
圖 24 製作金銀合金奈米島狀薄膜金片流程 2 示意圖
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3-4-4 奈米島狀薄膜之修飾
1. 分別取2μL 的 2-Mercaptoethanol 溶於 100mL 乙醇、5μL 的 4-Mercapto-1-butanol 溶於 100mL 乙醇、7μL 的 6-Mercapto-1-hexanol 溶於 100mL 乙醇、
10mg 的 11-Mercapto-1-undecanol 溶 於 100mL 乙 醇 、 20mg 的 16-Mercaptohexadecanoic acid 溶於 100mL 乙醇。[23]
2. 將上述 sample 瓶，已配製好的溶液倒入於圓形培養皿中，將奈米薄膜玻 璃片放入培養皿中，固定轉速25rpm 在室溫 25。C 下反應 16 小時。
3. 迴轉震盪反應16 小時後，將奈米薄膜玻璃片取出並依序用乙醇、DDI 去 離子水多次潤洗乾淨後使用玻片離心機將奈米薄膜玻璃片轉乾。
4. 配置溶液，將DCC(0.25mmole，51.6mg)、NHS(0.25mmole，28.8mg)溶於 25mL DMF 中。將上述，已配製好的溶液倒入於培養皿中，並將已修飾硫 醇基的奈米薄膜玻璃片放入培養皿中，使羧酸(-COOH)活化，轉速 25rpm，
室溫下反應30 分鐘。
5. 將 8-arm-PEG-NH2(0.0052mmole ， 52mg) 溶 於 10mL DMF ， 再 加 入 DIPEA(1mmole，174.29μL)。經過超音波震盪 1 分鐘後
6. 將上述溶液倒入於步驟5 的培養皿中，使 8-arm-PEG-NH2與羧酸(-COOH) 反應，轉速25rpm，室溫下反應 2 小時。
7. 反應2 小時後，用乙醇、去離子水沖洗乾淨，用玻片離心機將玻璃片轉乾。
8. 配置溶液，將 Biotin(0.25mmole，61.1mg)、DCC(0.25mmole，51.6mg)、
NHS(0.25mmole，28.8mg)溶於 25mL DMF 中。
9. 將上述、已配製好的溶液倒入培養皿中，放入已修飾8-arm-PEG-NH2的奈 米薄膜玻璃片，使8-arm-PEG-NH2與Biotin 反應，固定轉速 25rpm，在室 溫下反應16 小時。
10. 反應 16 小時之後，用乙醇、去離子水沖洗乾淨，轉乾保存備用。
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如圖25，修飾 16-Mercaptohexadecanoic acid，Streptavidin-IR800 的分布 是在島與島之間和島表面(上)。修飾 11-mercapto-1-undecanol，Streptavidin-IR800 的分布是在島與島之間(中)。與對照組(下)藉由比較不同末端官能基來 比較其螢光值。
圖 25 修飾不同硫醇示意圖
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3-4-5 修飾螢光物質 streptavidin-IR800
1. 恆溫循環水槽設定 37。C，在反應槽中放入含有磷酸鹽緩衝生理鹽水溶液
（PBS）之圓形培養皿。恆溫半小時。
2. 將已修飾生物素（Biotin）的奈米薄膜玻璃片浸泡於圓形培養皿中一小時，
之後分別以兩杯去 DDI 離子水潤洗，並用載玻片離心機將玻璃載玻片轉 10~15 秒後，再置入於 16 孔盤中。
3. 以PBS 為溶劑，配置不同濃度 streptavidin-IR800 (0.2μg/mL、0.1μg/mL、
0.05μg/mL、0.025μg/mL、0.0125μg/mL、0.00625μg/mL、0.006125μg/mL、
0.001563μg/mL、0.000781μg/mL、0.000391μg/mL、0.000195μg/mL) 4. 分別將100μL 不同濃度的 streptavidin-IR800 滴入 16 孔盤中。在迴轉式
震盪器上迴轉震盪。控制固定轉速25rpm，調控反應溫度在室溫恆溫 37
℃下反應1 小時。
5. 接著將每格用100μL PBST 清洗三次，每次 5 分鐘。將已修飾 streptavidin-IR800 之奈米薄膜玻璃片取出。以兩杯去離子水潤洗兩次後使用載玻片離 心機將玻璃載玻片轉乾，放入玻璃載玻片盒中，保存備用。之後即可用微 陣列螢光掃描儀測螢光。
6. 開起微陣列螢光掃描儀測螢光暖機半小時後，即可將玻璃片放入設備中，
開始檢測。
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