製備金銀合金奈米島狀薄膜及螢光增強測試

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(1)國立臺灣師範大學化學系碩士論文 Department of chemistry National Taiwan Normal University Master thesis. 製備金銀合金奈米島狀薄膜及螢光增強測試. Development of gold and silver alloy nanoisland film for metal-enhanced fluorescence. 研究生：陳信仲 (Sin-Jhong Chen) 指導教授：陳家俊教授中華民國一百零八年一月.

(2) 謝誌光陰似箭、歲月如梭，轉眼之間學生的研究所生涯即將邁入結尾。在這些日子的研究所生活，同時也是我最後的學生生活，我不僅學習許多課業知識和實驗研究技巧、精神，更在這實驗室的大家庭當中受到極大的幫助。首先我要感謝指導教授，陳家俊老師，讓我進入實驗室中，提供了良好完善的實驗環境以及充沛的實驗相關資源，在實驗上也給予寶貴的建議，讓我順利的完成實驗。也非常感謝口試委員，郭聰榮老師、王迪彥老師、陳俊維老師撥空蒞臨這次的口試。研究所實驗期間，實驗室如同大家庭般，同學們彼此經歷的情誼是我在未來非常值得回憶的歷程。特別感謝顏宏吉學長，在研究上總是適時的指點，使學生受益良多。而這些寶貴的想法與見解成為了研究的養料，使得研究能更加的完整。感謝助理 Grace 平時生活上的協助，謝謝已畢業的學長姐們，浩康、孟儒、仲恩、冠蘭、詠瑜、旻龍、彥廷、資浩在實驗上的幫助。感謝實驗室同期的同學們柏均、千華、士堯、威志、弘毅、珈穎、鉦傑、子琳、俊堯、理軒在研究上彼此的激勵與共同成長。感謝學弟妹們，逸修、敏慧、洧正、御宸、福利、祐丞、啟盤、珮瑜、詠寧、祐霆、慧穎、智盈、思穎、立中讓實驗室總是充滿著溫暖及歡笑。最後，想要謝謝一直以來默默關心和支持著我的家人們，因為有他們，使我在學生時期的生活中無憂無慮的前進。在即將踏入社會的將來，一定會以此砥礪自己更加努力，並且將自己所學發揮出來，更進一步回饋社會。再次感謝所有人蒞臨。.

(3) 摘要金屬奈米材料的局部表面電漿共振（Localized Surface Plasmon Resonance， LSPR）現象對螢光物質有螢光增強效果。此效果稱之為金屬增強螢光（Metal-Enhanced fluorescence，MEF），一直以來金屬增強螢光效果被科學家們廣泛利用。在各種金屬奈米材料合成方法中，本論文實驗是使用簡單無電鍍法方式來製備金銀合金奈米島狀薄膜。在溶液相中透過二次生長晶種方法，將金屬奈米金粒子當作晶種附著在玻璃基材上。利用羥胺為還原劑將金離子還原並藉由晶種持續長大在玻璃基材表面上形成金奈米島狀薄膜。然後這之上再利用葡萄糖為還原劑將銀離子還原並在金奈米島狀薄膜表面形成金銀合金奈米島狀結構薄膜。為了得到螢光值最佳放大倍率，實驗一系列的優化條件。通過控制溶液不同長晶時間、不同離子濃度以及不同生長溫度，期望製作出最理想金銀合金奈米島狀薄膜。並且具有 LSPR 的金銀合金奈米島狀薄膜與表面螢光分子 streptavidin-IR800 互相作用，使得螢光訊號放大。透過修飾硫十一醇（11mercapto-1-undecanol，11-MUD）的金銀合金奈米島狀薄膜表面，使得螢光分子可以鍵結在島與島之間空隙中，得到螢光值最佳放大倍率。此實驗方法對環境無害、簡單且容易製備。可應用於檢測環境方面以及醫學生物相關應用，具備精準、快速且高靈敏度的優點。檢驗時只需少量的採樣樣品，即可有明顯強大的訊號。在醫學生物檢測方面可以幫助人們在日常生活中方便快速，偵測評估自己的生理狀況。. 關鍵字:表面電漿共振、金屬增強螢光、金銀合金奈米島狀薄膜.

(4) Abstract The localized surface plasmon resonance （LSPR） of metallic nanomaterials can give fluorescent enhancement to fluorescent materials. This effect is called metal-enhanced fluorescence （MEF）, and it has being widely applied by scientists. Among all synthesizing methods of metallic nano-materials, the study prepares an Au-Ag alloy island film with the electroless plating technique in experiments. Metallic gold nanoparticles are deposited on a glass substrate as seed crystals via secondary growth method in the solution phase. After that, gold ions are reduced with hydroxylamine as a reducing agent and keep growing with seed crystals to form a gold island film on the surface of the glass substrate. Following that, silver ions are also reduced with d-glucose as a reducing agent and form an Au-Ag alloy island film on the surface of the gold island film. A variety of optimal conditions has been experimented to obtain the highest magnification ratio of fluorescence, including controls on different timing of crystal generation, ion concentration and growth temperature in expectation to make the most ideal Au-Ag alloy island film. Besides, the Au-Ag alloy island film with LSPR effect can intensify the fluorescence signal by interacting with streptavidin-IR800, the surface fluorescent molecules. Finally, the Au-Ag alloy island film, which modifies 11-mercapto-1-undecanol （11-MUD）, can make fluorescent molecules form bonds in the intervals between islands and achieve the best magnification ratio. This eco-friendly, simple, and easy-to-prepare experimental method can be adopted in fields related to environmental measuring and biomedical sciences with its high accuracy, speed, and sensitivity. When measuring, it takes only few samples to receive clear, powerful signals; in terms of biomedical sciences, this method also helps people to assess their own physiological conditions in a fast, convenient way in daily life. Keywords: localized surface plasmon resonance, metal-enhance fluorescence, Au-Ag alloy island film.

(5) 目錄第一章奈米材料..................................................... 1 1-1 奈米材料的演進 ............................................................................................................. 1 1-2 奈米材料的性質 ............................................................................................................. 3 1-3 奈米材料的製備方法介紹 ............................................................................................. 7 1-4 奈米材料之應用 ........................................................................................................... 10. 第二章奈米金屬..................................................... 13 2-1 奈米金屬之表面電漿共振 ........................................................................................... 13 2-2 奈米金屬螢光增強 ....................................................................................................... 15 奈米金屬螢光增強理論 ................................................................................................. 15 奈米金屬螢光增強方法 ................................................................................................. 17 奈米金屬螢光增強應用 ................................................................................................. 17 2-3 奈米金屬島狀結構 ....................................................................................................... 18 2-4 生物素與素與生物素 ................................................................................................... 20 2-5 螢光分子 ....................................................................................................................... 21 2-6 研究目的與動機 ........................................................................................................... 22. 第三章實驗......................................................... 23 3-1 實驗藥品 ....................................................................................................................... 23 3-2 實驗器材及儀器介紹 ................................................................................................... 24 3-2-1 恆溫循環水槽(FIRSTEK B401H) ............................................................................. 24 3-2-2 迴轉式恆溫水槽(B601D) ...................................................................................... 24 3-2-3 玻片迷你微量離心機(LP-1414) ............................................................................ 25 3-2-4 紫外光-可見光光譜儀(UV-Visible spectrophotometer)...................................... 25 3-2-5 迴轉式震盪器(OS-701) ......................................................................................... 26 3-2-6 掃描式電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope，SEM) ................................. 26 3-2-7 16 孔盤(FAST frame slide holders) ........................................................................ 27 3-2-8 微陣列螢光掃描儀(Microarray Fluorescence Scanning Device) .......................... 27.

(6) 3-3 實驗步驟 ....................................................................................................................... 28 3-4-1 清洗玻璃載玻片及羧酸化.................................................................................... 28 3-4-2 一次生長晶製備奈米金屬粒子之薄膜 ................................................................ 29 3-4-3 二次生長晶製備奈米金屬之島狀薄膜 ................................................................ 30 3-4-4 奈米島狀薄膜之修飾............................................................................................ 32 3-4-5 修飾螢光物質 streptavidin-IR800 ......................................................................... 34. 第四章結果與討論................................................... 35 4-1 金奈米島狀薄膜 ........................................................................................................... 35 金奈米島狀薄膜分析 ..................................................................................................... 35 4-2 金奈米島狀薄膜之表面形貌與 LSPR 性質 ................................................................. 36 4-2-1 前驅物濃度對奈米島狀薄膜之影響.................................................................... 36 4-2-2 反應時間和溫度對奈米島狀薄膜之影響 ............................................................ 36 4-2-3 反應位置對奈米島狀薄膜之影響........................................................................ 38 4-2-4 修飾不同的硫醇對奈米島狀薄膜之影響 ............................................................ 38 4-3 金奈米島狀薄膜之螢光增強測試 ............................................................................... 39 4-3-1 螢光增強對照組條件............................................................................................ 39 4-3-2 前驅物濃度不同的螢光增強測試........................................................................ 41 4-3-3 金奈米島狀生長溫度、反應時間的螢光增強測試 ............................................ 43 4-3-4 表面修飾不同硫醇的螢光增強測試.................................................................... 45 4-4 金銀合金奈米島狀薄膜 ............................................................................................... 46 金銀合金奈米島狀薄膜分析 ......................................................................................... 46 4-5 合金奈米島狀薄膜之表面形貌與 LSPR 性質 ............................................................. 47 4-5-1 不同反應條件奈米島狀薄膜之比較.................................................................... 47 4-5-2 金銀奈米島狀薄膜修飾不同硫醇之影響 ............................................................ 47 4-6 合金奈米島狀薄膜之螢光增強測試 ........................................................................... 48. 第五章結論與未來展望............................................... 50 第六章參考資料..................................................... 51. VI.

(7) 圖目錄圖 1 現今奈米材料之相關領域示意圖...................................................... 2 圖 2 各種維度下的奈米物質[3] .................................................................. 3 圖 3 各種維度奈米材料的粒子分布情況[4] .............................................. 5 圖 4 奈米材料製作方法[7] .......................................................................... 7 圖 5 化學合成法相關方法示意圖.............................................................. 9 圖 6 金屬之表面電漿共振示意圖[11] ....................................................... 14 圖 7 原始狀態之金屬增強螢光示意圖.................................................... 16 圖 8 金的奈米粒子與螢光分子因近距離而造成螢光焠火.................... 16 圖 9 螢光分子會以非輻射的方式將能量轉移........................................ 17 圖 10 不同濃度奈米島狀薄膜消光光譜[16] ............................................. 18 圖 11 奈米島狀薄膜之 SEM 影像圖 ....................................................... 19 圖 12 比較有無金屬島狀薄膜之螢光值.................................................. 19 圖 13 利用生物素與鏈親合素將金奈米棒鍵結圖.................................. 20 圖 14 在奈米結構修飾螢光物質示意圖.................................................. 21 圖 15 單金屬與兩金屬之間電場強度的模擬.......................................... 21 圖 16 恆溫循環水槽.................................................................................. 24 圖 17 迴轉式恆溫水槽.............................................................................. 25 圖 18 玻離片迷你微量離心機.................................................................. 25 圖 19 紫外光-可見光/近紅外光光譜儀 ................................................... 26 圖 20 迴轉式震盪器.................................................................................. 26 圖 21 多功能檢驗用 16 孔盤.................................................................... 27 圖 22 微陣列螢光掃描儀.......................................................................... 27 圖 23 製作奈米島狀薄膜金片示意圖...................................................... 30 VII.

(8) 圖 24 製作金銀合金奈米島狀薄膜金片流程 2 示意圖.......................... 31 圖 25 修飾不同硫醇示意圖...................................................................... 33 圖 26 金奈米島狀薄膜照片及掃描式電子顯微鏡圖.............................. 35 圖 27 不同四氯化金濃度之 UV-Vis 圖 ................................................... 36 圖 28 反應時間、溫度對奈米島狀薄膜 SEM 圖 ................................... 37 圖 29 不同反應時間之 UV-Vis 圖譜 ....................................................... 37 圖 30 不同反應位置之薄膜 SEM 圖 ....................................................... 38 圖 31 修飾不同硫醇之 SEM 圖 ............................................................... 38 圖 32 不同 streptavidin-IR800 濃度對螢光值的影響 ............................. 39 圖 33 對照組的不同反應時間對螢光值的影響...................................... 40 圖 34 生物素與 streptavidin 不同反應溫度圖......................................... 40 圖 35 前驅物濃度不同的螢光增強.......................................................... 41 圖 36 不同濃度的四氯化金酸之螢光增強倍率...................................... 42 圖 37 不同反應溫度對螢光值的影響...................................................... 43 圖 38 不同反應時間之 streptavidin-IR800 螢光值 ................................. 44 圖 39 不同反應時間的螢光增強倍率...................................................... 44 圖 40 奈米島狀薄膜修飾不同硫醇的 streptavidin-IR800 螢光值 ......... 45 圖 41 修飾不同硫醇的螢光增強倍率...................................................... 45 圖 42 金銀合金奈米島狀薄膜照片和掃描式電子顯微鏡圖.................. 46 圖 43 不同條件薄膜之 UV-Vis 圖譜 ....................................................... 47 圖 44 不同條件薄膜之 SEM 圖左:Au500 右:Au500+Ag250 .............. 47 圖 45 比較不同薄膜之 streptavidin-IR800 螢光值 ................................. 48 圖 46 比較不同薄膜的螢光增強倍率...................................................... 49. VIII.

(9) 表目錄表格 1 實驗藥品........................................................................................ 23 表格 2 不同四氯化金酸濃度顆粒大小與間隙大小................................ 42 表格 3 比較不同薄膜的顆粒大小與間隙大小........................................ 49. IX.

(10) 第一章奈米材料 1-1 奈米材料的演進奈米──21 世紀最為熱門的名詞，而奈米材料在現代社會的日常生活中，隨處可見它的蹤跡，因為它的用途非常廣泛。所謂奈米材料 (Nanomaterials)，是指一個物體，至少一個尺寸在 1~100 奈米之間。而利用奈米材料做一系列相關實驗的技術則稱為奈米科技。而奈米技術早在一千多年就有相關的利用。例如前中古世紀歐洲教堂的彩繪玻璃、西元前 4~5 世紀的羅馬賴庫爾戈斯酒杯製作、歐洲文藝復興時期的義大利彩釉……等。 1925 年，奧地利化學家里夏德·阿道夫·席格蒙迪(Richard Adolf Zsigmondy)因證明了膠體溶液的異相性質，以及確立了現代膠體化學的基礎，被授予諾貝爾化學獎，同時也是奈米的概念首次被提出。1959 年，諾貝爾物理獎得主、奈米技術之父理查．費曼(Richard Feynman)在"There's Plenty of Room at the Bottom"的演講中提出奈米技術後，相關操作思維及其概念相繼而生。1962 年，日本東京大學的久保亮五教授提出了量子限制理論，解釋金屬奈米粒子的能階不連續，使得人們對奈米粒子的電子結構、性質和型態有了進一步的了解。而奈米科技一詞的定義則在 1974 年由日本東京理科大學谷口紀男教授正式提出。[1] 而隨著科技的一直進步，1982 年，瑞士商業公司(IBM)的科學家格爾德· 賓寧(Gerd Binnig)及海因里希·罗雷尔(Heinrich Rohrer)，共同開發出掃描式穿隧顯微鏡(Scanning Tunneling Microscope，STM)，主要是利用一根細鎢作為金屬探針，在檢測時探針極接近待測物，探針針尖電子會跳到待測物體表面上形成穿隧電流，同時物體表面的高低會影響穿隧電流的大小，利用此現象來觀測物體表面。因為此發明，在奈米材料上提供重要的檢測技術，奠定之後奈米技術的發展。 1.

(11) 1990 年，第一屆國際奈米科學技術會議在美國盛大舉辦，在會議中正式提出奈米材料學、奈米生物學、奈米電子學以及奈米機械學的結合概念。使得各國在之後大量投入奈米科技的研究，相關奈米科技分之產業開始蓬勃發展。2000 年在加州理工學院宣布了「國家奈米技術計畫（National Nanotechnology Initiative，NNI）」，之後更引發了一場全新的「產業革命」，開展奈米技術於民生、軍事與各產業領域的應用發展。因為奈米材料德技術導入民生及各產業領域，帶人類進入第四次的產業革命，使得人類生活更加便利。[2]. 奈米技術於軍事. 奈米技術於民生. 奈米材料. 奈米技術於科技. 奈米技術於醫療. 圖 1 現今奈米材料之相關領域示意圖. 2.

(12) 1-2 奈米材料的性質相對於奈米材料(Nanomaterials)，傳統科學術語中稱一般材料是「塊材」 (Bulks)。塊材相對於奈米尺度是非常巨大的，屬於巨觀世界的材料，傳統物理學、化學理論都主要以討論巨觀的塊材為主。如圖 2 奈米材料依照維度可區分為零維、一維和二維。零維奈米材料是指長、寬、高三維尺度都在奈米尺寸，其結構為點狀，例如量子點(Quantum dot)、奈米粒子(Nanoparticles)……等。一維奈米材料是指長、寬、高三維中的寬與高二維都是奈米尺度，其結構為線狀，例如奈米管(Nanotubes)、奈米線(Nanowires)……等。二維奈米材料則是指長、寬、高三維中只有高度是奈米尺度，其結構為面狀，例如奈米薄膜(Nanofilms)。[3]. 圖 2 各種維度下的奈米物質[3]. 特殊效應奈米材料特殊效應相對於一般傳統塊材，材料在縮小至奈米尺度後，表面積增大，曝露於表面及界面的原子數增多，粒子表面的活性增加。因此材料奈米化後，造成與傳統塊材不一樣的物理及化學性質。同時促進有效化學反應的發生，使得奈米材料的重要性日漸增加。以下分別介紹奈米材料的幾種不同的特殊效應及所產生不同的物理及化學性質。 3.

(13) 小尺寸效應(Small Scale Effect) 此效應是當微粒尺寸與光波波長或德布洛依波長〈de Broglie wave〉相當或更小時，粒子的晶體週期性邊界條件被破壞，奈米粒子表面的原子密度下降，導致材料奈米化後，造成與傳統塊材不一樣的物理及化學性質。例如光、聲、電、磁、熱……等性質。表面效應(Surface effect) 材料在奈米化後，表面原子數占全部原子數的比例提升，而整體比表面積亦增大、表面之位能也隨之提高。當粒徑在 10nm 以下，將迅速增加表面原子的比例。而當粒徑降到 1nm 時，表面原子數比例達到約 90%，原子幾乎全部集中到奈米粒子的表面。由於奈米粒子的比表面積大、表面位能高且表面原子配位數不足，相較內層原子活潑，使這些原子易與其他原子發生反應而穩定下來，故具有很高的化學活性。例如，金屬奈米粒子容易在空氣中燃燒，無機奈米鐵粉粒子在空氣中會加速氧化。量子侷限效應(Quantum Confinement Effect) 材料奈米化後所包含的原子數有限，各原子受到鄰近原子的影響減少，此時能階由連續變為階段，電性、磁性、光學特性有著重大改變，如導電金屬在奈米化後，卻變成絕緣體。[4] 量子尺寸效應（quantum scale effect）最高電子佔據分子軌域與最低電子未占據分子軌域的能階差(稱為能隙)，也會因奈米化而變寬。這種電子能階呈非連續化及能隙變寬的現象，稱為「量子尺寸效應」。. 4.

(14) 圖 3 各種維度奈米材料的粒子分布情況[4]. 量子穿隧效應（macroscopic quantum tunneling effect）古典力學中粒子無法克服位能壁障而有穿牆的效應。但在微觀環境中，電子具有穿過比本身高的位能障礙，因此稱為量子穿隧效應。例如：穿隧顯微鏡利用極細的金屬探針接近導體表面（但未接觸），施加電壓時，電子會由探針尖端穿越空氣間隙而產生穿隧電流。. 奈米性質奈米光學性質材料奈米化後，光吸收與微波吸收增加，並產生吸收峰共振平移之現象。例如，奈米金屬不反射可見光，故呈黑色。奈米材料顆粒尺寸小，表面張力大，使平均鍵長變短，導致鍵振動頻率升高，產生藍移之現象。利用此特性，可應用於光電元件與生物標記上。奈米聲音性質：因為量子尺寸效應，孔隙縮小，能量迅速傳遞不受干擾影響，信號與雜音比例會相對提高，使得人耳朵接收到的音調、音色、音量、隨之改變，接收聲音的速度也相對改變。 5.

(15) 奈米電學性質因為材料奈米化，表面電子的自旋結構及電子能譜產生變化，因此，奈米材料具有新的電學特性。例如，奈米金屬中的自由電子平均自由徑會隨著粒徑變小而減少，使得金屬導電性下降，因此由導體變成絕緣體。而在應用方面，在奈米材料量子穿隧效應之下，也被積極應用於掃瞄式穿隧電子顯微鏡。另外，奈米半導體的介電常數則因為有明顯量子尺寸效應，介電常數均下降。奈米磁學性質：相較於常規材料，奈米磁結構上有很大的差別，因此在磁性方面會有其獨特的性能。例如，因為小尺寸效應，隨著顆粒的變小，強磁性顆粒的磁區將會發生變化。由多區變成單區狀態，使反轉磁化的模式從區壁位移轉變為磁區轉動。[5] 奈米熱學性質材料奈米化後導致比表面積的改變，因而改變材料的化學位能導致一系列熱學性質的改變。例如奈米金屬粒子熔點大幅下降，在化學反應中的物理，化學平衡條件發生改變。奈米力學性質與傳統塊材相較，奈米材料有更多的擴散途徑，故有更好的延展性及良好塑性，可提升材料機械特性。另一方面材料的硬度、耐久度與尺寸大小密切相關。例如，材料尺寸越小，硬度、耐久度就越大，但晶粒一旦小至超過臨界值時，硬度反而會隨粒徑變小而降低。. 6.

(16) 1-3 奈米材料的製備方法介紹製作奈米材料的方法: 1.. 由小而大的方法(Bottom up)：自組裝法是藉由粒子在沒有受到外力作用下，粒子藉著本身的粒子間作. 用力，使其能夠排列成特定結構之技術。 2.. 由大而小的方法(Top down)：最常見的是直接在塊材上加工，分成蝕刻法及研磨法二種。蝕刻法就如. 同傳統相機製作相片流程，利用光罩與固定波長光，照出所要的圖像，然後利用酸蝕刻方式清洗出奈米圖像。研磨法則是將粉體材料直接加入研磨機中，以撞擊研磨方式研磨後，就可以獲得奈米粉體材料。[6]. 圖 4 奈米材料製作方法[7]. 合成奈米材料的方法: 化學合成法：利用反應物在特定環境時，借由輔助還原劑產生化學反應形成所要的奈米顆粒。如圖 5，當前主要的方式分為五種：氧化還原法、沉澱法、水熱合成法、溶膠凝膠法、氣相沉積法。 7.

(17) 1.. 氧化還原法(Reduction-oxidation Reaction): 利用氧化還原的原理，將各種溶液中的氧化態的金屬離子，藉由還原劑. (如：硼氫化鈉)或電化學系統還原成零價的金屬奈米粒子。另外也可以透過電極在電解液裡通電進行氧化還原反應，也可以在電極上得到奈米粒子。 2.. 沉澱法(Precipitation Method): 加入適當的沉澱劑及分散劑使離子濃度超過其溶解度積，讓溶液達到飽. 和後產生沉澱物，在數次過濾、乾燥、鍛燒方可製備出奈米顆粒材料。但其中的沉澱物包括氫氧化合物、碳酸鹽、硫酸鹽等。 3.. 水熱合成法(Hydrothermal Synthesis): 在封閉的壓力容器內，，加熱讓水溶液 (反應物)在高溫高壓下進行反. 應，之後再結晶而形成奈米顆粒結晶。使用此方法而製成的奈米顆粒結晶，分布均勻且顆粒小。特別處在於此方法，是無須過高溫鍛燒，避免因鍛燒過程而有雜質參入或是缺陷產生，且奈米顆粒結晶通常具有較高的燒結活性。 4.. 溶膠凝膠法(Sol-gel Method): 金屬有機、無機化合物在經過溶膠、凝膠化和熱處理形成氧化物的方. 法。利用高化學活性的化合物做為前驅物，在液相溶液中將前驅物混合同時進行縮合反應，在溶液中逐漸形成穩定溶膠體，之後慢慢聚合形成凝膠，之後在經過乾燥，燒結固化形成奈米材料。 5.. 氣相沉積法(Vapor Deposition): 加熱前驅物，使之轉變成氣態，然後在氣相的環境將所使用的基底，放. 置在於前驅物蒸氣當中，而當蒸氣接觸到基底時，奈米顆粒會沉積在基底上，持續累積後，形成固態的生成物，最後在基板上型成奈米薄膜。. 8.

(18) 氧化還原法. 氣相沉積法. 沉澱法化學合成法. 溶膠凝膠法. 水熱合成法. 圖 5 化學合成法相關方法示意圖. 物理合成法：利用材料微小化到原子等級，再讓材料靠本身原子間作用力，組成奈米顆粒。奈米顆粒技術主要分為兩種，其一是雷射濺鍍法，其二是氣相蒸鍍法。 1.. 雷射濺鍍法: 雷射濺鍍法是利用高能電子束撞擊塊材的表面，使表面原子獲得能量因而濺出表面，然後在基板表面上沉積形成與塊材成分相同的奈米薄膜。. 2.. 氣相蒸鍍法: 其原理是再真空環境下，將坩鍋加熱使得前驅物氣化。之後以冷凝的方式沉積在基板表面上因而形成奈米薄膜。其厚度決定在與基板的距離、物質蒸發時間和速率等。. 9.

(19) 1-4 奈米材料之應用醫學上的應用：奈米銀在醫學上的應用在殺菌作用上，光觸媒二氧化鈦，需要足夠的紫外光產生殺菌作用，所以在光源較不足的室內，殺菌能力無法有效發揮作用，且其產生的自由基可能會對細胞產生傷害。而奈米銀粒子不需仰賴其他物質的激發，本身就可產生殺菌作用。銀經奈米化後，奈米銀粒子表面裸露出的銀原子急遽增加，在溶液中能解離出許多銀離子，而這些奈米銀粒子便是抗菌的主要功臣。因奈米銀粒子在溶液中可持續釋放出銀離子，具有長期保有抗菌功效。所以藉由此功效，在紗布、被套中添加奈米銀粒子，可有效防止細菌的滋生傳染，達到降低病菌感染的機率。另外，把奈米銀粒子混入人工敷料中，使用保護傷口的病患身上，可有效地避免細菌感染的問題。奈米金在醫學上的應用在藥物釋放上的應用，因為奈米金粒子具有良好的生物相容性，所以金薄膜在體內溶解後，並不會在體內引起毒性或發炎反應。所以將矽晶片做為基材，把藥物填充在容器中，再鍍上奈米金薄膜。然後把晶片植入體內，之後經由微處理器控制晶片釋放微弱的電壓，使奈米金薄膜溶解，釋放藥物達到標靶治療的效果。在醫學檢測上的應用，因為奈米金粒子表面具有特殊效應，容易與硫氫基結合，所以奈米金粒子常用於生物醫學上的檢測、基因偵測及疾病診斷方面。奈米金粒子也容易與蛋白質結合。例如在驗孕棒上的應用，懷孕的女性會分泌特殊的荷爾蒙，將其尿液滴在含有奈米金試劑的驗孕棒上，變會產生反應而呈紅色，如此便可知懷孕與否。 10.

(20) 此外，利用奈米金結合特殊的抗體，可作為標的癌細胞的工具。早期發現癌症時，通常是手術方式切除腫瘤。手術後還會以化療方式毒殺降低癌症復發機率。不過放射線同時也傷害正常細胞，因而導致噁心、嘔吐、掉髮等副作用。但近年來，科學家在奈米金粒子外包覆一層專一辨認癌細胞表面蛋白的抗體，如此使奈米金粒子進入癌細胞。並以近紅外光照射組織內的奈米金粒子，使黃金粒子迅速發熱，進而破壞癌細胞。此方法相比傳統的方法更為靈敏且準確，未來在免疫學、基因學、臨床診斷等方面極具價值。[8] 民生上的應用：奈米塗料:在物質表面加上一層疏水性極強的奈米粒子，因其表面就具有奈米結構，而不容易沾污塵，且下雨可一併將髒污帶走，具有防汙自淨能力。奈米防曬劑:應用奈米粒子和液體間的表面張力原理，製作不怕髒污的奈米防曬劑，可有效提高隔離紫外線的效果。奈米衛浴用品:在馬桶表面塗上奈米疏水性材料後。讓奈米馬桶具有低表面能的低污染特性，再加上疏水效果，可以在沖水時一併將髒污帶走，達到保持衛浴用品乾淨之效果。奈米衣料: 不同的奈米粒子，可以製作出不同功能的奈米衣料。例如，加入可以抗菌除臭的奈米銀粒子，可產生除臭抗菌的效果；在衣料上面加入疏水性奈米粒子，使衣料表面形成奈米結構，可製造出不沾汙油、不沾塵、不沾水的奈米衣及奈米領帶。光學上的應用：為了防止燈泡產生的熱能輻射散失而浪費，科學家利用二氧化錫以及二氧化鈦奈米粒子製成干涉膜，放在燈泡的內壁，不僅透光率好，且對紅外線有很強的反射能力，相較傳統的鹵素燈可以節省約 10~15%的電能。此外一般常見的材料有奈米金銀銅薄膜。可將奈米金粒子製成的薄膜材料應用在燈泡工業上。 11.

(21) 催化上的應用: 奈米粒子在催化上作用分為三類。降低反應進行時的溫度、提高反應速率而使反應效率變大、良好的選擇性來決定反應路徑。二氧化鈦的化學性穩定、具親水性、氧化還原性強，加上價格低廉，是大家熟悉之光觸媒材料。奈米鈦粒子在可見光下對碳氫化合物有催化效果，利用此效應可以運用在陶瓷、玻璃或是磁磚上，在其表面上塗上一層奈米二氧化鈦就可以起自潔作用。在光的照射下，任何在表面上的物質，如油漬、細菌，在奈米二氧化鈦的催化下，使周圍的水分子轉換成氫氧自由基，再藉由此自由基分解這些有機物質來達到自淨的效果。奈米二氧化鈦光催化作用帶給人類很大的便利。例如大樓外層的玻璃保潔，廚房磁磚上的油汙、都可以應用此方法來解決。奈米亞鉻酸銅可作為炸藥的有效催化劑、奈米銀粒子可以做為乙烯氧化的催化劑。奈米金粒子可當作觸媒使用，能把一氧化碳氧轉化成二氧化碳。相比於工業上需要在高溫下進行反應且不能有水氣的白金觸媒。奈米金觸媒在室溫下就能進行反應，且不受水氣影響。因此可利用於防毒面具、口罩……等。其他應用：在人體體溫作用下，奈米無機粒子可產生遠紅外線放射，提升血液循環，促進新陳代謝。奈米碳管是截至目前為止發現最細的管子，具有良好的導電性與導熱性，韌性佳，穩定性高、抗斷裂的能力比一般鋼鐵高。可應用在運動用品、電子元件……等。奈米電池可以用極小體積容納較大能量且轉換效率高，相比傳統電池更持久，但本身重量卻只有傳統電池一半的重量。奈米金的熔點降低，奈米銅相比一般金屬銅要堅固好幾倍。. 12.

(22) 第二章奈米金屬 2-1 奈米金屬之表面電漿共振關於表面電漿的研究最早可追朔至 20 世紀初，而發展至今已有百年歷史。1902 年，一位學者在一次光學實驗研究中，首次發現表面電漿共振之現象並對其做了簡單的記錄，幾年之後科學家們才真正解釋此現象的全貌。而在之後，關於表面電漿共振的研究及發展應用相繼而生。金屬內有許多自由電子，當這些自由電子受外部電磁場影響之下，金屬表面的電荷密度產生集體震盪的現象，此時電子稱之為表面電漿(Surface Plasmon，SP)。而此時電子會因金屬表面的型態、金屬特性、介電物質、電磁場頻率的各種不同，而以疏密波的方式震盪並產生電場，這個現象稱之為表面電漿共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)。但此現象須要其金屬表面電漿震盪頻率和電磁波頻率互相吻合才可產生。金屬表面電漿震盪頻率和電磁波頻率超出範圍則無法產生表面電漿共振之現象。如果頻率過小的話會在金屬上反射，如果頻率過大的話則會穿透金屬。除了在金屬平面上會產生表面電漿子之外，微觀來看，若金屬材料的尺寸縮小至奈米等級尺寸，則此時的奈米金屬粒子也會產生所謂的「侷域性表面電漿(Localized Surface Plasmon，LSP)」。在電磁波照射其奈米金屬粒子表面的電漿子時，電漿子會被限制在那極微小的奈米金屬粒子結構中，而無法傳遞出去。這導致了正負電荷受到入射電場的影響累積在兩極的表面上。而當入射波的波長頻率和被限制在表面電漿子的震盪頻率互相吻和時，會使得奈米金屬粒子上的自由電子有集體震盪的現象發生，此現象則稱為侷域性表面電漿共振 (Localized Surface Plasmon Resonance，LSPR)。而當侷域性表面電漿共振發生時，其磁場強度及電場強度有增強之效果。[9]. 13.

(23) 奈米金屬粒子組成不同形狀結構的產物也會影響電磁場在奈米金屬粒子表面附近的分佈的情況。例如奈米金屬粒子沉積在基板上形成島狀結構，島與島之間的距離會影響電磁場的分佈，精密地控制島之間的距離可使電磁場強度集中在間距中。若在水溶液中，通常集中在極端區例如出現在頂點、彎曲處、邊角，稱之為熱點(hot spots)，此時電場強度通常較強。對於信號增強有顯著的效果，可應用於螢光或者表面增強拉曼散射之信號放大。[10]. 圖 6 金屬之表面電漿共振示意圖[11]. 14.

(24) 2-2 奈米金屬螢光增強奈米金屬螢光增強理論奈米金屬粒子因表面電漿共振效應而增強的電磁場不只可應用於增強拉曼訊號，也可用於增強螢光分子。金屬螢光增強(Metal-Enhanced Fluorescence theory，MEF)是由於電磁場增強效應所造成的。當螢光分子接近到金屬表面時，能夠激發螢光分子的電磁波頻率恰好可以引發 LSPR 的發生。金屬材料可以把吸收之能量轉移給螢光分子，以激發更多螢光分子，縮短回到基態的循環時間，造成螢光增強且螢光穩定但生命週期下降之效果。理想 MEF 需要一定量面積金屬覆蓋，且通常其表面是粗糙結構，而距離則大約在 10 奈米左右。如圖 7 原始金屬增強螢光之圖示。[12, 13] 而當螢光分子與金屬表面距離太遠則彼此難以相互作用，反之若距離太近，則造成螢光被金屬焠火(Quench)之現象。如圖 8，金奈米粒子與螢光分子近距離而造成螢光焠火(Quench)之現象。如圖 9，有別於以往激發態螢光分子與金屬表面共振相互作用之解釋，後續有學者認為激發態的螢光分子會以非輻射的方式將能量轉移或結合至表面，然後再與螢光分子一起放出螢光。. 15.

(25) 圖 7 原始狀態之金屬增強螢光示意圖. 圖 8 金的奈米粒子與螢光分子因近距離而造成螢光焠火. 16.

(26) 圖 9 螢光分子會以非輻射的方式將能量轉移. 奈米金屬螢光增強方法金屬奈米材料，會隨著不同結構、形狀表現出不同的 LSPR 現象，各自的電磁波頻率有各自對應的特徵吸收。一直以來金屬奈米材料被廣泛利用，並且對於不同材料進行性質與形狀的改良。如，金、銀、銅等金屬粒子被大量製造且改良成球型、啞鈴形、錐體、島狀結構……等。而在 MEF 方面，由於 LSPR 效果造成電磁場增強現象，特別發生在尖角處、邊緣地帶。[14, 15]. 奈米金屬螢光增強應用金屬奈米粒子可以在可見光區吸收，而因材料的不同結構影響表面電漿共振的關係，藉由改變材料內部的微觀結構特性來達到控制奈米金屬粒子之效果。可以選擇性的吸收特定波長段，進而應用在基於光學方面的用途上。而在生物傳感器方面金屬奈米粒子也在其中扮演重要的環節，其中包括臨床檢測、醫療發展、藥物測試……等。. 17.

(27) 2-3 奈米金屬島狀結構奈米金屬之島狀薄膜的製備，參考 2011 年學術期刊，溶液相晶種製備法。先在玻璃片上長一層晶種。加入四氯化金酸和氨水，使用硼氫化鈉將金離子還原至奈米金粒子。再加入還原劑羥胺。將金離子還原長在以製備好的的晶種上並且持續長大。最後形成奈米金屬薄膜。在金奈米島狀薄膜成長時，會隨著四氯化金酸濃度越高，其吸收會越高且紅位移，如圖 10，不同濃度奈米島狀之薄膜消光光譜。. 圖 10 不同濃度奈米島狀薄膜消光光譜[16]. 18.

(28) 圖 11 奈米島狀薄膜之 SEM 影像圖 (a)250μM(b)750μM(c)1000μM(d)3mM[16] 而金奈米島狀之大小，也會越大甚至整個覆蓋住整個玻璃片。因此可修飾帶有 IR800 的抗體，測量螢光值。由圖 12，可以發現有金屬之奈米薄膜之螢光值因而提高[16]。. 圖 12 比較有無金屬島狀薄膜之螢光值 19.

(29) 2-4 生物素與素與生物素在眾多化學修飾中蛋白質、胜肽鏈是最為常用的吸是方法。這是將蛋白質中的胺官能基與 NHS-ester 酯反應，而鏈親和素本身也是一種蛋白質，生物素與鏈親和素的相互作用是生物化學中應用最廣泛的一種。因為其強親和力可以在多種實驗條件下，有完整性且良好的反應性。許多生化實驗都會使用鏈親和素與生物素（Biotin-Avidin—System，BAS）來做，也有研究關於金奈米棒和上述反應將之連接在一起。首先，先酸洗金屬表面，將表面修飾為羧酸，再將表面生物素化，最後利用鏈親和素將金奈米棒連接在一起。由於生物素與鏈親和素的強作用力，這亦可用於島狀薄膜表面修飾。[17, 18]. 圖 13 利用生物素與鏈親合素將金奈米棒鍵結圖. 20.

(30) 2-5 螢光分子許多研究關於奈米結構與螢光物質的相互作用，使得螢光強度的增加。在奈米結構上修飾帶有螢光物質之分子，檢測其螢光強度。因為奈米結構的影響，使螢光強度增強[19]。. 圖 14 在奈米結構修飾螢光物質示意圖另外一篇研究中作者製備了一個螢光分子於兩個奈米粒子之間，且奈米粒子之間利用寡核甘酸相連接，相較於單個奈米粒子連接螢光分子，兩個的螢光較強。單個的螢光增強的倍率約為 7 倍，若是雙金屬的螢光增強倍率約為 13 倍。，由圖 15，單金屬與兩金屬之間電場強度的模擬，可以得知雙金屬的電場比單金屬強。[20]. 圖 15 單金屬與兩金屬之間電場強度的模擬. 21.

(31) 2-6 研究目的與動機奈米材料應用於檢測環境方面以及醫學衛生相關開發，具備快速、精準且高靈敏度之優點。一直以來，各種研究開發許多製備金屬基材的方法，例如: 電化學沉積、熱蒸鍍……等。但所需複雜的製備方法且耗時耗能高成本，因此本論文研究希望以無電電鍍法之方式且相對毒性較低之方法簡單製備出均勻的奈米薄膜基底的玻璃片。因為金屬的螢光增強效果，在近年來應用於檢測環境方面以及醫學生物相關被廣泛探討研。然而在偵測及病上，雖然在低濃度樣品下，奈米島狀結構有效提升對螢光增強的倍率，達到降低偵測極限及雜訊比。由於在金屬奈米材料中有表面電漿共振現象發生，能使螢光物質大幅度增加螢光效應。且利用奈米金粒子相對穩定之特性加上奈米銀粒子具有優異的金屬螢光增強效果，來製備金銀合金奈米島狀薄膜的玻璃片。並且在優化條件下，藉由控制生長時間、調控離子濃度以及改變反應溫度……等，期望製作出最理想金銀合金奈米島狀薄膜，達到螢光值最佳放大倍率。在表面修飾方面，透過修飾含有硫醇的官能基達到保護金銀合金奈米島狀薄膜表面之效果。也透過不同的硫醇的官能修飾方式，使得加入螢光分子 streptavidin-IR800 後所得到螢光值更佳放大。. 22.

(32) 第三章實驗 3-1 實驗藥品藥品名. 廠牌. 2-Mercaptoethanol (2-ME). Sigma-Aldrich. 4-Mercapto-1-butanol (4-MB). Sigma-Aldrich. 6-Mercapto-1-hexanol (6-MCH). Fluka. 11-Mercapto-1-undecanol (11-MUD). Sigma-Aldrich. 16-Mercaptohexadecanoic acid (16-MHA). Sigma-Aldrich. Acetone (DMK). Fisher. Methanol (MeOH). Fisher. Ammonium hydroxide solution (NH3) 28.0-30.0%. Sigma-Aldrich. Biotin (C10H16N2O3S). Sigma-Aldrich. D-Glucose anhydrous (C6H12O6). Fisher. Dimethylformamide (DMF). Fisher. Ethanol (EtOH). Fisher. Hydrochloric acid fuming 37%. Merck. Streptavidin (IRDye 800CW ). LI-COR. N,N’-Dicyclohexylcarbodiimide，99% (DCC). Alfa Aesar. N,N-Diisopropylethylamine，98+% (DIPEA). Acros. N-Hydroxysuccinimide (NHS). Sigma-Aldrich. PEG Amine 8 arm (tripentaerythritol)，MW10000. Jenkem Technology. Phosphate buffered saline (PBS). Fisher. Polysine slides. Thermo. Silver nitrate (AgNO3). Acros. Sodium borohydride (NaBH4). Acros. Sodium hydroxide-pearl. (NaOH). Fisher. Succinic anhydride (C4H4O3)，99%. Alfa Aesar. Tetrachloroauric(III) acid trihydrate (HAuCl4 · 3H2O). Acros. 表格 1 實驗藥品 23.

(33) 3-2 實驗器材及儀器介紹 3-2-1 恆溫循環水槽(FIRSTEK B401H) 勢動科技有限公司 (ACTTR Technology) B400 系列低溫循環水槽數位式顯示基本型，加熱功率可提供 1KW，降溫能力 600Kcal/hr。工作溫度範圍通常為 0~100℃。循環能力 7L/min;0.2Kg/cm2。內槽容積 6.7L。可搭配迴轉式恆溫水槽，可將迴轉式恆溫水槽降至室溫以下的溫度。為實驗室常用控制溫度儀器設備。. 圖 16 恆溫循環水槽. 3-2-2 迴轉式恆溫水槽(B601D) 益之堂科技公司(Firstek)微電腦全自動 PID 控制器，觸控薄膜數位式設定及顯示可提供 1.2KW 的加熱功率。工作溫度範圍 5℃~100℃。震盪速度 20~200rpm。提供反應固定溫度及震盪速度。. 24.

(34) 圖 17 迴轉式恆溫水槽. 3-2-3 玻片迷你微量離心機(LP-1414) 勤研科技有限公司製作，可快速離心轉乾兩片玻璃片。關蓋自動運轉，開蓋自動停止運轉。最高轉速/離心力：4800rpm/1750xg。較為方便、簡單快速，不需要氮氣吹乾。具有 ON / OFF 開關，操作方便。. 圖 18 玻離片迷你微量離心機. 3-2-4 紫外光-可見光光譜儀(UV-Visible spectrophotometer) UV/VIS 光譜，當分子中的電子間遭受到光線的照射時，會吸收特定的能量，一般而言，不同的光線能量會造成不同的電子躍遷，在紫外光/可見光的範圍，即形成 UV/VIS 光譜。由於每一特定的官能基，均會有特定波長的吸收，因此可藉由 UV 光譜做為分子官能基定量測量工作. 25.

(35) 圖 19 紫外光-可見光/近紅外光光譜儀. 3-2-5 迴轉式震盪器(OS-701) 雙鷹企業有限公司(DEAGLE)製作。一般廣泛應用於組織培養之震盪實驗。採用無噪音馬達，載重量大，運轉平穩無聲，並具緩慢啟動設計。提供固定的搖晃速率，轉速範圍 10-250 r.p.m.，以維持反應穩定。. 圖 20 迴轉式震盪器. 3-2-6 掃描式電子顯微鏡(Scanning Electron Microscope，SEM) 主要用於研究樣品表面形貌狀態，使用高能電子束經過透鏡聚焦於樣品上，此時樣品表面受到電子束撞擊後，產生二次電子，使用接收器收集檢測到的二次電子的數量，以產生樣品之形貌狀態。當內層電子被擊出後，外層電子掉入原內層電子軌道而放出 X 光，由此可以分析樣品元素成分。. 26.

(36) 3-2-7 16 孔盤(FAST frame slide holders) 可剛好和 79mm x 25.4mm 之玻璃片配對穩和，且每片有 16 個小分隔且彼此獨立互不干擾，每格大小為 7mm x 7mm x4 mm(L x W x D)。每格體積量約為 100μL。因此可以滴入不同濃度之螢光物質，以達到一片多用途的功能。. 圖 21 多功能檢驗用 16 孔盤. 3-2-8 微陣列螢光掃描儀(Microarray Fluorescence Scanning Device) 是一種雙通道近紅外共聚焦顯微鏡掃描儀，用在標準玻璃或載玻片上成像組織，細胞和微陣列。主要掃描固態螢光物質，包含波長為 647nm 及 785nm 兩雷射。用於高靈敏度檢測的定制分析開發，可在玻片點上超低樣品量（<5 ul）不同濃度之螢光物質，達到螢光成像檢測目的。. 圖 22 微陣列螢光掃描儀. 27.

(37) 3-3 實驗步驟 3-4-1 清洗玻璃載玻片及羧酸化將玻璃載玻片表面由胺基(NH2) 修飾為羧酸(-COOH)： 1.. 先清洗數片玻璃載玻片(polysine slides)，依序使用丙酮(Acetone)、甲醇 Methanol (MeOH)及去離子蒸餾水(Distilled De-Ionized water)經過超音波震盪五分鐘後，使用載玻片離心機將玻璃載玻片轉 10~15 秒後，放入圓形培養皿中備用。. 2.. 使用 100mL 之 sample 瓶，將丁二酸酐(succinic anhydride 4.5mmol，0.45g) 溶於 25mL 二甲基甲醯胺(DMF)中經過超音波震盪 1~2 分鐘後再加入二異丙基乙基胺(DIPEA 3.5mmol，606μL)，經過超音波震盪 1 分鐘後，到入圓形培養皿中。. 3.. 將含有乾淨玻璃載玻片及所配置溶液之培養皿放在迴轉式震盪器上迴轉震盪。控制固定轉速 25rpm，調控反應溫度在室溫 25。C 下反應 18 小時。使玻璃載玻片表面由胺基(NH2) 修飾為羧酸(-COOH). 4.. 迴轉震盪反應 18 小時之後，在以乙醇(Ethanol) 沖洗後最後使用去離子蒸餾水(DDI) 多次沖洗後使用載玻片離心機將玻璃載玻片轉乾，放入玻璃載玻片盒中，保存備用。. 28.

(38) 3-4-2 一次生長晶製備奈米金屬粒子之薄膜將金離子(Au3+)還原沉積(deposition)在玻璃載玻片上行程晶種： 1.. 將已修飾丁二酸酐(succinic anhydride) 羧酸化之玻璃載玻片放入反應槽中(使用乾淨玻璃保鮮盒為反應槽中)。. 2.. 將 32.25mL 的 10℃DDI 去離子水、0.75mL 的氨水溶液(NH4OH)以及 4.5mL 的 25mM 四氯合金酸(HAuCl4)在乾淨塑膠離心管中均勻混合後倒入玻璃保鮮盒反應槽中。. 3.. 將玻璃保鮮盒放入迴轉式恆溫水槽中迴轉震盪，控制固定轉速 40rpm，調控反應溫度在低溫 10。C 下反應 20 分鐘。. 4.. 反應 20 分鐘之後，分別以兩杯去 DDI 離子水簡單潤洗後，將多餘而無法與玻璃載玻片表面吸附之離子洗去，緊接著放入另一含有 50mL DDI 去離子水之玻璃保鮮盒反應槽中。. 5.. 將 40mL DDI 去離子水(10℃)、10mL NaBH4(10mM)在乾淨塑膠離心管中均勻混合後倒入步驟 4 之玻璃保鮮盒反應槽中使金離子(Au3+)還原沉積。. 6.. 在迴轉式恆溫水槽中迴轉震盪，控制固定轉速 40rpm，調控反應溫度在低溫 10。C 下反應一分鐘。. 7.. 反應一分鐘之後，分別以兩杯去 DDI 離子水簡單潤洗後，將多餘而無法與玻璃載玻片表面吸附之離子洗去，緊接著放入另一含有 250mL DDI 去離子水之玻璃燒杯中。. 29.

(39) 3-4-3 二次生長晶製備奈米金屬之島狀薄膜 A:將金離子還原成長於含有金奈米粒子之玻璃載玻片[16]： 1.. 將已長完金的晶種之玻璃載玻片置於裝有 50mL 去 DDI 離子水(30℃)之玻璃保鮮盒反應槽中。. 2.. 將 43mL DDI 去離子水(30℃)、2mL 的 25mM 四氯合金酸(HAuCl4)、5mL 的 NH2OH 在乾淨塑膠離心管中均勻混合後倒入玻璃保鮮盒反應槽中。在乾淨塑膠離心管中均勻混合後倒入反應槽中。. 3.. 在迴轉式恆溫水槽中迴轉震盪，控制固定轉速 40rpm，調控反應溫度在高溫 30。C 下反應 10 分鐘。. 4.. 反應 10 分鐘後，玻璃片由淡紫色逐漸轉為淡黃色，再轉為金色，以兩杯去離子水潤洗，即完成金奈米島狀薄膜。. 圖 23 製作奈米島狀薄膜金片示意圖. 30.

(40) B:將銀離子還原成長於含有金奈米粒子之玻璃載玻片[21]： 1.. 將已長完金的晶種之玻璃載玻片置於裝有 50mL 去 DDI 離子水(30℃)之玻璃保鮮盒反應槽中。. 2.. 將 37.75mL DDI 去離子水(30℃)、10mL 硝酸銀、0.25mL 氨水、1mL 氫氧化鈉、1mL D-glucose 在乾淨塑膠離心管中均勻混合後倒入反應槽中。[22]. 3.. 在迴轉式恆溫水槽中迴轉震盪，控制固定轉速 40rpm，調控反應溫度在高溫 30。C 下反應五分鐘。反應 5 分鐘後，玻璃片由淡紫色逐漸轉為橘色，再轉為銀色，以兩杯去離子水潤洗，即完成銀奈米島狀薄膜。. C:製備奈米合金之島狀薄膜： 1.. 首先，先利用 A 方法，製備奈米金之島狀薄膜後。. 2.. 在以此玻璃片為基底再製備奈米銀之島狀薄膜後，方可製得製備奈米合金之島狀薄膜。（玻璃片為銀金色）. 圖 24 製作金銀合金奈米島狀薄膜金片流程 2 示意圖. 31.

(41) 3-4-4 奈米島狀薄膜之修飾 1.. 分別取 2μL 的 2-Mercaptoethanol 溶於 100mL 乙醇、5μL 的 4-Mercapto-1butanol 溶於 100mL 乙醇、7μL 的 6-Mercapto-1-hexanol 溶於 100mL 乙醇、 10mg 的 11-Mercapto-1-undecanol 溶於 100mL 乙醇、 20mg 的 16Mercaptohexadecanoic acid 溶於 100mL 乙醇。[23]. 2.. 將上述 sample 瓶，已配製好的溶液倒入於圓形培養皿中，將奈米薄膜玻璃片放入培養皿中，固定轉速 25rpm 在室溫 25。C 下反應 16 小時。. 3.. 迴轉震盪反應 16 小時後，將奈米薄膜玻璃片取出並依序用乙醇、DDI 去離子水多次潤洗乾淨後使用玻片離心機將奈米薄膜玻璃片轉乾。. 4.. 配置溶液，將 DCC(0.25mmole，51.6mg)、NHS(0.25mmole，28.8mg)溶於 25mL DMF 中。將上述，已配製好的溶液倒入於培養皿中，並將已修飾硫醇基的奈米薄膜玻璃片放入培養皿中，使羧酸(-COOH)活化，轉速 25rpm，室溫下反應 30 分鐘。. 5.. 將 8-arm-PEG-NH2(0.0052mmole ， 52mg) 溶於 10mL DMF ，再加入 DIPEA(1mmole，174.29μL)。經過超音波震盪 1 分鐘後. 6.. 將上述溶液倒入於步驟 5 的培養皿中，使 8-arm-PEG-NH2 與羧酸(-COOH) 反應，轉速 25rpm，室溫下反應 2 小時。. 7.. 反應 2 小時後，用乙醇、去離子水沖洗乾淨，用玻片離心機將玻璃片轉乾。. 8.. 配置溶液，將 Biotin(0.25mmole，61.1mg)、DCC(0.25mmole，51.6mg)、 NHS(0.25mmole，28.8mg)溶於 25mL DMF 中。. 9.. 將上述、已配製好的溶液倒入培養皿中，放入已修飾 8-arm-PEG-NH2 的奈米薄膜玻璃片，使 8-arm-PEG-NH2 與 Biotin 反應，固定轉速 25rpm，在室溫下反應 16 小時。. 10. 反應 16 小時之後，用乙醇、去離子水沖洗乾淨，轉乾保存備用。. 32.

(42) 如圖 25，修飾 16-Mercaptohexadecanoic acid，Streptavidin-IR800 的分布是在島與島之間和島表面(上)。修飾 11-mercapto-1-undecanol，StreptavidinIR800 的分布是在島與島之間(中)。與對照組(下)藉由比較不同末端官能基來比較其螢光值。. 圖 25 修飾不同硫醇示意圖. 33.

(43) 3-4-5 修飾螢光物質 streptavidin-IR800 1.. 恆溫循環水槽設定 37。C，在反應槽中放入含有磷酸鹽緩衝生理鹽水溶液（PBS）之圓形培養皿。恆溫半小時。. 2.. 將已修飾生物素（Biotin）的奈米薄膜玻璃片浸泡於圓形培養皿中一小時，之後分別以兩杯去 DDI 離子水潤洗，並用載玻片離心機將玻璃載玻片轉 10~15 秒後，再置入於 16 孔盤中。. 3.. 以 PBS 為溶劑，配置不同濃度 streptavidin-IR800 (0.2μg/mL、0.1μg/mL、 0.05μg/mL、0.025μg/mL、0.0125μg/mL、0.00625μg/mL、0.006125μg/mL、 0.001563μg/mL、0.000781μg/mL、0.000391μg/mL、0.000195μg/mL). 4.. 分別將 100μL 不同濃度的 streptavidin-IR800 滴入 16 孔盤中。在迴轉式震盪器上迴轉震盪。控制固定轉速 25rpm，調控反應溫度在室溫恆溫 37 ℃下反應 1 小時。. 5.. 接著將每格用 100μL PBST 清洗三次，每次 5 分鐘。將已修飾 streptavidinIR800 之奈米薄膜玻璃片取出。以兩杯去離子水潤洗兩次後使用載玻片離心機將玻璃載玻片轉乾，放入玻璃載玻片盒中，保存備用。之後即可用微陣列螢光掃描儀測螢光。. 6.. 開起微陣列螢光掃描儀測螢光暖機半小時後，即可將玻璃片放入設備中，開始檢測。. 34.

(44) 第四章結果與討論 4-1 金奈米島狀薄膜金奈米島狀薄膜分析使用二次生長晶種方法製備金奈米島狀結構薄膜，首先將金離子還原並在玻璃基材表面上。一開始先加入 3mM 的四氯化金酸溶液，接著利用硼氫化鈉將金離子還原成零價的金奈米粒子狀態，此時玻璃基材表面有一層淡淡的紫色，表示成功金離子成功還原成零價的金奈米粒子狀態並且形成晶種附在玻璃基材表面上。第二次長晶，於液相中生長金奈米粒子，利用羥胺為還原劑將四氯化金酸溶液中的將金離子再次還原並藉由晶種持續長大在玻璃基材表面形成奈米島狀結構薄膜，如圖 26。. 圖 26 金奈米島狀薄膜照片及掃描式電子顯微鏡圖四氯化金酸加入氨水，pH 值為鹼性大約在 10.5 左右，是金奈米粒子的成長在整個製備過程為一個重要的步驟。此時氯離子與胺官能基置換，形成 Au(NH3)2(H2O)2-X(OH)X(3-X)+的錯合物。在鹼性環境下，陽離子會沉積在帶負電的基板上。之後使用硼氫化鈉將金離子還原至零價金原子。. 35.

(45) 4-2 金奈米島狀薄膜之表面形貌與 LSPR 性質 4-2-1 前驅物濃度對奈米島狀薄膜之影響在固定反應時間下，調控前驅物四氯化金酸溶液的濃度，分別為 250μM、 500μM、750μM。於 UV-Vis 光譜中，發現隨著四氯化金酸溶液的濃度上升，吸收值也上升。. 1.0. 0.9. Au250-5mins Au500-5mins Au750-5mins. 0.8. abs. (A.U.). 0.7. 0.6. 0.5. 0.4. 0.3. 0.2. 0.1 400. 600. 800. 1000. 1200. wavelength (nm). 圖 27 不同四氯化金濃度之 UV-Vis 圖. 4-2-2 反應時間和溫度對奈米島狀薄膜之影響以不同反應時間生長金奈米島狀薄膜。於 UV-Vis 光譜中，隨著反應時間的增加，吸收值也上升。島狀結構會變大且島與島會連在一起，使得島與島間空隙漸漸縮小。在 SEM 影像中，可以觀察到奈米島狀的形成和其反應時間及反應溫度所相對應的大小。. 36.

(46) 圖 28 反應時間、溫度對奈米島狀薄膜 SEM 圖在固定反應溫度下，設定不同生長時間，分別為 5 分鐘、10 分鐘、15 分鐘。於 UV-Vis 光譜中，發現隨著生長時間的增加，吸收值也上升。其吸收也有紅位移現象。 Au500-5min-30C 1.4. Au500-10min-30C Au500-15min-30C. abs. (A.U.). 1.2. 1.0. 0.8. 0.6. 0.4 400. 600. 800. 1000. 1200. wavelength (nm). 圖 29 不同反應時間之 UV-Vis 圖譜. 37.

(47) 4-2-3 反應位置對奈米島狀薄膜之影響如圖 30，切取玻璃片上不同反應位置生長金奈米島狀薄膜。在 SEM 影像中，可以觀察到奈米島狀結構與玻璃片位置無關。且同時可以觀察到奈米金粒子均勻在玻璃片上反應。. 圖 30 不同反應位置之薄膜 SEM 圖. 4-2-4 修飾不同的硫醇對奈米島狀薄膜之影響如圖 31，取浸泡不同硫醇之玻璃片，在 SEM 影像中觀看金奈米島狀薄膜。可以觀察到浸泡不同硫醇之玻璃片，不會破壞金奈米島狀薄膜結構。且同時可以觀察到奈米金粒子均勻在玻璃片上反應。. 圖 31 修飾不同硫醇之 SEM 圖. 38.

(48) 4-3 金奈米島狀薄膜之螢光增強測試 4-3-1 螢光增強對照組條件為找尋偵測範圍，測試螢光分子 streptavidin-IR800 濃度。由圖 32 得知當加入螢光分子(streptavidin-IR800)的濃度高於 6.4μg/mL，螢光強度不再提升，表示達到 biotin 量。此後，後續實驗之 streptavidin-IR800 濃度定為 0.1μg/mL，其螢光分子可以完全與 biotin 鍵結。 control 4. Fluorescence Intensity. 10. 3. 10. 2. 10. 1. 10. -1. 10. 0. 10. 1. 10. Concentration (g/mL). 圖 32 不同 streptavidin-IR800 濃度對螢光值的影響. 測試不同 streptavidin-IR800 與 biotin 的反應時間，分別為 2 小時、1 小時以及 30 分鐘。由圖 33，實驗結果發現 30 分鐘還沒完全反應完，因此實驗時間提高至 1 小時，而反應 2 小時的螢光值並沒有明顯升高，即表示 1 小時即反應完。後續反應之實驗時間定為 1 小時。. 39.

(49) 2hr 1hr 0.5hr. 4. Fluorescence Intensity. 10. 3. 10. 2. 10. -2. -1. 10. 10. Concentration (g/mL). 圖 33 對照組的不同反應時間對螢光值的影響. 由於 biotin 和 streptavidin 有很強的作用力，但不同溫度的 streptavidinIR800 與 biotin 的反應速率不同。如圖 34，在較高溫 37℃下其所測得之螢光值較高。因此，此後實驗以 37℃為生物素的反應條件。 Au-37C Au-25C Au-10C control. 4. Fluorescence Intensity. 10. 3. 10. 2. 10. 1. 10. 0. 10. -2. 10. -1. 10. Concentration (g/mL). 圖 34 生物素與 streptavidin 不同反應溫度圖. 40.

(50) 4-3-2 前驅物濃度不同的螢光增強測試金奈米島狀薄膜，四氯化金酸溶液濃度的不同，島狀大小和間隙也不同。因此島狀和間隙的比例不同，也因此會影響到螢光強度。其濃度分別為 250μM、 500μM 以及 750μM。實驗結果發現 500μM 以及 750μM 較亮，因此實驗時間定為 500μM，而相較之下 750μM 的螢光值並沒有明顯升高。. control Au250-11SH Au500-11SH Au750-11SH. Fluorescence Intensity. 10000. 1000. 100. 10 0.01. 0.1. Concentration (g/mL). 圖 35 前驅物濃度不同的螢光增強. 如圖 36，在固定時間下，透過不同濃度的四氯化金酸生長，分別為 250μM、 500μM、750μM。於螢光強度分析中，500μM 的奈米玻璃片其螢光倍率為 247 倍為最高，但 750μM、前驅物濃度雖然增加但螢光倍率卻略微下降。因此此後實驗測試以 500μM 為基準。. 41.

(51) Fluorescence enhancement. 300 247. 238. 200. 101 100. 0 250μM. 500μM. 750μM. Concentration 圖 36 不同濃度的四氯化金酸之螢光增強倍率. 如表格 2，前驅物四氯化金酸溶液濃度越高，顆粒越大，間隙則是越小。顆粒大小與間隙大小的比例值大約在 3 的時候，螢光增強倍率最高。島狀大小與間隙比和螢光增強倍率。. Conc.Au. Grain Size. Gap. Grain Size/Gap. Fluorescence. (μM). (nm). (nm). 250. 80±31. 39±11. 2.5. 101. 500. 95±28. 27±16. 3.1. 247. 750. 110±37. 21±14. 3.9. 238. enhancement. 表格 2 不同四氯化金酸濃度顆粒大小與間隙大小. 42.

(52) 4-3-3 金奈米島狀生長溫度、反應時間的螢光增強測試測試金奈米島狀薄膜生長溫度，分別為 10℃、20℃、30℃。接著測試反應生長溫度對螢光值的影響。比較反應生長溫度的螢光值，可以得知反應溫度於 30℃時，螢光值較高，因此此後實驗以 30℃為生長溫度。. Fluorescence Intensity. 10000. control Au500-10C Au500-20C Au500-30C. 1000. 100. 10 0.01. 0.1. Concentration (g/mL). 圖 37 不同反應溫度對螢光值的影響. 將金奈米薄膜表面修飾硫醇然後依序接上 8arm-PEG-NH2、生物素，使得可以接上更多的螢光物質 streptavidin-IR800。因為 biotin 和 streptavidin 有很強的作用力，因此在多功能檢驗用 16 孔盤點上不同濃度的 streptavidin-IR800，並檢測金奈米薄膜螢光增強，取決於金奈米薄膜的生長條件。. 43.

(53) 生長時間會影響到到狀結構大小與間隙的大小，然而顆粒大小與間隙大小會影響到螢光值。五分鐘的螢光值相對較低，十五分鐘的螢光值次之，最高螢光值的是反應十分鐘之金奈米薄膜。因此此後實驗以 10 分鐘為準。 control Au500-5min Au500-10min Au500-15min. Fluorescence Intensity. 10000. 1000. 100. 10 0.01. 0.1. Concentration (g/mL). 圖 38 不同反應時間之 streptavidin-IR800 螢光值如圖 39，在固定反應濃度下，控制不同生長時間，分別為 5、10、15 分鐘。於螢光強度分析中，10 分鐘的奈米玻璃片其螢光倍率為 252 倍為最高，但 15 分鐘、時間雖然增加但螢光倍率卻略微下降。因此此後實驗測試以 10 分鐘為基準。. Fluorescence enhancement. 300. 200. 252. 242. 10min. 15min. 156. 100. 0 5min. Growth time 圖 39 不同反應時間的螢光增強倍率. 44.

(54) 4-3-4 表面修飾不同硫醇的螢光增強測試修飾 16-Mercaptohexadecanoic acid，螢光分子的分布是在島與島之間和島表面。修飾 11-mercapto-1-undecanol，螢光分子的分布是在島與島之間。比較不同末端官能基螢光值。從圖 40 中，可以得知以 11-mercapto-1-undecanol 作修飾之螢光值達到最高。. Fluorescence Intensity. 10000. control Au500-16SCOOH Au500-6SH Au500-11SH. 1000. 100. 10 0.01. 0.1. Concentration (g/mL). 圖 40 奈米島狀薄膜修飾不同硫醇的 streptavidin-IR800 螢光值. 從 41 圖中，可以得知相對其他兩種硫醇修飾方式而言，以 11-mercapto1-undecanol 作修飾之螢光值達到最高，256 倍。因此，此後實驗測試以 11-. Fluorescence enhancement. mercapto-1-undecanol 作修飾基準。 300 233. 227. 256. 200. 100. Thiol 圖 41 修飾不同硫醇的螢光增強倍率 45.

(55) 4-4 金銀合金奈米島狀薄膜金銀合金奈米島狀薄膜分析. 圖 42 金銀合金奈米島狀薄膜照片和掃描式電子顯微鏡圖. 在金薄膜之上製備一層銀結構薄膜形成金銀合金奈米島狀薄膜。在液相溶液中生長銀奈米粒子，利用葡萄糖為還原劑將硝酸銀中著銀離子還原並藉由晶種持續長大在玻璃基材表面形成金銀合金奈米島狀結構薄膜。因此本論文期望透過以上還原性質，通過金銀溶液各自的不同生長時間、不同反應濃度以及不同環境溫度……等。希望製作出最理想金銀合金奈米島狀薄膜，藉此來達到螢光增強最大化。. 46.

(56) 4-5 合金奈米島狀薄膜之表面形貌與 LSPR 性質 4-5-1 不同反應條件奈米島狀薄膜之比較以不同反應條件之奈米島狀薄膜玻璃片來比較。於 UV-Vis 光譜中，發現在加入些微銀奈米粒子後相較於原本純金的奈米島狀薄膜，合金的奈米島狀薄膜吸收值略微上升，且有紅位移現象產生。 1.1. Au500-Ag250 Au500. 1.0. abs. (A.U.). 0.9. 0.8. 0.7. 0.6. 0.5 400. 600. 800. 1000. 1200. wavelength (nm). 圖 43 不同條件薄膜之 UV-Vis 圖譜. 4-5-2 金銀奈米島狀薄膜修飾不同硫醇之影響取浸泡不同硫醇之奈米島狀薄膜玻璃片，在 SEM 影像中觀察薄膜。可以觀察到浸泡不同硫醇之玻璃片，不會破壞薄膜表面結構。同時可以觀察到奈米粒子均勻在玻璃片上反應。. 圖 44 不同條件薄膜之 SEM 圖左:Au500 右:Au500+Ag250 47.

(57) 4-6 合金奈米島狀薄膜之螢光增強測試將金銀合金的奈米薄膜表面修飾硫醇並依序接上 8arm-PEG-NH2、biotin 後，因為 biotin 和 streptavidin 有很強的作用力，使得螢光物質 streptavidin-IR800 可以接上。檢測不同濃度的螢光值，在穩定性高的金奈米薄膜上多生長一點銀奈米粒子增加表面電漿共振以及金屬增強螢光。如圖 45，比較不同奈米薄膜玻璃片，於螢光強度分析中，合金奈米玻璃片其螢光值明現相較純金的奈米玻璃片優異。. Fluorescence Intensity. 10000. control Au500 Au500 + Ag250. 1000. 100. 10 0.01. 0.1. Concentration (g/mL) 圖 45 比較不同薄膜之 streptavidin-IR800 螢光值. 48.

(58) 如圖 46，在固定條件下，比較不同奈米薄膜玻璃片。於螢光強度分析中，合金的奈米玻璃片其螢光倍率為 610 倍為最高，但純金的奈米玻璃片其螢光倍. Fluorescence enhancement. 率只為 261 倍。因此實驗測得合金的奈米玻璃片其螢光倍率較為優異。. 700 610 600 500 400 261. 300 200 100. Au500. Au500 + Ag250. nano-island film 圖 46 比較不同薄膜的螢光增強倍率如表格 3，比較不同薄膜的顆粒大小與間隙大小，顆粒越大，間隙則是越小。雖然同樣顆粒大小與間隙大小的比例值大約在 3 坐右，但合金的奈米玻璃片螢光增強倍率卻相對較純金的奈米玻璃片提升許多。. nano-film. Grain Size. Gap. Grain. Fluorescence. (min). (nm). (nm). Size/Gap. enhancement. Au500. 94±27. 29±18. 3.2. 261. Au500+Ag250. 102±31. 23±12. 3.3. 610. 表格 3 比較不同薄膜的顆粒大小與間隙大小. 49.

(59) 第五章結論與未來展望本論文研究，成功的以簡單無電電鍍法之方式製備出均勻的金銀合金奈米島狀薄膜結構玻璃片。藉由多次生長晶種方法，使用硼氫化鈉為還原劑，將金離子沉積到玻璃基材表面上當作晶種。再這基礎之上依次使用羥胺為還原劑將金離子再次還原並藉由晶種持續長大在玻璃基材表面形成奈米島狀結構薄膜。之後使用葡萄糖作為還原劑將銀離子還原沉積到島狀金薄膜上。此方法對環境無害、簡單容易製備，未來有機會可以大量製造。藉由調控金、銀離子濃度、生長時間、反應溫度金銀比例等條件下，且在經過表面修飾硫十一醇(11-MUD)、PEG、biotin。使 Streptavidin-IR800 易結合修飾在島與島之間得間隙，從而達成改變材料的 LSPR 性質與 MEF 表現，達成優化目的使螢光值達相對最高值，最高螢光倍率高達 610 倍。此金銀奈米合金島狀薄膜材料可應用於檢測環境方面以及醫學生物相關應用，具備精準、快速且高靈敏度的優點。檢驗時只需少量的採樣樣品，即可有明顯強大的訊號。在現今社會各種疾病災害下，能夠早期發現、早期治療，達到預防勝於治療之目的。醫學生物檢測可以幫助人們在日常生活中可以方便快速，偵測評估自己的生理狀況。此實驗由於經由多次生長晶種方法之過程為隨機生長，島與島之間的大小無法一致、島與島之間的間隙寬度不一，使得實驗再現性略低，無法準確控制各島大小與形貌。未來若能改變此缺陷，達到控制其生長狀況，使得其島與島之間的大小更為一致、島與島之間的距離更為相近，或許可以再提升本系統再現性以及螢光倍率。. 50.

(60) 第六章參考資料. 1.. Hulla, J.E., S.C. Sahu, and A.W. Hayes, Nanotechnology: History and. 2.. future. Human & Experimental Toxicology, 2015. 34(12): p. 1318-1321. 牟中原、陳家俊, 科學發展, 2000. 28(4): p. 281-288.. 3.. Liu, S. and Z. Tang, Nanoparticle assemblies for biological and chemical. 4.. sensing. Journal of Materials Chemistry, 2010. 20(1): p. 24-35. Takagahara, T. and K. Takeda, Theory of the quantum confinement effect on excitons in quantum dots of indirect-gap materials. Physical Review B,. 5.. 1992. 46(23): p. 15578-15581. Miller, J.S. and A.J. Epstein, Organic and Organometallic Molecular Magnetic Materials—Designer Magnets. Angewandte Chemie International. 6.. Edition in English, 1994. 33(4): p. 385-415. Piner, R.D., et al., "Dip-Pen" Nanolithography. Science, 1999.. 7.. 283(5402): p. 661. Pareek, V.B., Arpit; Gupta, Rinki; Jain, Navin; Panwar, Jitendra, Synthesis. 8.. and Applications of Noble Metal Nanoparticles: A Review. 2017. 9: p. 527. Chen, C.-L., et al., In situ real-time investigation of cancer cell photothermolysis mediated by excited gold nanorod surface plasmons.. 9.. Biomaterials, 2010. 31(14): p. 4104-4112. Willets, K.A. and R.P. Van Duyne, Localized Surface Plasmon Resonance Spectroscopy and Sensing. Annual Review of Physical Chemistry, 2007.. 10. 11.. 12.. 58(1): p. 267-297. Ni, F.C., T. M. Anal. Chem., Chemical Procedure for Preparing SurfaceEnhanced Raman Scattering Active Silver Films. 1986. 58: p. 3159. Peiris, S., J. McMurtrie, and H.-Y. Zhu, Metal nanoparticle photocatalysts: emerging processes for green organic synthesis. Catalysis Science & Technology, 2016. 6(2): p. 320-338. Aslan, K., et al., Annealed Silver-Island Films for Applications in MetalEnhanced Fluorescence: Interpretation in Terms of Radiating Plasmons.. 13. 14.. Journal of Fluorescence, 2005. 15(5): p. 643. Zhang, Y., et al., Low Temperature Metal-Enhanced Fluorescence. Journal of Fluorescence, 2007. 17(6): p. 627-631. Aslan, K., J.R. Lakowicz, and C.D. Geddes, Rapid Deposition of Triangular Silver Nanoplates on Planar Surfaces: Application to Metal-Enhanced 51.

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(62)