第四章 實驗結果與分析
4.1 實驗設備與方法
本論文之研究資料主要是由新竹市立安心動物醫院所提供的犬隻血液抹片，
玻片製備方式介紹如下：先對犬隻採集血樣後，塗抹於玻片上，待血液塗層乾燥 後，再將玻片浸泡於特殊染色劑中進行染色，在此所採用的染色劑為「劉氏染色 劑」(圖 4.1(a))，此染色計分成 A 劑與 B 劑，而Ａ劑與 B 劑的用量為 1：2，分別 會與血液塗層中的不同物質產生作用，將該物質染上不同顏色，先將玻片浸泡於 劉氏染色劑 A 劑中，將血液塗層內的細胞直以及血紅素染成紅色，再將劉氏染 色劑 B 劑倒進適才所使用的 A 劑中，將細胞核以及白血球內的嗜鹼性顆粒作用，
染成藍紫色，玻片取出後，自然風乾，即製作完成(圖 4.1(b))。
圖 4.1 實驗資料製備。 (a) 劉氏染色劑 AB 劑 (b)染色後血液抹片。
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觀察血液抹片所使用的器材包括：數位顯微鏡、微動帄台以及背光源(圖4.2)，
而在血液抹片上所要觀察的對象則以白血球為主，主要有五種分類：嗜中性粒細 胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、單核細胞以及淋巴細胞；數位顯微鏡之物鏡 倍率為50倍，而目鏡倍率為10倍，所截取到的影像為500倍的放大倍率，再將載 玻片置於背光板上，開始調整數位顯微鏡之曝光參數，注意曝光參數並無最佳參 數值，而是以「能用肉眼分辨出細胞核與其他胞器的差別」此一準則來做為判斷 標準，配合背光源的不同亮度來修正曝光參數，以取得較適當的曝光參數設定；
使用微動帄台來移動玻片位置，在顯微鏡下以圖4.3的移動方式掃描玻片，在掃 瞄過程中，視野內若出現白血球，即進行影像擷取。
在影像取得之後，即可將影像輸入到本系統中，進行各項流程處理，從分析 RGB 色彩分佈、二值化、飽和度臨界值、區域成長、最後則是特徵抽取與分類。
(a)
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(b)
(c)
圖4.2實驗拍攝帄台。 (a) 血液抹片拍攝帄台(b) XY軸微動帄台 (c)LED背光板。
圖 4.3 掃描血液抹片路徑示意圖。
本論文共拍攝 400 張含有白血球的影像，經過獸醫師分類過後，可以將各類 血球先以人工分類計數，如表 4-1，隨機使用其中 200 張來訓練支持向量機(support vector machine)分類器，再以另外 200 張來進行驗證，並將在 4.2 節進行實驗結 果分析。
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表 4.1 訓練及驗證資料
細胞種類 訓練資料 驗證資料
嗜中性粒細胞 156 156
嗜酸性粒細胞 29 29
嗜鹼性粒細胞 32 32
淋巴細胞 149 149
單核細胞 34 34
4.2 實驗結果分析與討論
本論文的貢獻在於白血球細胞核影像的切割，以及白血球細胞核分葉特徵抽 取，在本章節將會利用實驗結果來驗證本論文之貢獻，實驗總共分為三部分，第 一部分為白血球細胞核影像切割，第二部分為多重白血球分割定位，第三部分則 為白血球細胞核影像識別。
4.2.1 白血球細胞核影像切割
作為對照，本論文引用參考文獻[2]以及幾個傳統方法來切割白血球細胞核 影像，在參考文獻[2]中，使用了最大類間方差二值化以及尼布蘭克二值化法，
再透過飽和度將影像分成白血球細胞核次影像，以及紅血球次影像，利用分水嶺 演算法來分析這兩個次影像，並且計算出白血球個數以及紅血球個數；此外，本 論文也將與在飽和度影像中只使用最大類間方差二值化法的白血球細胞核分割 方式做比較，證實本論文所提出的方法比起近年所研究的細胞核影像分割法以更 具有穩健性；而在影像分割這個階段，將分別使用染色正常以及紅血球較少重疊 的血液影像、紅血球發生重疊的血液影像、染色技術不良之血液影像、以及曝光 不足的血液影像以作為分割結果之比較標準。
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(a) (b)
(c) (d)
(e) (f)
(g) (h)
圖 4.4 驗證用血液影像。 (a)(b)無重疊無干擾影像 (c)(d)紅血球重疊影像(e)(f) 染色不均影像 (g)(h)曝光不足影像。
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表 4.2 白血球細胞核分割計數 計算影像中白血球細胞總數
影像\方法 手算 本論文所提出的方法 [2]的方法 最大類間方差
(a) 無重疊無干擾 1 1 1 2
(b) 無重疊無干擾 1 1 1 4
(c) 紅血球重疊 1 1 1 5
(d) 紅血球重疊 1 1 2 7
(e) 染色不均 1 1 3 5
(f) 染色不均 1 1 1 5
(g) 曝光不足 1 2 2 9
(h) 曝光不足 1 1 2 15
在這個影像分割的實驗中，造成分割上的困難的因素主要為血小板以及染色 不均或者曝光不足，而透過紅血球細胞的大小估測模型，可以盡可能地排除掉血 小板的干擾，因此在本論文的系統以及參考文獻[2]中，血小板的影響幾乎是微 乎其微，主要構成影響的原因來自於染色不均，以及曝光不足，但是即使是這兩 種情況，本論文的系統依舊有不錯的表現，原因在於本論文在影像輸入之後已經 對其 RGB 三通道進行了分析與校正，因此當色彩空間自 RGB 轉換成 HSV 時，
染色不均的影響已經被減弱了，如此一來 HSV 空間中的飽和度影像將能夠更貼 近視覺上的感受，在後續以飽和度影像作分析時，將能夠更明確地將白血球細胞 核與其他組織區分開來，相對於參考文獻[2]直接進行色彩空間轉換，而沒有考 慮到在飽和度轉換公式上對於染色不均的影像會有不良的效果，本論文所提出的 方法在染色不均的影像也有不錯的效果。
而相較於傳統的最大類間方差分割法，本論文所提出的方法以及參考文獻[2]
的作法都有壓倒性的優勢。
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4.2.2 多重細胞核影像切割及定位
在 4.2.1 節，已經呈現出本論文在血液抹片影像中所產生的影像退化現象有 不錯的穩健性，接下來將對於本論文的系統是否能完成多重細胞核影像切割及定 位來作探討，在這個章節，將以四個例子(圖 4.5~圖 4.9)展示本系統之能力範圍，
並非所有情況都能對目標區塊進行重新描述。
圖 4.5(a)並非取自真實血液影像，而是自行安排出來的影像，因為在真實血 正常液抹片中，少有白血球凝集的現象發生，因此為了實驗確定本論文將可以達 成多重細胞核影像切割及定位，在圖 4.5~圖 4.7 中，每張實驗用原影像皆是由實 驗者自行剪貼自其餘血液抹片影像，詴圖利用這些人工圖片來證實本論文的貢獻；
在圖 4.5(a)中，白血球細胞核區塊呈現稀疏地錯落配置，在經過白血球細胞核分 割之後，透過距離關係來重建各個區塊的關係，以獲得離散區塊是否為同一細胞 核的資訊，由圖 4.5(c)比較圖 4.5(a)可知重新描述結果無誤。
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(a)
(b)
(c)
圖 4.5 多重細胞核定位及切割。 (a)原圖 (b)細胞核切割且尚未重新描述之影
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像 (c)重新描述後影像。
在圖 4.6 中，考慮加入更多的白血球細胞核，想要由此得知細胞核的數量多 寡是否會影響系統的穩定性。
(a)
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(b)
(c)
圖 4.6 多重細胞核定位及切割。 (a)原圖 (b)細胞核切割且尚未重新描述之影 像 (c)重新描述後影像。
由實驗可知本論文在重新描述白血球時，細胞核影像的多寡並不是影響本系 統穩健性的原因，因為本系統在重新描述白血球時，所考慮的因素為距離關係，
因此，白血球細胞核若太過接近可能會導致誤分類的情況發生，從圖 4.7 將可以 發現這個現象。
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(a)
(b)
(c)
圖 4.7 多重細胞核定位及切割。 (a)原圖 (b)細胞核切割且尚未重新描述之影 像 (c)重新描述後影像。
因此，可以知道本論文在細胞核影像太過接近的時候，無法正確地重新描述，
主因即在於本論文用以重新描述的方法乃是以距離作為線索，來進行迭代，直到 所有細胞核區塊之類別都不再變動為止，或者是超過迭代上限；倘若細胞核影像 之距離太過接近，將無法把各個細胞核區塊做適當地分類，而在不斷迭代的結果
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之後，將會達到迭代上限，或者是產生錯誤分類，因此本系統在多重白血球定位 的能力上，受限於白血球細胞核聚集程度，但在正常血液中，白血球凝集現象不 太可能發生，因此就正常的血液抹片而論，本論文所提出的方法仍具有不錯的效 果。
表 4.3 多重細胞分割定位結果
影像\方法 手算 重新描述前 重新描述後
圖 4.5 7 9 7
圖 4.6 11 15 11
圖 4.7 5 9 7
4.2.3 白血球細胞核分類
在白血球細胞核影像分布較為稀疏的情況下，本論文將把各個白血球細胞核 區塊抽取特徵並且進行分析，主要想要呈現的結果是在粒細胞以及非粒細胞間能 夠有明顯區別而不會被誤分，要達成這個目的所使用的方法為抽取分葉特徵，以 及利用分類器結構來達成目的，所採用的訓練集以及驗證集則由表 4.1 所標示的 各類血球類別來擔任。
分類比較對象為人工辨識，以及參考文獻[15]的分類方法，該方法在分類部 分與本論文所提出的方法最大的差異在於[15]使用了主動輪廓來做細胞核以及 細胞質切割，為了減少實驗上的誤差，將跳過[15]的切割方法，直接以[15]的分 類特徵以及分類法與本論文提出的分類特徵與分類法作比較，實驗結果將以三個 表格來呈現，表 4.2 則為本論文所提出的方法實驗後的結果，表 4.3 為參考文獻 [15]所提出的方法實驗後的結果。
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表 4.1 訓練及驗證資料
細胞種類 訓練資料 驗證資料
嗜中性粒細胞 156 156
嗜酸性粒細胞 29 29
嗜鹼性粒細胞 32 32
淋巴細胞 149 149
單核細胞 34 34
表 4.4 根據本論文所作的分類實驗結果
輸入\輸出 嗜中性 嗜鹼性 嗜酸性 單核細胞 淋巴細胞 正確率
嗜中性 149 0 7 0 0 95.5%
嗜鹼性 0 30 2 0 0 93.75%
嗜酸性 3 0 26 0 0 89.65%
單核細胞 0 0 0 30 4 88.23%
淋巴細胞 0 0 0 8 141 94.63%
表 4.5 根據參考文獻[15]所作的分類實驗結果
輸入\輸出 嗜中性 嗜鹼性 嗜酸性 單核細胞 淋巴細胞 正確率
嗜中性 141 0 5 3 0 90.38%
嗜鹼性 0 21 1 0 10 65.6%
嗜酸性 5 0 24 0 0 82.76%
單核細胞 5 0 0 18 11 52.94%
淋巴細胞 0 0 0 15 134 89.93%
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在分類實驗之後，來探討關於參考文獻[15]在分類上所提出的方法比較本論 文的方法有何不同，為何會造成這樣的落差，討論的角度可以從分類所使用的特 徵，以及分類器結構來討論。
在分類特徵的部分，[15]使用的特徵之維度為 26，其中 18 個為色彩特徵，8 個為形狀特徵，其中色彩的特徵的部分來自於細胞核與細胞質的 HSL 三通道數 值的均值、標準差以及偏度(skewness)；另外 8 個形狀特徵則是击度(convexity)、
主軸比(principle axis ratio)、完備度(compactness)、圓變異度(circular variance)，
主軸比(principle axis ratio)、完備度(compactness)、圓變異度(circular variance)，