實驗部份

3-1 試藥

3-1-1 合成[Bmim][Cl]、[Bmim][PF6]與[Bmim]2[Congo Red]

之藥品

1-chlorobutane, C₄H₉Cl, 99 %, GR grade (Janssen Chimica, USA) 1-methylimidazole, C₄H₆N₂, 99 %, GRgrade (Acros, USA)

Ethyl Acetate,CH₃COOC₂H₅,HPLC/spectro grade(Mallinckrodt, USA) Potassium hexafluorophosphate, KPF₆, 99 %, GR grade (Showa, Japan) Magnesium sulfate anhydrous, MgSO₄, 99 %, GR grade (Showa, Japan) Congo Red , C₃₂H₂₂N₆Na₂O₆S₂, 85% (Sigma, USA)

Silver nitrate, AgNO₃, GR grade, 99.8 % (Showa, Japan) Acetone Nitrile, HPLC grade, 99.9 % (TEDIA, USA)

3-1-2 配製緩衝溶液之試劑

Hydrochloric Acid, HCl, GR grade (Showa, Japan)

Potassium chloride, KCl, GR grade (Scharlau,Barcelona, Spain) Glycine, C₂H₅NO₂, GR grade (Riedel-de Haën, Germany)

Acetic Acid, CH3COOH, analytical grade (Scharlau, Barcelona,Japan) Sodium acetate, CH₃COONa, 98.5 %, GR grade (Showa, Japan)

Sodium dihydrogenphosphate anhydrous, NaH2PO4, 98.0 %, GR grade (Showa, Japan)

Potassium dihydrogenphosphate, KH2PO4, 99%, GR grade, (Showa, Japan)

Tris(hydroxymethyl) aminomethane, (HOCH2)3CNH2, ACS grade (TEDIA, USA)

Sodium hydrogen carbonate, NaHCO3, 99.5 %, GR grade (Showa, Japan) Sodium hydroxide, NaOH, 96 %, GR grade (Showa, Japan)

Citric acid,100 %, HOC(COOH)(CH2COOH) 2 (Anhydrous, powder),ACS grade(Mallinckrodt Baker, Phillipsburg, NJ, USA) Sodium citrate,99.6 %, HOC(COONa)(CH₂COONa) ₂、2H₂O, ACS grade(Mallinckrodt Baker, Phillipsburg, NJ, USA)

Sodium chloride, NaCl, 99.6%,GR grade(Scharlau, Barcelona,Spain) Sodium Thiocynate,NaSCN,99%,(Hanawa,Japan)

D.I.W.去離子水，經由 Millipore (Bedford MA ,USA)的 Milli-Q plus 處 理

3-1-3 蛋白質分子

Bovine serum albumin (牛血清蛋白)，簡稱 BSA，M.W. : 63000，98%，

pI : 4.6，(Sigma,USA)，

Ribonuclease A from Bovine Pancreas, M.W.13700 pI=9.45 (Sigma,, USA)

Lysozyme (溶菌酶) from chicken egg white，M.W. : 14400，97%，

pI : 10.7，(Sigma,USA)

3-2 儀器

(1)紫外光-可見光光譜儀 UV-Visible Spectrophotometer, Hewlett Packard 8453(Waldronn, Germany)

(2)高效能液相層析管柱(reversed-phase HPLC column): Vercopak Inertsil 7 octadecyl silica-3 (ODS-3), (建宏層析，台北)

管柱尺寸為4.6

×

250 mm，孔徑大小為 10 µm，用於蛋白質的分 析與定量。

(3)梯度幫浦(Gradient Pump): Degasys DG 2410, (Lab Alliance, USA) 結合Series Ⅲ pump，最多可做四種動相組成的梯度混合。

(4)核磁共振儀(Nuclear Magnetic Resonance, NMR): DRX-300, (Bruker, Germany); Uniytinova-500, (Varian, USA)

(5)酸鹼度計(pH meter): Microprocessor pH Meter SP-2200, (Suntex)

(6)離心機(Centrifuges): EBA20, (Hettich, Germany) 最大轉速6000 rpm，最大離心力為 3421 g

(7)電子天秤(Electronic Balance): Bruker Daltonic Esuire 2000, (Leipzig, Germany)

(8)質譜儀(Mass Spectrometer): Quattro Micro, (Waters,USA) (9)微差掃描卡計(Differential Scanning Calorimetry, DSC):

使用Du Pont TA 2000 及 Computer/Thermal Analyzer。

3-3 實驗流程

3-3-1 合成離子液體[Bmim][Cl]與[Bmim][PF6]²⁷

1.將 0.9 mole (94.05 ml) 1-chlorobutane 和 0.9 mole (71.7ml)

1-methylimidazole 加入至 250 ml 圓底瓶中，並架設迴流裝置，加熱 至80℃後，持續攪拌約 48 hr，可得一金黃色黏稠液體

1-butyl-3-methylimidazolium chloride ([Bmim][Cl])。

2.將此黏稠液體到入 500ml 分液漏斗中，加入 75 ml 的乙酸乙酯洗去 未反應物，取出下層液於圓底瓶中，並再重覆此步驟一次。

3. 將所得金黃色黏稠狀液體加熱至90℃攪拌一天，去除乙酸乙酯。

4. 取0.9 莫耳 KPF6 加入450 ml 去離子水中，室溫下攪拌至溶解。

5. 將所得金黃色黏稠狀液體加入裝有KPF6溶液的燒杯中，以磁石 攪拌1 小時。

6..將溶液倒入分液漏斗中，取出水層，再加入少許去離子水，除去水 層，重覆此步驟數次直到水層成中性。

7.取出下層離子液體，加入硫酸鎂除去離子液體層中的水，經重力過 濾後，即可得到1-butyl-3-methyl imidazolium hexafluorophosphate ([Bmim][PF6])。

8.合成示意圖如圖 3-1，最後將產物送測¹H-NMR，以鑑定之。

+

Reflux, 80

⁰

C 48hr

KPF

₆

/H

₂

O r.t. 1hr

Phase separation

PF ₆ -Cl

-圖 3-1、[Bmim][PF6]的合成示意圖

3-3-1-2 合成 [Bmim]₂[Congo Red]

1.取 5x10^-4 mole (0.3485 g) 剛果紅，溶於 100 ml 去離子水，再加入 5x10^-3 mole (0.85 g) AgNO3，室溫下攪拌24 hr。

2.將所得溶液以 6000 rpm 轉速離心 5 min，將水相去除後，以 10 ml 冰水清洗沉澱物，並再重複清洗兩次。

3.將沉澱物置於烘箱，60℃條件下，烘 72hr，可得到暗紅色固體 [Ag]2 [Congo Red]。

4.將步驟 3.所得的[Ag]2 [Congo Red]，加入 50 ml 乙晴溶解之，再加入 兩倍莫耳數的[BMIM][Cl]，40℃攪拌 72 hr。

5.將所得溶液以 6000 rpm 轉速離心 5 min，去除沉澱物 AgCl，再以旋 轉濃縮機去除乙晴。

7.合成反應式如式 3-1、3-2，產物以 UV-vis 、Mass、DSC 鑑定之。

[Na

₂⁺

][Congo Red

^2-

]

_(aq)

+ 2AgNO

_{3 (aq)}

2Na

⁺ _(aq)

+ 2NO

₃ ^-

+ [Ag]

₂

[Congo Red] (式3-1)

[Ag]

₂

[Congo Red]

_(ACN)

+ 2[Bmim][Cl]

_(l)

2AgCl

_(S)

( ) + [Bmim]

₂

[Congo Red] (式3-2)

3-3-2 配製緩衝溶液

0.05 M KCl / 0.1 M HCl 調配 pH 範圍 1.0-2.2 0.05M Glycine / 0.1M HCl 調配 pH 範圍 2.3-3.5 (用於 Congo Red/IL 系統)

0.05M Citric acid/0.05M Sodium citrate 調配 pH 3.0 (用於[Bmim]2[Congo Red]/IL 系統)

0.05 M CH3COOH / 0.05 M CH3COONa 調配 pH 範圍 3.6-5.0 0.05 M KH2PO4 / 0.1 M NaOH 調配 pH 範圍 5.8-6.9

0.05 M Tris(hydroxymethyl)-aminomethane / 0.1M HCl 調配 pH 範圍 7.0-9.0

0.05M NaHCO₃ / 0.1M NaOH 調配 pH 範圍 9.6-11.0 0.05M Na₂HPO₄ / 0.1M NaOH 調配 pH 範圍 10.9-12.0

3-3-3 蛋白質定量方式

本實驗將萃取過後的蛋白質水溶液用HPLC 分析，以紫外光 偵測器作為訊號偵測。蛋白質中的胺基酸具有芳香基團，在波長 280 nm 會吸光，所以本實驗選擇 280 nm 光源對蛋白質作定量。

3-3-3-1 利用 HPLC 定量蛋白質水溶液

1. 用動相 A (含有 20 % ACN、0.1 % TFA 的水溶液)沖提 reverse phase

HPLC 使平衡 10 分鐘。

2. 注入 20μL 樣品。

3. 以動相 A+B(含有 80 % ACN、 0.1 % TFA 的水溶液)，做梯度沖提 並以所得積分面積定量。

3-3-4 製備液相/液相萃取系統及萃取牛血清蛋白

在本實驗中萃取系統分為兩種方式，一種是將親和性染料剛果紅 直接溶入[Bmim][PF6]攪拌作用，使部分剛果紅轉移到離子液體層，

再加入去離子水形成液相/液相萃取系統。另一種方式則是將親和性 染料先合成為離子液體[Bmim]2[Congo Red]，在將其作為萃取劑加到 萃取相中。

3-3-4-1 以親和性染料剛果紅為萃取劑萃取牛血清蛋白

3-3-4-1-1 配置萃取相

1. 分別將 5.0 mg、10.0 mg、20.0 mg、30.0 mg 剛果紅粉末加入 10ml[Bmim][PF6]中，在室溫下攪拌 20 分鐘使其溶解，再加入等 體積的去離子水攪拌平衡一天後，將懸浮在[Bmim][PF6]中未溶解 的染料粉末清洗至水層；並移去水相，加入新的去離子水清洗，

重覆步驟兩次。

3-3-4-1-2 萃取牛血清蛋白

1. 正向萃取：

以50mM CH3COONa/CH3COOH buffer (pH=4)， 緩衝溶液配 製2.0*10²、5.0*10²、1.0*10³ mg/L 的牛血清蛋白水溶液，取 1.0 ml 牛血清蛋白水溶液與1.0 ml 的萃取相置於 20 ml 樣品瓶中，在室 溫下攪拌30 分鐘後，靜置分層，取出上層水相以 HPLC 定量。

3-3-4-1-3 比較萃取時間對萃取效率的影響

將等體積pH 4.0 的 2.0*10² mg/L 牛血清蛋白水溶液與萃取相(

將20.0 mg 剛果紅粉末加入 10ml[Bmim][PF6]中，清洗過後)置入 20 ml 樣品瓶中，分別以磁石攪拌1、5、10、20、30、60 分鐘，探討攪拌 時間對蛋白質正向萃取的影響。

3-3-4-1-4 pH 值對蛋白質萃取的效應

1. 配製 pH 範圍 1.0~12.0 的 200 mg/L 牛血清蛋白水溶液 2. 正向萃取：

將 pH 範圍 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、

11.0、12.0 的 2.0*10²mg/L 牛血清蛋白水溶液分別取 1.0 ml 與 1.0 ml 配製的萃取相(將 20.0 mg 剛果紅粉末加入

10ml[Bmim][PF6]中，清洗過後)置入 20 ml 樣品瓶中，以磁石攪 拌30 分鐘，混合完靜置分層，取出上層水相以 HPLC 定量。

3. 反向萃取：

取pH 4.0 的 2.0*10² mg/L 牛血清蛋白水溶液 1.0 ml 與 1.0 ml 的萃取相(將 20.0 mg 剛果紅粉末加入 10ml[Bmim][PF6]

中，清洗過後)置入 20 ml 樣品瓶中，以磁石攪拌 30 分鐘，靜置 分層後，取出下層離子液體相置於另一 20 ml 樣品瓶中，加入等 體積pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0 的緩衝 溶液，置於室溫下攪拌30 分鐘，靜置分層，取出上層水相以 HPLC 定量。

3-3-4-2 以 [Bmim]2[Congo Red]作為萃取劑萃取牛血清蛋白

3-3-4-2-1 配置萃取相

1.分別將 30.0、 50.0、 100.0、 150.0、200.0 mg [Bmim]2[Congo Red]溶入 10ml 的[Bmim][PF6]中，加入等體積去離子水，長時間

攪拌，使萃取系統能充分與水相平衡，之後移除水相，再加入新 的等體積的去離子水。

2.定量方法:將[Bmim]2[Congo Red]溶於[Bmim][PF6]，配製成濃度 分別為 3.0、5.0、10.0、15.0、20.0 mg/ml，各取 20

µ

l 並加入 3.0 ml 甲醇，由紫外光-可見光光譜儀針對波長 497 nm 吸收值做

出檢量線。再將步驟 1.平衡過後的萃取相各取 20

µ

l 並加入 3.0 ml 甲醇，測出波長 497nm 吸收值，帶入檢量線後，即可得到萃 取相中[Bmim]2[Congo Red]的濃度。

3.萃取相之 K 值:將步驟 1.配好的濃度為 9.6mM 的萃取系統，

取出上層相體積 20

µ

l 並加入 3.0 ml 甲醇，由紫外光-可見光 光譜儀針對波長 497 nm 測量其吸收值，再取出下層相體積 20

µ

l 並加入 3.0 ml 甲醇，並測量其在波長 497 nm 的吸收值，再將 由上層相得到的吸收值除以由下層相得到的吸收值，即可求出 K 值。

3-3-4-2-2 萃取牛血清蛋白

正向萃取: 將配置好的 2.7、5.3、9.6、15.7、19.7 mM 濃度的萃取相 1.0 ml 分別加入 2.0*10²、5.0*10²、1.0*10³mg/L、pH 4.0 的牛血清蛋白溶液1.0ml，攪拌 30 分鐘，靜置分層，取上 層水溶液做定量。

3-3-4-2-3 攪拌時間對萃取率影響

正向萃取:取含有 9.6mM 濃度的萃取相 1.0 ml 分別加入 2.0*10²

mg/L、pH4.0 的牛血清蛋白水溶液 1.0ml，攪拌 0.5、1、5、

10、20、30、60 分鐘，靜置 30 分鐘，取上層水溶液做 定量。

3-3-4-2-4 改變 pH 值及離子強度對萃取率影響 (a)對正向萃取之影響

正向萃取: 取含有 9.6mM 濃度的萃取相 1.0 ml 分別加入 2.0*10² mg/L、pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 的牛血 清蛋白水溶液1.0ml，攪拌 30 分鐘，靜置分層，取上層水 溶液做定量。

(b) 對反向萃取之影響

正向萃取: 取含有 9.6mM 濃度的萃取相 1.0 ml 加入 2.0*10² mg/L、pH 4.0 的牛血清蛋白水溶液 1.0ml，攪拌 30 分鐘，靜置分層，

取上層水溶液做定量。

反向萃取:取正向萃取完的離子液體層，加入等體積 pH 4.0、5.0、6.0、

7.0、8.0、9.0、10.0 的緩衝溶液，攪拌 30 分鐘，靜置分 層，取上層水溶液做定量。

(c) 離子強度對反向萃取之影響

正向萃取: 取含有 9.6mM 濃度的萃取相 1.0 ml 加入 2.0*10²mg/L、pH 4.0 的牛血清蛋白水溶液 1.0ml，攪拌 30 分鐘，靜置分層，

取上層水溶液做定量。

反向萃取:取正向萃取完的離子液體層，加入含等體積 1.0M NaSCN pH pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 的緩衝溶液，攪拌 30 分鐘，靜置分層，取上層水溶液做定量。

(d) 鹽類濃度對反向萃取之影響

正向萃取: 取含有 9.6mM 濃度的萃取相 1.0 ml 加入等體積 2.0*10² mg/L、pH 4.0 的牛血清蛋白水溶液，攪拌 30 分鐘，靜置 分層，取上層水溶液做定量。

反向萃取:取正向萃取完的離子液體層，加入等體積不同濃度 NaSCN pH9.0 的緩衝溶液，攪拌 30 分鐘，靜置分層，

3-3-4-2-5 萃取其他蛋白質水溶液

除了牛血清蛋白水溶液外，本實驗也對其他pI 值差異較大的蛋 白質作初步的萃取測試，探討以[Bmim]2[Congo Red]為萃取劑時靜電 力在此系統中的影響。

(a) 無添加萃取劑: 取[Bmim][PF₆] 1.0ml 分別加入 2.0*10² mg/L，pH 4.0 與 7.0 的蛋白質溶液，攪拌 30 分鐘，靜置分 層，取上層水溶液做定量。

(b) 添加萃取劑: 取含有 9.6mM 濃度的萃取相 1.0 ml 分別加入 2.0*10² mg/L，pH 4.0 與 7.0 的蛋白質水溶液，攪拌 30 分 鐘，靜置分層，取上層水溶液做定量。

在文檔中 應用親和性染料剛果紅於離子液體中萃取蛋白質 (頁 38-53)