結果與討論

4-1 離子液體的合成

本實驗所合成的離子液體包括[Bmim][PF₆]、[Bmim]₂[Congo Red]，

室溫之下的[Bmim][PF₆]為金黃色黏稠液體，與水不互溶。合成產物 [Bmim][PF6]的¹H-NMR 如圖 4-1 所示，¹H-NMR (500 MHz, CH3Cl-d) δ:

8.36 (1H, s, NCHN), 7.30 (1H, s, CH₃NCHCHN), 7.27 (1H, s, CH₃NCHCHN), 4.08 (2H, t, J=12Hz, NCH₂(CH₂)₂CH₃), 3.82 (3H, s, NCH₃), 1.77 (2H, quintet, NCH₂CH₂CH₂CH₃), 1.28 (2H, sextet, N(CH₂)₂CH₂CH₃), 0.84 (3H, t, J=12 Hz, N(CH₂)₃CH₃). [BMIM][PF₆]已是被廣泛使用的一種離子液體，其性質也已被鑑定出來⁷⁵。

[Bmim]2[Congo Red]為暗紅色黏稠液體，合成步驟中先利用 AgNO3 和 Congo Red 反應形成[Ag]2[Congo Red]，產率約 53 %。

[Ag]2[Congo Red]以乙晴溶解後，再加入[Bmim][Cl]攪拌，產生 AgCl 沉澱，移除 AgCl 和溶劑之後，即可得到[Bmim]2[Congo Red]，產率約 26%。而以 ESI^-作為質譜儀的游離方式時，可得([Bmim][Congo Red])^-的 m/z=789.2，而從 263.1 開始有 m/z=201 的間隔出現則推測是由鹽類[Bmim][NO3]所造成。而由圖 4-2 的 UV-vis 吸收圖譜中顯示 Congo Red 的發光團在 497 nm 時有吸收，[Bmim][PF6]陽離子部分在

210 nm 有吸收，而[Bmim]2[Congo Red]則同時兼具有這兩個波段的吸收。另外由[Bmim][Cl]和[Bmim]2[Congo Red]的¹H-NMR 圖譜比對，

可看出化學位移的現象，與文獻中指出離子液體陰離子不同時，陽離子上的氫會有化學位移產生相符²²。[Bmim][Cl]的¹H-NMR 如圖 4-3，

(500 MHz, CH3Cl-d) δ: 9.81 (1H, s, NCHN), 7.67 (1H, s, CH3NCHCHN), 7.64 (1H, s, CH3NCHCHN), 4.25 (2H, t, J=12.0 Hz, NCH2(CH2)2CH3), 3.33 (3H, s, NCH3), 1.80 (2H, quintet, NCH2CH2CH2CH3), 1.28 (2H, sextet, N(CH2)2CH2CH3), 0.91 (3H, t, J=12.0 Hz, N(CH2)3CH3). 而 [Bmim]₂[Congo Red] 的 ¹H-NMR 如圖 4-4，(500 MHz, CH₃OH-d) δ:

8.81 (1H, s, NCHN), 7.43 (1H, s, CH3NCHCHN), 7.39 (1H, s, CH3NCHCHN), 4.15 (2H, t, J=12.0 Hz, NCH2(CH2)2CH3), 3.87 (3H, s, NCH3), 1.80 (2H, quintet, NCH2CH2CH2CH3), 1.32 (2H, sextet, N(CH2)2CH2CH3), 0.96 (3H, t, J=12.0 Hz, N(CH2)3CH3). 而由圖 4-5，

DSC 圖譜中可看出[Bmim]2[Congo Red]的熔點為 4.5℃，

圖4- 1 [Bmim][PF6] NMR圖譜

圖4-2 [Bmim]2[Congo Red] M

ASS

圖譜

109876543210ppm

圖4- 4 [Bmim]2[Congo Red] NMR圖譜

N

0 10 20

[ B m i m ]

[ C o n g o R e d ]

Temperature (

⁰

C)

T _m =4.5 ⁰ C

En do th er mi c

圖 4- 5 [Bmim]₂[Congo Red]之 DSC 圖譜

4-2 製備液相/液相萃取系統

4-2-1 以親和性染料剛果紅為萃取劑

本實驗使用疏水性的離子液體[Bmim][PF6]作為萃取相，其在水中溶解度為0.13% v/v²⁷，和水溶液攪拌後可快速分層，在25⁰C 時的密度為1.36(g/ml)¹，在兩相中位於下層，水溶液在上層。首先利用未加入任何萃取劑的離子液體 [Bmim][PF6]來萃取牛血清蛋白，對 2.0*10² mg/L 牛血清蛋白水溶液的萃取率為 27.9%

再來，將紅色染料剛果紅直接溶入[Bmim][PF6]中，在與水平衡後，結果發現離子液體相由原先金黃色轉為橘紅色(如圖 4-6 所示)，

其UV-vis 吸收光譜圖如圖 4-7，在 497nm 有吸收。

(a) (b) (c)

4-2-2 以[Bmim]2[Congo Red]為萃取劑

由於剛果紅能進入離子液體[Bmim][PF6]的量有限，因此便利用銀離子交換法合成出[Bmim]2[Congo Red] ，希望藉由陽離子之間的 π-π電子間作用力讓大量的[Bmim]2[Congo Red]溶於[Bmim][PF₆]中，

其外觀如圖4-6 所示，UV-vis 吸收光譜圖如圖 4-8，在 497 nm 時有吸收，證實[Bmim]2[Congo Red]的確能溶於萃取相，加入去離子水平衡後，[Bmim]2[Congo Red]較偏向於存在於離子液體層，[Bmim]2[Congo Red]在水相和離子液體相之間的分佈係數 KU/L= 0.01。而定量實際溶於離子液體相中染料濃度的方法，是將不同已知濃度的

[Bmim]2[Congo Red]以甲醇稀釋後，取其在 497 nm 的最大吸收波長對濃度作校正曲線，如圖4-9 所示，而由表 4-1 所示，可進入離子液體[Bmim][PF6]的[Bmim]2[Congo Red]大增，且不易被水洗出，並能長時間存在於離子液體相。

300 400 500 600 700

R² = 0.9993

[Bmim]2[Congo Red]/ [Bmim][PF6] (mg/ml)

圖 4-9 [Bmim]2[Congo Red]的校正曲線圖（at 497 nm）

[Bmim]₂[Congo Red]在[Bmim][PF₆]中的濃度清洗前

4-3 萃取牛血清蛋白

本實驗萃取牛血清蛋白之示意圖如圖4-11，分為正向萃取及反向萃取兩步驟，正向萃取率(forward extraction efficiency, Ef)和蛋白質回收率(total efficiency, recovery, Et)的定義如下。

= BSA

aqueous phase aqueous phase

aqueous phase

extraction

phase extraction

phase

extraction phase Forward

extraction

Backward extraction

Low pH High pH

and salt

圖 4- 10、蛋白質萃取過程示意圖

4-3-1 萃取劑對牛血清蛋白萃取的影響

4-3-1-1 以親和性染料剛果紅為萃取劑萃取牛血清蛋白

如圖4-12、表 4-5 所示，在 pH 為 4.0 時萃取牛血清蛋白，當離子液體相中 Congo Red 的含量增加，正向萃取率隨之提高，最高可達到75 %。隨著蛋白質濃度增加，正向萃取率下降，由此可知每單位的Congo Red 對蛋白質進行親和力結合的能力有限。

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

4-3-1-2 以[Bmim]2[Congo Red]為萃取劑萃取牛血清蛋白

利用[Bmim]2[Congo Red]為萃取劑，在 pH 為 4.0 時，萃取 2.0*10² mg/L 牛血清蛋白水溶液時，萃取率會隨[Bmim]2[Congo Red]濃度增加而提高，當濃度增加到9.6mM 時，萃取率達到定值(如圖 4-13)，未加入[Bmim]2[Congo Red]時，有 28 %的牛血清蛋白被萃取到離子液體層，在加入[Bmim]2[Congo Red]後，能達到近 100%的高萃取率，顯示能達到高萃取率是因為萃取劑[Bmim]2[Congo Red]的加入，因此選用含9.6mM [Bmim]2[Congo Red]的離子液體作為實驗條件，另外，因為在[Bmim]2[Congo Red]/IL 系統中萃取劑可較為穩定且大量存在於離子液體相，所以在萃取劑的量加的夠多時，對5.0*10²mg 及 1.0*10³ mg/L 的牛血清蛋白水溶液作萃取，也可達到近 100%的萃取率。

0 5 10 15 20

4-3-2 比較萃取時間對萃取率的影響

4-3-2-2 [Bmim]2[Congo Red]/IL 系統中攪拌時間對萃取率的影響

4-4 pH 值對蛋白質萃取的效應

一般親和性染料在結構上都帶有磺酸根,並由於染料上磺酸根的 pKa 值極低，在一般的實驗條件下，磺酸根上所帶的氫會游離，使得親和性染料本身帶有負電，可和蛋白質上的protonated site 結合 (deprotonated SO3 group-NH2 terminus)。文獻中也曾經以 MALDI 探討蛋白質與磺酸類親和性染料之間的作用力, 提出兩者之間的主要吸引力應為庫侖靜電力⁷⁵。為了進一步確認親和性染料與蛋白質之間的作用力機制為何，本實驗藉由改變蛋白質正向及反向萃取時緩衝溶液的pH 值，觀察其萃取率的變化。牛血清蛋白的等電點(pI)為 4.6，

在pH 值為 4.0 的緩衝溶液中,是以帶正電荷的形式存在，由本實驗結果中可看出，不論是在Congo Red/IL 系統或是在[Bmim]2[Congo Red]/IL 系統中，牛血清蛋白的萃取率受到靜電吸引力所影響，結果顯示剛果紅是以負電荷形式與蛋白質互相吸引而結合，蛋白質基團上所帶的電荷隨著pH 值改變而變化，在低 pH 值時，牛血清蛋白上所帶正電荷越多，可得到最佳正向萃取率，反之在高pH 值時，由於靜電排斥力的作用，蛋白質可脫離親和性染料而得到較好的回收效果；

Congo Red/IL 系統與[Bmim]2[Congo Red]/IL 系統的正向萃取的實驗結果分別如圖4-15 及圖 4-16 所示，牛血清蛋白的正向萃取率是隨著 pH 值的提升而降低，且由於牛血清蛋白的 pI 值為 4.6，所以在 pH4.0

到5.0 間可看出萃取率明顯的下降。

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0

20 40 60 80 100

Ef ficiency (%)

pH

圖 4-16 [Bmim]₂[Congo Red]/IL 系統中不同 pH 值對牛血清蛋白水溶液的正向萃取效率

4 6 8 10 12

4 5 6 7 8 9 10 0

10 20 30 40 50 60 70

Efficiency (%)

圖 4-18 [Bmim]₂[Congo Red]/IL 系統中不同 pH 值對牛血清蛋白水溶液的反向萃取結果

4-5 離子強度對蛋白質萃取的效應

蛋白質的三級結構主要會受到下列四種作用力的影響： (1) 雙硫鍵的存在與否（2）胺基酸序列本身疏水性的差異(3) 氫鍵作用力 (4) 帶電荷的蛋白質彼此之間的離子吸引力。本實驗藉由添加鹽類改變溶液中的離子強度，產生遮蔽效應，使得蛋白質彼此之間的離子吸引力減弱，蛋白質的三級結構在鹽類存在的環境下產生變形，此時親和性染料與蛋白質之間因構形互補所貢獻的親和力，因著蛋白質的變形而減弱，蛋白質可被成功反向萃取出來。

一般親和性層析在吸附目標物後，會利用含有高鹽類濃度的水溶液使將目標物從靜相脫附而被沖提出來，本實驗在反向萃取中分別以加入1.0M NaSCN 的不同 pH 值的緩衝溶液及在 pH9.0 的條件下利用不同濃度的的NaSCN 作為實驗條件，探討遮蔽效應破壞牛血清蛋白和[Bmim]2[Congo Red]陰離子磺酸基之間的靜電作用力，使牛血清蛋白回到水相。由圖4-19 可看出加入 1.0 M 的 NaSCN 在不同 pH 條件下反向萃取率只能略為提升，固進一步嘗試在pH 9.0 為條件下增加 NaSCN 的濃度，結果如圖 4-20 所示，隨著離子強度的增強，遮蔽效應愈明顯，使得蛋白質回收率有所提升，最高可達約60%，但在實驗過程中也發現，加入NaSCN 的濃度越高則水相愈成紅色，顯示萃取

劑會被大量洗出，所以實驗過程中還是選用1.0M NaSCN 作為實驗條件。

4 5 6 7 8 9

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Efficiency (%)

pH

without NaSCN with 1M NaSCN

圖 4-19 [Bmim]₂[Congo Red]/IL 系統中不同 pH 值及加入鹽類 NaSCN 對牛血清蛋白水溶液的反向萃取效結果

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

4-6 分別萃取其他蛋白質水溶液

由於親和性染料為group-specific ligand，並非對單一蛋白質才具有親和性，故為了探討[Bmim]2[Congo Red]與其他蛋白質之間作用力，除了牛血清蛋白，本實驗也嘗試萃取其他等電點差異較大的其他蛋白質，包含溶菌酶(lysozyme)與核醣核酸酶 A(Ribonuclease A)，以探討此系統對其他蛋白質間作用力的影響。

當利用[Bmim][PF₆] 在 pH 4.0 條件下分別萃取這三種蛋白質時，其萃取效率分別為對牛血清蛋白27.9%，對核醣核酸酶 A 28.1% ，對溶菌酶 28.0%(如表 4-2) ，而使用濃度為 9.6mM 的 [Bmim]₂[Congo Red]/IL 系統的萃取相，同樣在 pH 4.0 條件下分別萃取這三種蛋白質水溶液時，發現pI 值最低的牛血清蛋白有近 100%的萃取率，而pI 值在中間的核醣核酸酶 A 只有 35.2 %的萃取率，但對 pI 值最高的溶菌酶又為近 100%，而使用含[Bmim]₂[Congo Red]萃取劑的系統中會因萃取劑帶有磺酸基SO₃^-而帶有對正電蛋白質的吸引力，在pH 4.0 時核醣核酸酶 A 雖為帶正電而萃取率卻並未明顯提升，

故推測靜電力在此系統中並非唯一與蛋白之間的作用力，蛋白質與染料間的親和力也為另一項主要因素，曾有研究顯示以剛果紅做為親和性染料時對溶菌酶也有所吸附只是吸附的量較牛血親蛋白來的少

68 ，而由實驗結果顯示萃取劑[Bmim]₂[Congo Red]在 pH 為 4.0 的條

件下對溶菌酶的萃取率也為近100%，因此推測雖然溶菌酶對剛果紅的親和力較牛血清蛋白來的小，但因溶菌酶pI 值過高造成在酸性環境下帶有較多正電荷，靜電力的影響也較大，故也能達到近100%的萃取率。

而在pH7.0 的條件下萃取三種蛋白質，實驗結果發現對核醣核酸酶A 萃取時，加入萃取劑[Bmim]₂[Congo Red]對萃取率並無影響，顯示萃取劑[Bmim]₂[Congo Red]對核醣核酸酶 A 無親和力的作用，而對牛血清蛋白作萃取時不論是否加入加入萃取劑[Bmim]₂[Congo Red]

都沒有任何萃取率，而對溶菌酶作萃取時則發現加入萃取劑

[Bmim]₂[Congo Red]可使萃取率由原先 11.3%提升至 83.6%，綜合以上結果以[Bmim]₂[Congo Red]/IL 系統萃取蛋白質時，萃取率會深受蛋白質與萃取劑的親和力與靜電力所影響，且若少了其中一種作用力則萃取劑[Bmim]₂[Congo Red]對蛋白質的萃取率就無顯著影響，另外親和力或靜電力越強時，蛋白質的萃取率也越高。

牛血清蛋白核醣核酸酶A 溶菌酶

等電點 (pI) 4.6 9.5 10.7

[BMIM][PF₆]

E_f(%) 27.9 28.1 28.0 pH4 [Bmim][PF6]+

[Bmim]2[Congo Red]

Ef (%)

98.6 35.2 97.6

[BMIM][PF6]

Ef (%) -- 24.0 11.3 pH7 [Bmim][PF₆]+

[Bmim]₂[Congo Red]

E_f(%)

-- 24.8 83.6

表4-2 [Bmim]₂[Congo Red]/IL 系統中對不同蛋白質的萃取率

在文檔中應用親和性染料剛果紅於離子液體中萃取蛋白質 (頁 53-83)

ASS

N

N

[ B m i m ]

[ C o n g o R e d ]

Temperature (

C)

T m =4.5 0 C

En do th er mi c

[Bmim]2[Congo Red]/ [Bmim][PF6] (mg/ml)

= BSA

aqueous phase aqueous phase

aqueous phase

extraction

phase extraction

phase

extraction phase Forward

extraction

Backward extraction

Low pH High pH

and salt

0 5 10 15 20

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0

20 40 60 80 100

Ef ficiency (%)

pH

4 6 8 10 12

4 5 6 7 8 9 10 0

10 20 30 40 50 60 70

4 5 6 7 8 9

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Efficiency (%)

pH

without NaSCN with 1M NaSCN

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0

T _m =4.5 ⁰ C