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應用親和性染料剛果紅於離子液體中萃取蛋白質

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Academic year: 2021

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(1)

國 立 交 通 大 學

應用化學研究所

碩士論文

應用親和性染料剛果紅於離子液體中萃取

蛋白質

Application of affinity dye congo red in ionic

liquid for protein extraction

研 究 生:謝文淵

指導教授:余 艇 博士

(2)

應用親和性染料剛果紅於離子液體中萃取蛋白質

學生: 謝文淵 指導教授: 余 艇

國立交通大學應用化學所

摘要

室溫離子液體(Room Temperature Ionic Liquids, ILs) 因具有不揮 發性、低毒性、高熱穩定性、良好導電度、可回收與重複使用等特殊 的物理與化學性質,近年來已引起廣泛的研究,並用於取代傳統會揮 發的有機溶劑,以達到安全與環保的目的。

本實驗嘗試以具親和性的染料剛果紅(Congo Red)將其應用於疏

水性離子液體[Bmim][PF6]中,以液相/液相萃取的方式來萃取牛血清

蛋白,並藉由銀離子交換法合成[Bmim]2[Congo Red] ,並將其成功

溶於[Bmim][PF6]中,並以此系統對牛血清蛋白作萃取,在 pH 為 4.0 時正向萃取率可達近 100%,並藉由調控 pH 值與鹽類濃度,得知靜 電力也為親和性染料能吸引蛋白質的其中一項因素,選用較為溫和的 pH 值,在不破壞系統的穩定性之下,以 pH9.0 並添加 1.0M 的 NaSCN 其蛋白質總回收率約為50%。 另外本實驗也嘗試萃取其他蛋白質,以近一步探討本系統對蛋白

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質間的作用力,在pH 為 7.0 時,加入萃取劑[Bmim]2[Congo Red]對牛 血清蛋白萃取則無萃取率,而在 pH 為 4.0 或 7.0 萃取核醣核酸酶 A 時,萃取劑的加入與否對萃取率的影響並不顯著,最後在 pH 為 4.0 或7.0 萃取溶菌酶,結果顯示萃取劑的加入對蛋白質萃取率有顯著提 升,綜合以上得知本系統與蛋白質間必須要同時有靜電力與親和力, 才會有較好的萃取率。 由於染料配體數量眾多,本實驗期望為離子液體液相/液相萃取 蛋白質技術提供一個新的選擇與發展。

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Application of affinity dye congo red in ionic liquid for protein extraction Student:Wen-Yuen Hsieh Advisor: Tiing Yu

Institute of Applied Chemistry National Chiao Tung University

Abstract

Owing to the special physical and chemical properties, such as non-volatility, minimal toxicity, high thermal stability, good conductivity and recyclability, room temperature ionic liquids (RTILs) have attracted wide research interests. Replacement of traditional volatile organic solvents with RTILs may potentially achieve environmental safety and protection goals.

In this study, we try to dissolve the affinity dye Congo Red in

hydrophobic ionic liquid [Bmim][PF6] and apply this solution for

liquid/liquid extractions of Bovine Serum Albumin (BSA) from aqueous solutions. During the extraction, Congo Red is easily dissolved into the aqueous solution. Thus this solution is inadequate for protein extraction. We then apply a simple ion exchange method to synthesis

[Bmim]2[Congo Red] and dissolve it in [Bmim][PF6] to form aa

extraction soluteion. The forward extraction efficiency (from the aqueous solution to the RTIL phase) reached almost 100 % while the aqueous solution was at pH 4.0. Protein molecules can be extracted back to another aqueous solution by manipulating the pH and the ionic strength. Under pH 9.0 and 1.0 M NaSCN, the back extraction reached 50%.

(5)

In addition, other proteins are extracted using this solution in order to examine the selectivity of this affinity compound. Under pH 7.0,

negligible extraction of BSA is found. Addition with [Bmim]2[Congo Red]

to the IL does not significantly improve extraction of Ribonuclese A at either pH 4.0 or 7.0. As for lysozyme, addition of extractant

[Bmim]2[Congo Red] helps promote extraction under pH 4.0 and 7.0. In

addition to the affinity of the dye to proteins, the electrostatic force between the dye and the protein is found to influence the extraction.

(6)

謝誌

兩年的研究生生活要告一個段落了,期間的努力與成長

相信都會是我未來成功的基石。首先要感謝的是恩師余艇在

學業與實驗上的指導,使我對分析化學的領域有了更深一層

的認識。另外也感謝謝有容老師與凌永健老師在百忙之中能

抽空前來參加口試,使論文更臻於完整。

再來要感謝的是實驗室成員在實驗與生活上的幫忙,大

師姐淑慧,祝你實驗順利並能早日畢業,感謝經緯學長在儀

器使用方法上的協助,超可愛學弟妹 之 有聊帥氣撲克牌魔

術很有梗的印從 與 用頭撞球大美女琬茹;祝你們與淑鈴都

能在未來找到明確的實驗方向。感謝大學同學政勳、之誠與

盧叔等人常一起出去吃飯並分享研究生的生活;同在新竹的

高中同學家豪常一起打球,有你們的陪伴使我的研究生生活

更添歡笑。

最後感謝我的父母家人做我背後的最大支柱,使我能更

順利的往前衝。謝謝大家!!與你們一起分享我畢業的喜悅。

(7)

總目錄 中文摘要………I 英文摘要………..III 謝誌………..V 總目錄………..VI 圖目錄………..X 表目錄………...…XIII 第一章 緒論………..1 1-1 前言……….1 1-2 研究動機……….2 第二章 研究背景與理論………..4 2-1 離子液體的介紹………4 2-1-1 離子液體的定義………4 2-1-2 離子液體的發展………6 2-1-3 離子液體的物理及化學性質………7 2-1-4 離子液體的應用………..11 2-2 蛋白質萃取方法………..13 2-2-1 雙水相溶劑系統………..13 2-2-2 反微胞萃取法……….13

(8)

2-2-3 親和層析法………..16 2-3 染料配體(dye-ligands)的介紹與其應用………..17 2-3-1 染料配體簡介………..17 2-3-2 染料配體的應用………...20 2-4 蛋白質簡介………22 2-4-1 蛋白質的組成與結構………...22 2-4-2 牛血清蛋白簡介………..22 第三章 實驗部份………..22 3-1 試藥………..24

3-1-1 合成 [Bmim][Cl]、[Bmim][PF6]與[Bmim]2[Congo Red] 之藥 品………..24 3-1-2 配製緩衝溶液之試劑………...25 3-1-3 蛋白質分子……….26 3-2 儀器……….26 3-3 實驗流程……….27 3-3-1 離子液體之合成……….27 3-3-1-1 合成離子液體[Bmim][Cl]與[Bmim][PF6]………...27

3-3-1-2 合成 [Bmim]2[Congo Red]………..30

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3-3-3 蛋白質定量方式……….31 3-3-4 製備液相/液相萃取系統及萃取牛血清蛋白………32 3-3-4-1 以親和性染料剛果紅為萃取劑萃取牛血清蛋白…………32 3-3-4-1-1 配置萃取相………..32 3-3-4-1-2 萃取牛血清蛋白………..33 3-3-4-1-3 萃取時間對萃取效率的影響………..33 3-3-4-1-4 pH 值對蛋白質萃取的效應………33 3-3-4-2 以 [Bmim]2[Congo Red]作為萃取劑萃取牛血清蛋白….34 3-3-4-2-1 配置萃取相………..34 3-3-4-2-2 萃取牛血清蛋白………..35 3-3-4-2-3 攪拌時間對萃取率的影響………..36 3-3-4-2-4 pH 值及離子強度對萃取率影響………36 3-3-4-2-5 萃取其他蛋白質水溶液………..37 第四章 結果與討論………..39 4-1 離子液體的合成………..39 4-2 製備液相/液相萃取系統……….46 4-2-1 以親和性染料剛果紅為萃取劑……….46

4-2-2 以[Bmim]2[Congo Red]為萃取劑………..48

(10)

4-3-1 萃取劑濃度對牛血清蛋白萃取的影響……….52

4-3-1-1 以親和性染料剛果紅為萃取劑萃取牛血清蛋白………52

4-3-1-2 以[Bmim]2[Congo Red]為萃取劑萃取牛血清蛋白…….54

4-3-2 比較萃取時間對萃取率的影響………56

4-3-2-1 Congo Red/IL 系統中攪拌時間對萃取率的影響………..56

4-3-2-2 [Bmim]2[Congo Red]/IL 系統中攪拌時間對萃取率的影響... ………57 4-4 pH 值對蛋白質萃取的效應………..58 4-5 離子強度對蛋白質萃取的效應………63 4-6 分別萃取其他蛋白質水溶液………66 第五章 結論………69 參考文獻………70

(11)

圖目錄

第二章 圖2-1 常見離子液體的陽離子………5 圖2-2 離子液體合成步驟………6 圖2-3 常見離子液體陰離子之改變與疏水性變化………..10 圖 2-4 親和層析法示意圖………..17 圖 2-5 常見的染料配體………..18 圖 2-6 剛果紅結構式……….19 第三章 圖 3-1 [Bmim][PF6]的合成示意圖……….29 第四章 圖 4-1 [Bmim][PF6]之 NMR 圖譜………..41

圖 4-2 [Bmim]2[Congo Red] Mass 圖譜……….42

圖 4-3 [Bmim]2[Cl] NMR 圖譜………...43

圖 4-4 [Bmim]2[Congo Red] NMR 圖譜………44

圖 4-5 [Bmim]2[Congo Red]之 DSC 圖譜………..45

(12)

圖 4-7 剛果紅在水相及[Bmim][PF6]中的 UV-visible 吸收光譜圖…47

圖 4-8 [Bmim]2[Congo Red]在 [Bmim][PF6]中的 UV-visible 吸收光譜

圖………..49

圖 4-9 [Bmim]2[Congo Red]的校正曲線圖………...50

圖 4-10 蛋白質萃取過程示意圖………51 圖 4-11 加入不同量剛果紅進入萃取相對不同濃度的牛血清蛋白水溶 液進行正向萃取的結果………53

圖 4-12 [Bmim]2[Congo Red]/IL 系統中不同萃取劑濃度對萃取率的影

響………55 圖 4-13 Congo Red/IL 系統中攪拌時間對萃取率的影響………56

圖 4-14 [Bmim]2[Congo Red]/IL 系統中反應時間對萃取率的影響…57

圖 4-15 Congo Red/IL 系統中不同 pH 值對牛血清蛋白水溶液的正向 萃取效率………59

圖 4-16 [Bmim]2[Congo Red]/IL 系統中不同 pH 值對牛血清蛋白水溶

液的正向萃取效率………60 圖 4-17 Congo Red/IL 系統中不同 pH 值的緩衝溶液的反向萃取結果 ………61

圖 4-18 [Bmim]2[Congo Red]/IL 系統中不同 pH 值對牛血清蛋白水溶

液的反向萃取結果………62

(13)

對牛血清蛋白水溶液的反向萃取效結果………64

圖 4-20 [Bmim]2[Congo Red]/IL 系統中加入鹽類 NaSCN 的濃度對牛

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表目錄

第二章 表 2-1 不同種類氯化物之熔點……….4 表 2-2 咪唑鹽類的離子液體熔點……….8 表 2-3 數種 RTILs 的物理及化學性質……….9 表 2-4 染料分子在親和層析上的應用………20 表 2-5 加入金屬離子後的染料分子對不同蛋白質之純化…………21 第四章 表4-1 [Bmim]2[Congo Red]在萃取相中清洗前後濃度的比較…….50

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第一章 緒論

1-1 前言 在分離化合物的過程中,液相/液相萃取是一種常被用來分離化 合物的技術,溶劑的選擇一般是使用有機溶劑和水溶液形成不互溶的 兩相,再藉由欲分離的化合物在兩相之間分佈上的不同,而達到分離 的目的,但一般傳統上對於有機溶劑的選擇,使得萃取的過程中因為 使用大量易燃、有毒、高揮發性的有機溶劑,造成實驗人員在操作上 許多安全性的考量及限制,另外,產生的有機廢棄物更造成了環境上 的污染,使用過後還需依環保法規妥善處裡等等,在處於環保意識高 漲、永續生存發展概念興起及綠色觀念推廣的現今,尋找降低對環境 負擔或設計較安全的分離溶劑來取代危險物質的使用是迫切需要的 課題。

室溫離子液體(Room Temperature Ionic Liquids,RTILs)是一種在 室溫下為液體的有機熔融鹽類,其以離子的型態所組成。可藉由陰離 子和陽離子種類上的改變,以調控它們的疏水性、親水性和黏度等性 質,因其具有低蒸氣壓、良好的熱穩定性、不可燃性、可 溶 解 有 機

或 無 機 物 質 1等獨特特質,與傳統的有機溶劑相較之下,確實是大

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種符合環保概念的「綠色溶劑」2。 近年來,離子液體的在化學方面上的研究已知被應用在萃取3、 電化學4、催化反應5,6,7、有機合成5,6,8及高溫氣體感測器9等領域。 隨著離子液體的研究發展愈來愈廣泛,使其在綠色化學上顯得更為重 要。 1-2 研究動機 離子液體應用在液相/液相萃取的研究非常廣泛,已有研究發現 在較低pH值的環境下,胺基酸會從水層中被萃取進離子液體相10,也 有文獻指出可直接利用離子液體萃取DNA(dsDNA)11,或利用在含有 羥基(hydroxyl-group)的疏水性離子液體中添加皇冠醚類(crown ethers) 作修飾,來將蛋白質細胞色素c (cytochrome c)從水溶液中萃取到離子 液體層12。本實驗室也曾利用離子液體1-butyl-3-methylimidazolium

hexafluorophosphate ([Bmim][PF6])當作萃取劑13,在[Bmim][PF6]中加

入乙酸乙酯(ethyl acetate)和水之後可形成兩相系統,調控水樣品之pH 值,可以影響蛋白質表面所帶電荷數目,再藉由蛋白質和離子液體間 的靜電吸引力,可以達到萃取目的。但此實驗必須在強酸條件之下才 有較好的萃取效果,對蛋白質活性會造成影響,另外本實驗室也曾將

(17)

中的溶解度,並對於萃取溶菌酶具有良好的回收率14,15。

由於親和性染料剛果紅和蛋白質牛血清蛋白(BSA)之間具有親和

作用力16,能提高在萃取蛋白質上的選擇性。因此本實驗將剛果紅應

用於離子液體[Bmim][PF6]中,並合成[Bmim]2[Congo Red]當作萃取劑

溶於離子液體[Bmim][PF6],和蛋白質水溶液形成兩相,利用液相/液

相萃取將蛋白質萃取到離子液體相中,期望拓展離子液體在液相/液 相萃取方面的應用,並符合環保、安全的目的。

(18)

第二章 研究背景與理論

2-1 離子液體的介紹 2-1-1 離子液體的定義 離子液體是由陰離子和陽離子所構成的有機熔融鹽類,和無機鹽 類(如氯化鈉)的主要差異在於離子液體的陽離子為不對稱有機離 子,且陰陽離子在大小或形狀上差異甚大,無法形成整齊的晶格排列 所以熔點較一般無機鹽類降低許多24,如表2-16,一般將熔點低於

100℃ 的 熔 融 鹽 類 稱 為 室 溫 離 子 液 體 (Room Temperature Ionic Liquids,RTILs),簡稱離子液體(ILs)。

(19)

離子液體可經由特定陰離子和陽離子,透過不同組合方式可高達 一兆種,常見陽離子如圖2-16,改變陰離子與陽離子的組成,可得到 具有不同性質的離子液體。因此離子液體又被稱作是「具設計性的溶 劑」(designer solvent)。一般常見的離子液體陰離子有 bis[(trifloromethyl)sulfonyl]amide [(CF3SO2)2N]-、ethanoate(CH3CO2-)、

halide(Br-,Cl-,I-)、hexafluorophosphate(PF6-)、tetrafluoroborate(BF4-)、

trifluoroethanoate(CF3CO2-)、及trifluoromethylsulfonate(CF3SO3-)。

圖2- 1 常見離子液體的陽離子6

不同形式的離子液體在物性和化性上有相當大的差異,其基本的

合成實驗流程如圖2-28,這些合成的步驟都不算難,經過簡單的合成

(20)

圖 2- 2 離子液體合成步驟8 2-1-2 離子液體的發展 第一個被發現的離子液體是 ethylammonium nitrate ([EtNH3]NO3) ,在 1914 年時被合成出來26,然而,其本身容易潮解, 無法在普通環境下安定存在,所以在其後數十年離子液體的發展並未 有重大突破,之後在1951 年時 Hurley 發展出有機鋁離子液體

N-ethylpyridinium bromide- aluminium chloride ([EtPy]Br-AlCl3),並拿

來當作電鍍鋁的浸漬液17,到了1970 年代 Osteryoung 和 Wilkes 成功

製備出一系列氯化鋁陰離子的融鹽(chloroaluminate melts)18,開啟了

(21)

出來。直到1992 年,Wilkes 研究團隊將 AgBF4加入[Emim][I]反應後, 發展出咪唑(imidazolium)型陽離子所組成的離子液體 [Emim][BF4]19,這種離子液體在空氣及水中都相當安定,使得由此類 陽離子所組成的離子液體在應用方面引起重視20,而往後所發展的離 子液體也皆以此種類為主,近二十年來離子液體的相關文獻逐年快速 成長,所以離子液體也被稱為二十一世紀新興的有機溶劑。 2-1-3 離子液體的物理及化學性質 離子液體是離子態的有機鹽類,具有熔點低、蒸氣壓極低、不 可燃性、可設計性、寬廣的電化學電位窗口(potential window)、良好 的導電與導熱性、範圍很廣的黏性與工作範圍(亦即熔點、沸點差異 大)、並可與不同類型的化合物進行媒合作用(solvation interaction) 等特殊性質,使得離子液體應用範圍非常廣泛。 在應用離子液體時,熔點是一個很重要的參考指標,而離子液體 的熔點受陽離子的對稱性影響很大,對稱性差會使得晶體無法整齊的 排列,而造成熔點下降,若分子間有氫鍵作用力則會使熔點增高。另 外,陰離子的種類也會影響熔點,一般來說,陰離子團愈大則晶格愈 無法整齊排列,而造成熔點愈低。常 用 咪 唑 鹽 類(imidazolium)的 離 子 液 體 熔 點 , 如 表2-27。

(22)

表 2-2 咪 唑 鹽 類 的 離 子 液 體 熔 點 7

離子液體的性質會隨著陽離子和陰離子形式而有所不同,若單純 改變陽離子上烷基的碳鏈長度可影響有機物在離子液體中的溶解

度,例如 1-octene 對於不同的 tri-n-alkylmethylammonium tosylate

melts,其溶解度隨著 n 變大而增加76;另外在利用冠狀醚(crown ether)

萃取鹼金屬到 1-alkyl-3-methyl-imidazolium hexafluorophosphate 時,

其萃取效果會隨著烷基碳鏈長度愈長而愈好74。離子液體的密度與陽

離子團的大小較有關,一般來說,陽離子團愈大,密度相對減小,而

離 子 液 體 的 密 度 範 圍 則 在 1.0 到 1.6 g/cm3之 間 1;至於離子液體

(23)

強弱而定,當陽離子上碳鏈越長則凡得瓦耳力越大,造成黏度越大, 而在陽離子相同情況下,不 同 陰 離 子 的 離 子 液 體 其 黏 度 順 序 如 下 Cl->PF6->BF4->NO3->(CF3SO3)2N-22。 ;離子液體的熔點則與陰離 子團大小、陽離子的對稱性有關6,21。 ILs Melting Point (0C) Density (g/mL) Viscosity (mPas) Water solubility (g/100mL) [C4mim][PF6] 10,-8 1.36(250C) 148(250C) 1.88 [C6mim][PF6] -61 1.29(250C) 560(250C) 0.75 [C8mim][PF6] 1.20(250C) 682(250C) 0.20 [Cmim][(CF3SO2)2N] 22 1.56 44 [C2mim][(CF3SO2)2N] -3 1.50 34 1.77 [C4mim][(CF3SO2)2N] -4 1.42 52 0.80 [C6mim][(CF3SO2)2N] 1.33 0.34 [C8mim][(CF3SO2)2N] 1.31 0.21 [C4mim][Cl] 65 1.10(250C) Miscible [C2mim][BF4] 15 1.28(250C) 37(250C) Miscible [C4mim][BF4] -81 1.21(250C) 180(250C) Miscible [C6mim][BF4] 314(200C) Miscible [C4mim][CF3SO3] 16 1.29 90(200C) Miscible 表 2- 3 數種 RTILs 的物理及化學性質1。 在親水性方面,[Bmim][Cl]這種離子液體可與水以任何比例互 溶,具有相當的親水性,若將陰離子置換成[PF6]-,形成的離子液體 [Bmim][PF6]則具有相當的疏水性,研究結果顯示,離子液體的陰離 子主要決定與水的互溶性,但陽離子則會影響疏水性的程度,陽離子 上的烷基碳鏈越長會造成離子液體疏水性越強22,23, 圖2-4 表示常見 離子液體之陰離子對其在水中溶解度的影響1。

(24)

圖2- 3 常見離子液體陰離子之改變與疏水性變化 24

化學家利用empirical solvent polarity scales 此種方式可初步顯示

大部分的離子液體擁有與與短碳鏈醇類相似的極性22,25。由於單純使

用極性來解釋離子液體的特性,並無法解釋為何不同組合的陰陽離子

所構成的離子液體,會表現出不同的行為5,25,27,於是便有學者試著

用Abraham 提出的“溶劑化參數模型”(solvation parameter model)28,來

表示離子液體和溶質之間的作用力28,在這個model 裡,考慮到了每 一種媒合作用力的參數,其方程式如下: ln k = c + rR2 + sπ2H + aα2H + bβ2H +l logL r、s

a

b

l 分別代表離子液體和溶質π電子和非鍵結電子之間 作用的能力、離子液體的偶極矩(dipolarity)或極化程度 (polarizability)、氫鍵鹼度(hydrogen-bond basicity,接受氫鍵的能 力)、氫鍵酸度(hydrogen-bond acidity,提供氫鍵的能力)、分散力 (dispersion forces)。藉由個別的作用力參數,可以較為成功地描述

(25)

離子液體的特性,有助於了解離子液體的結構與其性質之間的關聯 性,以期將離子液體應用在不同的領域。 近年來,一些具有特殊功能性的離子液體也陸續被合成出來,例 如: 利用胺基酸作為陰離子的離子液體29以及含DNA離子液體等等 30。也有文獻提出帶有金屬磁性的離子液體31,他們推測此種物質為 非固體亦非液體的狀態,若進一步獲得證實,此種新物質狀態可能推 翻一般所認為的物質三態。 2-1-4 離子液體的應用 離子液體是由離子鍵所形成的化合物,大部分的離子液體都具有 不錯的導電度及寬廣的電位窗(potential window) ,可將其應用在電化 學領域,[C3H7(CH3)3N][(CF3SO2)2N]用玻璃碳電極掃引時其電位窗可 達5.7 V4,算是具有相當寬廣的電位窗。 離子液體具有高黏度、高熱穩定性、對化合物有多種作用力及容 易填充在管柱中等作為GC 靜相所需的條件 26,32,具有可分離極性與 非極性物質的雙重性質(dual-nature)32,33;選擇適當的離子液體作靜

相,甚至可有效分離acetylated amines 、chiral alcohols、chiral

epoxides、chiral sulfoxides 等鏡像異構物34,35。應用於質譜方面,離子

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白質和高分子等優點,使其可用來作為MALDI 的基質,以提升離子

化的效果。利用傳統MALDI 基質 CHCA(α-cyano-4-hydroxycinnamic

acid))形成的離子液體,可有效提高訊號強度、降低偵測極限 36。有

機合成方面,離子液體具有提高有機反應選擇性和產率的特性,以及 可與催化劑形成共催化劑,增加催化的活性、選擇性與穩定性等特 點,例如將離子液體作為兩相催化系統(biphasic catalysis system)中

的有機層,在離子液體中進行Diels-Alder 反應,可選擇性地反應生 成endo 產物,再把催化劑從離子液體中回收,可繼續進行催化5。 離子液體可藉由陰離子的改變而調整成其疏水性,在液相/液相 萃取佔有很大優勢。在離子液體中加入冠醚類(crown ether)分子作為 萃取劑,萃取重金屬離子 37、胺基酸 40以及蛋白質細胞色素 c12,39;也 有研究直接在陽離子上修飾上硫醚、硫脲等官能基,形成帶有特定功 能 的 離 子 液 體 來 萃 取 Hg2+、Cd2+41, 這 類 的 離 子 液 體 又 稱 為 task-specific ILs。用離子液體當介質,可將奈米金和奈米棒從水相轉 移到離子液體相42。 離子液體的應用已是綠色化學研究的一環,其多樣的性質與廣泛 的應用範圍再加上環保意識的覺醒,使得近年來各界關於離子液體的 研究與日俱增,在未來具有良好的發展性。

(27)

2-2 蛋白質萃取方法 2-2-1 雙水相溶劑系統 雙水相溶劑系統是瑞典的 Albertson 於 1958 年所提出43,在水溶 液中加入兩種物化性質相異之高分子聚合物(如:polyethylene glycol、Dextran)或鹽類(如:磷酸鹽、檸檬酸鹽),這些不同性質之 大分子分別與水分子產生交互作用力而形成兩相。利用化合物與兩水 相分子間不同作用力產生分配(partition)行為而達純化分離的效果。 化合物分子在兩相的分配情形受許多因素所影響,主要包括緩衝液濃 度44,45、溶液酸鹼值46、溫度 45高分子聚合物種類 44等。 雙水相溶劑系統因操作方法簡單、所需成本低廉、操作條件溫 和、分離步驟少、生物分子活性保存佳,且不需使用有機溶劑,所以 廣泛的被應用在蛋白質、核酸等生物分子的萃取分離及純化上44;另 外也曾在逆流層析儀(countercurrent chromatography) 中使用,進行製 備型的分離47,48。 2-2-2 反微胞萃取法 所謂反微胞萃取法,是利用界面活性劑溶於有機溶劑後形成疏水 基團朝外,親水端朝內的反微胞,為一個可包圍水分子的團狀結構,

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中央形成水核,再藉由反微胞將溶於水溶液中極性大的分子萃取至有 機溶劑中,然後再反萃取至另一水溶液中,以達到分離純化的目的; 反微胞萃取法具有分離大量樣品的能力外及分離後能保有生物分子 的活性,使其備受矚目,因此已有文獻發表利用反微胞萃取法來分離 蛋白質49,50或胺基酸51,52。 萃取物在水相及反微胞的分佈,會受到水溶液的狀態所影響,如 pH 值、離子種類、或離子強度(ionic strength)。此外,萃取物的性 質,或是萃取時的溫度,亦會影響反微胞萃取的效率。 (1)pH 值 水溶液的pH 值會影響蛋白質表面的電荷分佈(charge distribution

over the protein surface),而蛋白質表面電荷與界面活性劑親水基之間

的靜電作用力(electrostatic interactions)決定了反微胞萃取法的效率。

使用陰離子型界面活性劑萃取蛋白質,水溶液的pH 值需要小於蛋白

質的等電點(isoelectric point, pI)53;反之,使用陽離子型界面活性

劑,水溶液 pH 值則需要大於蛋白質等電點54。若使用非離子型的界

面活性劑,靜電作用力的影響便不大,一般認為是水溶性分子疏水基 部分和界面活性劑上的疏水基之間產生凡得瓦爾作用力,而達到萃取

(29)

57,因此適合用在生物分子上。另外當蛋白質處於過酸或過鹼的水溶

液中,會使蛋白質變性(denaturation),造成反微胞萃取上的困難49,

並且導致蛋白質的活性喪失。

(2)離子種類及離子強度

當水溶液的離子強度增加時,界面活性劑親水基與蛋白質表面之 間產生遮蔽效應(Debye screening effect),造成蛋白質與界面活性劑 間的靜電作用力降低,並且會產生水核較小的反微胞,因此降低反微 胞萃取的效率58,59。但是當水溶液中的離子強度過低時,界面活性劑、 水溶液及有機溶劑就會產生乳化態(microemulsion)而無法分層,導致 反微胞無法形成,並且水溶液及有機溶劑無法分離,造成反微胞萃取 上的困難,因此鹽類濃度必須控制在一定範圍內,方能有良好的萃取 效果。另外不同離子種類所造成的影響亦有所差異,當離子半徑相同 時,其電荷越大,則遮蔽效應越強;當離子的電荷相同時,離子半徑 越大,則遮蔽效應越明顯60。離子強度增加會造成正向萃取率下降, 但是卻會造成反向萃取效率增加,另外也有文獻提出鹽類 NaSCN 在 對牛血清蛋白進行脫附時,陰離子 SCN-除了本身帶負電而能產生遮 蔽效應外,其 SCN-的結構還能有效與牛血清蛋白產生作用 38,以提 升脫附的效率。

(30)

2-2-3 親和層析法61(affinity chromatography) 親和層析也稱為選擇性層析(selective chromatography),常用於 純化蛋白質,簡單的示意圖如圖2-462,方法是將欲分離物的substrate 接在固體支持物上,再用此支持物填裝管柱,當含有欲分離物的樣品 溶液通過管柱時,欲分離物會被吸附在管柱上,其它的蛋白質及雜質 不被吸附,全部從層析柱流出,最後使用適當的緩衝溶液,將欲分離 物從管柱中沖提出來,通常採用改變 pH 值、離子強度或緩衝液的組 成,使其親和力降低,或用較高濃度的配體溶液亦可將管柱上所吸附 的物質洗出,此配體可以與管柱上的相同或相異;經過以上這些處理 步驟便能得到純化的欲分離物。而所謂的親和力,乃是指生物大分子 和其配體(ligand)之間形成可逆結合的能力,如抗體和抗原、酵素

和它的受質(substrate)、RNA 和其互補的 DNA、激素和受體(receptor)

63

等,親和層析就是根據這種親和力發展出來的純化方法,另外,親 和層析也可在管住內嵌合住金屬離子,形成固定化金屬親和層析法,

(31)

圖 2- 4 親和層析法示意圖 62 2-3 染料配體(dye-ligands)的介紹與應用 2-3-1 染料配體簡介 染料配體應用在親和層析上具有穩定、合成容易、純化步驟簡 單、價格低廉、活性部位可輕易和管柱填充物反應而固定於管柱上等 優點,因此常用來取代天然配體純化生物分子。這種染料原先是用在 紡織業上的染色,和棉質布料間可形成共價鍵,因意外發現Blue dextran和特定的激酶(kinase)之間會產生作用力結合66。在1972年, Roschlau和Hess首次將Cibacron Blue這種藍色染料利用共價鍵固定到

層析管柱中的Sephadex G-200上,純化yeast pyruvate kinase67。自此之

(32)

常見的染料配體及其結構如圖2-5,而本實驗所選擇的染料配體 是剛果紅,其結構如圖2-6。

Cibacron Blue F3G-A(CB3GA)

(33)

Procion red H-E3B

圖 2-5 常見的染料配體

(34)

剛果紅已知被應用及親和管柱層析,並可進行多種酵素與蛋白質的分 離純化68,69。 2-3-2 染料配體的應用 染料配體最早曾被應用在親和層析70,71或雙水相系統72,而使用 染料作為親和力配體,其優勢在於價格便宜,取得方便,選擇多樣73, 利由不同管柱基質作探討,而不同的染料分子可用來純化不同的蛋白 質,如下頁表2-4 所示61。也有研究另外加入金屬離子,幫助吸附蛋 白質,如表2-562。 Enzyme Dye

Glycerol kinase Procion Blue MX-3G

Glucose kinase Procion Brown H-3R

Glycerol dehydrogenase Procion Red HE-3B

3-Hydroxybutyrate

dehydrogenase Procion Blue MX-4G

Malate dehydrogenase Procion Red H-3B

Tryptophanyl tRNA synthetase Procion Brown MX-5BR

Human serum albumin Procion Blue HB

Carboxypetidase G2 Procion Red H-8BN

(35)

Protein Promoting

metal ion Dye

Carboxypetidase G2 Zn2+ Procion Red H-8BN

Alkaline phosphatase Zn2+ Procion Yellow H-A

Hexokinase Mg2+ Procion Green H-4G

Tyrosinase

d h d Cu

2+ Procion Blue HE-RD

Ovalbumin Al3+ Cibacron Blue F3GA

Catalase Fe3+ Cibacron Blue F3GA

Fe3+ Congo Red

Albumin Cu2+ Congo Red

Zn2+ Cibacron Blue F3GA

Glucose oxidase Fe3+ Cibacron Blue F3GA

Lysozyme Cu2+ Cibacron Blue F3GA

表2- 5 加入金屬離子後的染料分子對不同蛋白質之純化62 染料上的磺酸基pKa 值低於零,在 pH1~14 都帶負電。大部分的 染料配體上都帶有磺酸基,而精胺酸是所有胺基酸中pKa 值最高。 因此推測精氨酸-磺酸基(arginine-sulfonate)這種特定的靜電作用力能 促進染料和蛋白質的結合。靜電吸引力也在此被歸為染料-蛋白質作 用力主要因素,另外染料分子結構類似生物配體,便可和特定蛋白質 的活性部位專一性結合,其他如蛋白質疏水性和氫鍵作用力則為次要 因素。染料配體價格便宜且穩定,因此已許多研究將其固定在不同材 料純化不同蛋白質。

(36)

2-4 蛋白質簡介 2-4-1 蛋白質的組成與結構 蛋白質的基本組成為胺基酸,相鄰胺基酸之間藉由氨基與羧基進 行脫水反應之後以線性排列的方式形成胜肽鍵(peptide bond),再經雙 硫鍵與非共價鍵的作用力結合,形成立體結構的蛋白質,不同的蛋白 質除了組成的胺基酸種類與數量不同外,不同的胺基酸排列順序也造 成這些蛋白質在結構上的差異。蛋白質的二級結構(secondary

structure)、三級結構(tertiary structure)、四級結構(quaternary structure) 決定了蛋白質特殊的立體空間結構,由於這些不同構形(conformation) 的差異,使得蛋白質具有特殊的生理活性。

2-4-2 牛血清蛋白 (Bovine Serum Albumin)簡介

牛血清蛋白為牛血清中的簡單蛋白,是血液的主要成分

(38g/100ml),分子量 63kD。 等電點 4.6。 含氮量 16%,含糖量 0.08%,僅含己糖和己糖胺,含脂量只有 0.2%。蛋白由 581 個胺基酸

殘基组成,其中 35 個半胱氨酸组成 17 個雙硫鍵。牛血清蛋白可與多

(37)

維持滲透壓作用、pH 緩衝作用、載體作用和營養作用。在動物細胞 無血清培養中,添加白蛋白可起到生理和機械保護作用和載體作用。

(38)

第三章 實驗部份

3-1 試藥

3-1-1 合成[Bmim][Cl]、[Bmim][PF6]與[Bmim]2[Congo Red]

之藥品

1-chlorobutane, C4H9Cl, 99 %, GR grade (Janssen Chimica, USA)

1-methylimidazole, C4H6N2, 99 %, GRgrade (Acros, USA)

Ethyl Acetate,CH3COOC2H5,HPLC/spectro grade(Mallinckrodt, USA)

Potassium hexafluorophosphate, KPF6, 99 %, GR grade (Showa, Japan)

Magnesium sulfate anhydrous, MgSO4, 99 %, GR grade (Showa, Japan)

Congo Red , C32H22N6Na2O6S2, 85% (Sigma, USA)

Silver nitrate, AgNO3, GR grade, 99.8 % (Showa, Japan)

(39)

3-1-2 配製緩衝溶液之試劑

Hydrochloric Acid, HCl, GR grade (Showa, Japan)

Potassium chloride, KCl, GR grade (Scharlau,Barcelona, Spain)

Glycine, C2H5NO2, GR grade (Riedel-de Haën, Germany)

Acetic Acid, CH3COOH, analytical grade (Scharlau, Barcelona,Japan)

Sodium acetate, CH3COONa, 98.5 %, GR grade (Showa, Japan)

Sodium dihydrogenphosphate anhydrous, NaH2PO4, 98.0 %, GR grade

(Showa, Japan)

Potassium dihydrogenphosphate, KH2PO4, 99%, GR grade, (Showa,

Japan)

Tris(hydroxymethyl) aminomethane, (HOCH2)3CNH2, ACS grade

(TEDIA, USA)

Sodium hydrogen carbonate, NaHCO3, 99.5 %, GR grade (Showa, Japan)

Sodium hydroxide, NaOH, 96 %, GR grade (Showa, Japan)

Citric acid,100 %, HOC(COOH)(CH2COOH) 2 (Anhydrous,

powder),ACS grade(Mallinckrodt Baker, Phillipsburg, NJ, USA)

Sodium citrate,99.6 %, HOC(COONa)(CH2COONa) 2、2H2O, ACS

grade(Mallinckrodt Baker, Phillipsburg, NJ, USA)

Sodium chloride, NaCl, 99.6%,GR grade(Scharlau, Barcelona,Spain) Sodium Thiocynate,NaSCN,99%,(Hanawa,Japan)

D.I.W.去離子水,經由 Millipore (Bedford MA ,USA)的 Milli-Q plus 處 理

(40)

3-1-3 蛋白質分子

Bovine serum albumin (牛血清蛋白),簡稱 BSA,M.W. : 63000,98%, pI : 4.6,(Sigma,USA),

Ribonuclease A from Bovine Pancreas, M.W.13700 pI=9.45 (Sigma,, USA)

Lysozyme (溶菌酶) from chicken egg white,M.W. : 14400,97%, pI : 10.7,(Sigma,USA)

3-2 儀器

(1)紫外光-可見光光譜儀 UV-Visible Spectrophotometer, Hewlett Packard 8453(Waldronn, Germany)

(2)高效能液相層析管柱(reversed-phase HPLC column): Vercopak Inertsil 7 octadecyl silica-3 (ODS-3), (建宏層析,台北)

管柱尺寸為4.6×250 mm,孔徑大小為 10 µm,用於蛋白質的分

析與定量。

(3)梯度幫浦(Gradient Pump): Degasys DG 2410, (Lab Alliance, USA)

結合Series Ⅲ pump,最多可做四種動相組成的梯度混合。

(4)核磁共振儀(Nuclear Magnetic Resonance, NMR): DRX-300, (Bruker, Germany); Uniytinova-500, (Varian, USA)

(41)

(6)離心機(Centrifuges): EBA20, (Hettich, Germany)

最大轉速6000 rpm,最大離心力為 3421 g

(7)電子天秤(Electronic Balance): Bruker Daltonic Esuire 2000, (Leipzig, Germany)

(8)質譜儀(Mass Spectrometer): Quattro Micro, (Waters,USA) (9)微差掃描卡計(Differential Scanning Calorimetry, DSC):

使用Du Pont TA 2000 及 Computer/Thermal Analyzer。

3-3 實驗流程

3-3-1 合成離子液體[Bmim][Cl]與[Bmim][PF6]27

1.將 0.9 mole (94.05 ml) 1-chlorobutane 和 0.9 mole (71.7ml)

1-methylimidazole 加入至 250 ml 圓底瓶中,並架設迴流裝置,加熱

至80℃後,持續攪拌約 48 hr,可得一金黃色黏稠液體

1-butyl-3-methylimidazolium chloride ([Bmim][Cl])。

2.將此黏稠液體到入 500ml 分液漏斗中,加入 75 ml 的乙酸乙酯洗去 未反應物,取出下層液於圓底瓶中,並再重覆此步驟一次。 3. 將所得金黃色黏稠狀液體加熱至90℃攪拌一天,去除乙酸乙酯。 4. 取0.9 莫耳 KPF6 加入450 ml 去離子水中,室溫下攪拌至溶解。 5. 將所得金黃色黏稠狀液體加入裝有KPF6溶液的燒杯中,以磁石 攪拌1 小時。

(42)

6..將溶液倒入分液漏斗中,取出水層,再加入少許去離子水,除去水 層,重覆此步驟數次直到水層成中性。

7.取出下層離子液體,加入硫酸鎂除去離子液體層中的水,經重力過

濾後,即可得到1-butyl-3-methyl imidazolium hexafluorophosphate

([Bmim][PF6])。

8.合成示意圖如圖 3-1,最後將產物送測1H-NMR,以鑑定之。

(43)

+

Reflux,

80

0

C 48hr

KPF

6

/H

2

O

r.t. 1hr

Phase separation

PF

6

-Cl

-圖 3-1、[Bmim][PF6]的合成示意圖

(44)

3-3-1-2 合成 [Bmim]2[Congo Red] 1.取 5x10-4 mole (0.3485 g) 剛果紅,溶於 100 ml 去離子水,再加入 5x10-3 mole (0.85 g) AgNO3,室溫下攪拌24 hr。 2.將所得溶液以 6000 rpm 轉速離心 5 min,將水相去除後,以 10 ml 冰水清洗沉澱物,並再重複清洗兩次。 3.將沉澱物置於烘箱,60℃條件下,烘 72hr,可得到暗紅色固體

[Ag]2 [Congo Red]。

4.將步驟 3.所得的[Ag]2 [Congo Red],加入 50 ml 乙晴溶解之,再加入

兩倍莫耳數的[BMIM][Cl],40℃攪拌 72 hr。

5.將所得溶液以 6000 rpm 轉速離心 5 min,去除沉澱物 AgCl,再以旋 轉濃縮機去除乙晴。

7.合成反應式如式 3-1、3-2,產物以 UV-vis 、Mass、DSC 鑑定之。

[Na

2+

][Congo Red

2-

]

(aq)

+ 2AgNO

3 (aq)

2Na

+

(aq)

+ 2NO

3 -

+ [Ag]

2

[Congo Red] (式3-1)

[Ag]

2

[Congo Red]

(ACN)

+ 2[Bmim][Cl]

(l)

(45)

3-3-2 配製緩衝溶液

0.05 M KCl / 0.1 M HCl 調配 pH 範圍 1.0-2.2 0.05M Glycine / 0.1M HCl 調配 pH 範圍 2.3-3.5 (用於 Congo Red/IL 系統)

0.05M Citric acid/0.05M Sodium citrate 調配 pH 3.0

(用於[Bmim]2[Congo Red]/IL 系統)

0.05 M CH3COOH / 0.05 M CH3COONa 調配 pH 範圍 3.6-5.0 0.05 M KH2PO4 / 0.1 M NaOH 調配 pH 範圍 5.8-6.9 0.05 M Tris(hydroxymethyl)-aminomethane / 0.1M HCl 調配 pH 範圍 7.0-9.0 0.05M NaHCO3 / 0.1M NaOH 調配 pH 範圍 9.6-11.0 0.05M Na2HPO4 / 0.1M NaOH 調配 pH 範圍 10.9-12.0 3-3-3 蛋白質定量方式 本實驗將萃取過後的蛋白質水溶液用HPLC 分析,以紫外光 偵測器作為訊號偵測。蛋白質中的胺基酸具有芳香基團,在波長 280 nm 會吸光,所以本實驗選擇 280 nm 光源對蛋白質作定量。 3-3-3-1 利用 HPLC 定量蛋白質水溶液

(46)

HPLC 使平衡 10 分鐘。 2. 注入 20μL 樣品。

3. 以動相 A+B(含有 80 % ACN、 0.1 % TFA 的水溶液),做梯度沖提 並以所得積分面積定量。

3-3-4 製備液相/液相萃取系統及萃取牛血清蛋白

在本實驗中萃取系統分為兩種方式,一種是將親和性染料剛果紅

直接溶入[Bmim][PF6]攪拌作用,使部分剛果紅轉移到離子液體層,

再加入去離子水形成液相/液相萃取系統。另一種方式則是將親和性

染料先合成為離子液體[Bmim]2[Congo Red],在將其作為萃取劑加到

萃取相中。 3-3-4-1 以親和性染料剛果紅為萃取劑萃取牛血清蛋白 3-3-4-1-1 配置萃取相 1. 分別將 5.0 mg、10.0 mg、20.0 mg、30.0 mg 剛果紅粉末加入 10ml[Bmim][PF6]中,在室溫下攪拌 20 分鐘使其溶解,再加入等 體積的去離子水攪拌平衡一天後,將懸浮在[Bmim][PF6]中未溶解 的染料粉末清洗至水層;並移去水相,加入新的去離子水清洗, 重覆步驟兩次。 3-3-4-1-2 萃取牛血清蛋白

(47)

1. 正向萃取:

以50mM CH3COONa/CH3COOH buffer (pH=4), 緩衝溶液配

製2.0*102、5.0*102、1.0*103 mg/L 的牛血清蛋白水溶液,取 1.0 ml 牛血清蛋白水溶液與1.0 ml 的萃取相置於 20 ml 樣品瓶中,在室 溫下攪拌30 分鐘後,靜置分層,取出上層水相以 HPLC 定量。 3-3-4-1-3 比較萃取時間對萃取效率的影響 將等體積pH 4.0 的 2.0*102 mg/L 牛血清蛋白水溶液與萃取相( 將20.0 mg 剛果紅粉末加入 10ml[Bmim][PF6]中,清洗過後)置入 20 ml 樣品瓶中,分別以磁石攪拌1、5、10、20、30、60 分鐘,探討攪拌 時間對蛋白質正向萃取的影響。 3-3-4-1-4 pH 值對蛋白質萃取的效應 1. 配製 pH 範圍 1.0~12.0 的 200 mg/L 牛血清蛋白水溶液 2. 正向萃取: 將 pH 範圍 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、 11.0、12.0 的 2.0*102mg/L 牛血清蛋白水溶液分別取 1.0 ml 與 1.0 ml 配製的萃取相(將 20.0 mg 剛果紅粉末加入 10ml[Bmim][PF6]中,清洗過後)置入 20 ml 樣品瓶中,以磁石攪 拌30 分鐘,混合完靜置分層,取出上層水相以 HPLC 定量。

(48)

3. 反向萃取: 取pH 4.0 的 2.0*102 mg/L 牛血清蛋白水溶液 1.0 ml 與 1.0 ml 的萃取相(將 20.0 mg 剛果紅粉末加入 10ml[Bmim][PF6] 中,清洗過後)置入 20 ml 樣品瓶中,以磁石攪拌 30 分鐘,靜置 分層後,取出下層離子液體相置於另一 20 ml 樣品瓶中,加入等 體積pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0 的緩衝 溶液,置於室溫下攪拌30 分鐘,靜置分層,取出上層水相以 HPLC 定量。

3-3-4-2 以 [Bmim]2[Congo Red]作為萃取劑萃取牛血清蛋白

3-3-4-2-1 配置萃取相

1.分別將 30.0、 50.0、 100.0、 150.0、200.0 mg [Bmim]2[Congo

Red]溶入 10ml 的[Bmim][PF6]中,加入等體積去離子水,長時間

攪拌,使萃取系統能充分與水相平衡,之後移除水相,再加入新 的等體積的去離子水。

2.定量方法:將[Bmim]2[Congo Red]溶於[Bmim][PF6],配製成濃度

分別為 3.0、5.0、10.0、15.0、20.0 mg/ml,各取 20 µl 並加入

(49)

出檢量線。再將步驟 1.平衡過後的萃取相各取 20µl 並加入 3.0 ml 甲醇,測出波長 497nm 吸收值,帶入檢量線後,即可得到萃

取相中[Bmim]2[Congo Red]的濃度。

3.萃取相之 K 值:將步驟 1.配好的濃度為 9.6mM 的萃取系統, 取出上層相體積 20µl 並加入 3.0 ml 甲醇,由紫外光-可見光 光譜儀針對波長 497 nm 測量其吸收值,再取出下層相體積 20µl 並加入 3.0 ml 甲醇,並測量其在波長 497 nm 的吸收值,再將 由上層相得到的吸收值除以由下層相得到的吸收值,即可求出 K 值。 3-3-4-2-2 萃取牛血清蛋白 正向萃取: 將配置好的 2.7、5.3、9.6、15.7、19.7 mM 濃度的萃取相 1.0 ml 分別加入 2.0*102、5.0*102、1.0*103mg/L、pH 4.0 的牛血清蛋白溶液1.0ml,攪拌 30 分鐘,靜置分層,取上 層水溶液做定量。 3-3-4-2-3 攪拌時間對萃取率影響 正向萃取:取含有 9.6mM 濃度的萃取相 1.0 ml 分別加入 2.0*102 mg/L、pH4.0 的牛血清蛋白水溶液 1.0ml,攪拌 0.5、1、5、

(50)

10、20、30、60 分鐘,靜置 30 分鐘,取上層水溶液做 定量。 3-3-4-2-4 改變 pH 值及離子強度對萃取率影響 (a)對正向萃取之影響 正向萃取: 取含有 9.6mM 濃度的萃取相 1.0 ml 分別加入 2.0*102 mg/L、pH 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 的牛血 清蛋白水溶液1.0ml,攪拌 30 分鐘,靜置分層,取上層水 溶液做定量。 (b) 對反向萃取之影響 正向萃取: 取含有 9.6mM 濃度的萃取相 1.0 ml 加入 2.0*102 mg/L、pH 4.0 的牛血清蛋白水溶液 1.0ml,攪拌 30 分鐘,靜置分層, 取上層水溶液做定量。 反向萃取:取正向萃取完的離子液體層,加入等體積 pH 4.0、5.0、6.0、 7.0、8.0、9.0、10.0 的緩衝溶液,攪拌 30 分鐘,靜置分 層,取上層水溶液做定量。 (c) 離子強度對反向萃取之影響 正向萃取: 取含有 9.6mM 濃度的萃取相 1.0 ml 加入 2.0*102mg/L、pH 4.0 的牛血清蛋白水溶液 1.0ml,攪拌 30 分鐘,靜置分層,

(51)

取上層水溶液做定量。 反向萃取:取正向萃取完的離子液體層,加入含等體積 1.0M NaSCN pH pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 的緩衝溶液,攪拌 30 分鐘,靜置分層,取上層水溶液做定量。 (d) 鹽類濃度對反向萃取之影響 正向萃取: 取含有 9.6mM 濃度的萃取相 1.0 ml 加入等體積 2.0*102 mg/L、pH 4.0 的牛血清蛋白水溶液,攪拌 30 分鐘,靜置 分層,取上層水溶液做定量。 反向萃取:取正向萃取完的離子液體層,加入等體積不同濃度 NaSCN pH9.0 的緩衝溶液,攪拌 30 分鐘,靜置分層, 3-3-4-2-5 萃取其他蛋白質水溶液 除了牛血清蛋白水溶液外,本實驗也對其他pI 值差異較大的蛋

白質作初步的萃取測試,探討以[Bmim]2[Congo Red]為萃取劑時靜電

力在此系統中的影響。

(a) 無添加萃取劑: 取[Bmim][PF6] 1.0ml 分別加入 2.0*102 mg/L,pH

4.0 與 7.0 的蛋白質溶液,攪拌 30 分鐘,靜置分 層,取上層水溶液做定量。

(52)

(b) 添加萃取劑: 取含有 9.6mM 濃度的萃取相 1.0 ml 分別加入 2.0*102 mg/L,pH 4.0 與 7.0 的蛋白質水溶液,攪拌 30 分 鐘,靜置分層,取上層水溶液做定量。

(53)

第四章 結果與討論

4-1 離子液體的合成

本實驗所合成的離子液體包括[Bmim][PF6]、[Bmim]2[Congo Red],

室溫之下的[Bmim][PF6]為金黃色黏稠液體,與水不互溶。合成產物 [Bmim][PF6]的1H-NMR 如圖 4-1 所示,1H-NMR (500 MHz, CH3Cl-d) δ: 8.36 (1H, s, NCHN), 7.30 (1H, s, CH3NCHCHN), 7.27 (1H, s, CH3NCHCHN), 4.08 (2H, t, J=12Hz, NCH2(CH2)2CH3), 3.82 (3H, s, NCH3), 1.77 (2H, quintet, NCH2CH2CH2CH3), 1.28 (2H, sextet, N(CH2)2CH2CH3), 0.84 (3H, t, J=12 Hz, N(CH2)3CH3). [BMIM][PF6]已 是被廣泛使用的一種離子液體,其性質也已被鑑定出來75。

[Bmim]2[Congo Red]為暗紅色黏稠液體,合成步驟中先利用

AgNO3 和 Congo Red 反應形成[Ag]2[Congo Red],產率約 53 %。

[Ag]2[Congo Red]以乙晴溶解後,再加入[Bmim][Cl]攪拌,產生 AgCl

沉澱,移除 AgCl 和溶劑之後,即可得到[Bmim]2[Congo Red],產率

約 26%。而以 ESI-作為質譜儀的游離方式時,可得([Bmim][Congo

Red])-的 m/z=789.2,而從 263.1 開始有 m/z=201 的間隔出現則推測是

由鹽類[Bmim][NO3]所造成。而由圖 4-2 的 UV-vis 吸收圖譜中顯示

(54)

210 nm 有吸收,而[Bmim]2[Congo Red]則同時兼具有這兩個波段的吸

收。另外由[Bmim][Cl]和[Bmim]2[Congo Red]的 1H-NMR 圖譜比對,

可看出化學位移的現象,與文獻中指出離子液體陰離子不同時,陽離 子上的氫會有化學位移產生相符22。[Bmim][Cl]的1H-NMR 如圖 4-3, (500 MHz, CH3Cl-d) δ: 9.81 (1H, s, NCHN), 7.67 (1H, s, CH3NCHCHN), 7.64 (1H, s, CH3NCHCHN), 4.25 (2H, t, J=12.0 Hz, NCH2(CH2)2CH3), 3.33 (3H, s, NCH3), 1.80 (2H, quintet, NCH2CH2CH2CH3), 1.28 (2H, sextet, N(CH2)2CH2CH3), 0.91 (3H, t, J=12.0 Hz, N(CH2)3CH3). 而

[Bmim]2[Congo Red] 的 1H-NMR 如圖 4-4,(500 MHz, CH3OH-d) δ:

8.81 (1H, s, NCHN), 7.43 (1H, s, CH3NCHCHN), 7.39 (1H, s,

CH3NCHCHN), 4.15 (2H, t, J=12.0 Hz, NCH2(CH2)2CH3), 3.87 (3H, s,

NCH3), 1.80 (2H, quintet, NCH2CH2CH2CH3), 1.32 (2H, sextet,

N(CH2)2CH2CH3), 0.96 (3H, t, J=12.0 Hz, N(CH2)3CH3). 而由圖 4-5,

(55)

圖 1 [Bmim][PF 6 ] NM R 圖譜

(56)

圖 4-2 [ B m im ]2 [Congo Red] M ASS 圖譜

(57)

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 pp m 0.915 1.222 1.247 1.271 1.297 1.322 1.347 1.757 1.783 1.800 1.807 1.812 1.824 1.831 1.856 1.958 1.966 1.974 1.982 2.071 3.332 3.670 4.226 4.250 4.274 7.638 7.666 9.811 3.177 2.134 2.146 1.787 3.167 2.153 1.988 1.000 圖 4- 3 [B m im ]2 [Cl] NMR 圖譜 N + N

(58)

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 ppm 0.935 0.960 1.258 1.282 1.307 1.333 1.358 1.383 1.760 1.785 1.802 1.809 1.834 1.859 1.949 1.957 1.965 1.973 1.982 2.106 2.540 3.530 3.870 4.129 4.154 4.178 7.397 7.432 8.813 2.958 2.003 2.004 8.115 3.035 1.990 2.034 0.995 圖 4- 4 [B m im ]2 [Congo Red] NMR 圖譜 N + N

(59)

0 10 20 [ B m i m ] 2 [ C o n g o R e d ] Temperature (0C)

T

m

=4.5

0

C

En

do

th

er

mi

c

(60)

4-2 製備液相/液相萃取系統 4-2-1 以親和性染料剛果紅為萃取劑 本實驗使用疏水性的離子液體[Bmim][PF6]作為萃取相,其在水 中溶解度為0.13% v/v27,和水溶液攪拌後可快速分層,在250C 時的 密度為1.36(g/ml)1,在兩相中位於下層,水溶液在上層。首先利用未 加入任何萃取劑的離子液體 [Bmim][PF6]來萃取牛血清蛋白,對 2.0*102 mg/L 牛血清蛋白水溶液的萃取率為 27.9% 再來,將紅色染料剛果紅直接溶入[Bmim][PF6]中,在與水平衡 後,結果發現離子液體相由原先金黃色轉為橘紅色(如圖 4-6 所示), 其UV-vis 吸收光譜圖如圖 4-7,在 497nm 有吸收。

(61)

(a) (b) (c)

圖 4-6 萃取劑在 [Bmim][PF6]中溶 解狀況

(a) [Bmim][PF6], (b) 剛果紅溶於[Bmim][PF6]中,

(c) [Bmim]2 [Congo Red]溶於[Bmim][PF6]中。

2 0 0 4 0 0 6 0 0 -1 .0 -0 .5 0 .0 0 .5 1 .0 1 .5 2 .0 2 .5 3 .0 3 .5 absorbance (A U) w a v e le n g th (n m ) [ B m i m ] [ P F 6 ] C o n g o R e d i n w a t e r C o n g o R e d i n [ B m i m ] [ P F 6 ] 圖 4-7 剛果紅在水相及[Bmim][PF6]中的 UV-visible 吸收光譜圖

(62)

4-2-2 以[Bmim]2[Congo Red]為萃取劑

由於剛果紅能進入離子液體[Bmim][PF6]的量有限,因此便利用

銀離子交換法合成出[Bmim]2[Congo Red] ,希望藉由陽離子之間的

π-π電子間作用力讓大量的[Bmim]2[Congo Red]溶於[Bmim][PF6]中,

其外觀如圖4-6 所示,UV-vis 吸收光譜圖如圖 4-8,在 497 nm 時有吸

收,證實[Bmim]2[Congo Red]的確能溶於萃取相,加入去離子水平衡

後,[Bmim]2[Congo Red]較偏向於存在於離子液體層,[Bmim]2[Congo

Red]在水相和離子液體相之間的分佈係數 KU/L= 0.01。而定量實際溶

於離子液體相中染料濃度的方法,是將不同已知濃度的

[Bmim]2[Congo Red]以甲醇稀釋後,取其在 497 nm 的最大吸收波長

對濃度作校正曲線,如圖4-9 所示,而由表 4-1 所示,可進入離子液

體[Bmim][PF6]的[Bmim]2[Congo Red]大增,且不易被水洗出,並能長

(63)

300 400 500 600 700 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 ab so rban ce (AU) wavelength (nm) [ B m i m ] [ P F 6 ] C o n g o R e d i n w a t e r [ B m i m ] 2 [ C o n g o R e d ] i n [ B m i m ] [ P F 6 ]

圖 4-8 [Bmim]2[Congo Red]在 [Bmim][PF6]中的

(64)

R2 = 0.9993 -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0 5 10 15 20 25 A b so rb a n ce ( A U )

[Bmim]2[Congo Red]/ [Bmim][PF6] (mg/ml)

圖 4-9 [Bmim]2[Congo Red]的校正曲線圖(at 497 nm)

[Bmim]2[Congo Red]在[Bmim][PF6]中的濃度

清洗前

dye/IL(mM) 3.2 5.4 10.8 16.1 21.5

清洗後

real conc. (mM) 2.7 5.3 9.6 15.7 19.7

表 4-1 [Bmim]2[Congo Red]在萃取相中清洗前後濃度的比較

(65)

4-3 萃取牛血清蛋白

本實驗萃取牛血清蛋白之示意圖如圖4-11,分為正向萃取及反向

萃取兩步驟,正向萃取率(forward extraction efficiency, Ef)和蛋白質回

收率(total efficiency, recovery, Et)的定義如下。

= BSA

aqueous phase aqueous phase

aqueous phase extraction phase extraction phase extraction phase Forward extraction Backward extraction Low pH High pH and salt 圖 4- 10、蛋白質萃取過程示意圖

(66)

4-3-1 萃取劑對牛血清蛋白萃取的影響 4-3-1-1 以親和性染料剛果紅為萃取劑萃取牛血清蛋白 如圖4-12、表 4-5 所示,在 pH 為 4.0 時萃取牛血清蛋白,當離 子液體相中 Congo Red 的含量增加,正向萃取率隨之提高,最高可 達到75 %。隨著蛋白質濃度增加,正向萃取率下降,由此可知每單 位的Congo Red 對蛋白質進行親和力結合的能力有限。

(67)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 E ffic ie n cy ( % ) 200ppm 500ppm 1000ppm 圖 4-11 加入不同量剛果紅進入萃取相對不同濃度的牛血清蛋白水 溶液進行正向萃取的結果 加入剛果紅至[Bmim][PF6]的比例(mg/ml)

(68)

4-3-1-2 以[Bmim]2[Congo Red]為萃取劑萃取牛血清蛋白

利用[Bmim]2[Congo Red]為萃取劑,在 pH 為 4.0 時,萃取 2.0*102

mg/L 牛血清蛋白水溶液時,萃取率會隨[Bmim]2[Congo Red]濃度增加

而提高,當濃度增加到9.6mM 時,萃取率達到定值(如圖 4-13),未

加入[Bmim]2[Congo Red]時,有 28 %的牛血清蛋白被萃取到離子液體

層,在加入[Bmim]2[Congo Red]後,能達到近 100%的高萃取率,顯

示能達到高萃取率是因為萃取劑[Bmim]2[Congo Red]的加入,因此選

用含9.6mM [Bmim]2[Congo Red]的離子液體作為實驗條件,另外,因

為在[Bmim]2[Congo Red]/IL 系統中萃取劑可較為穩定且大量存在於

離子液體相,所以在萃取劑的量加的夠多時,對5.0*102 mg 及 1.0*103

(69)

0 5 10 15 20 20 30 40 50 60 70 80 90 100

E

f

f

i

c

i

e

n

c

y

(

%

)

[ B m i m ]

2

[ C o n g o R e d ] / [ B m i m ] [ P F

6

] ( m M )

200ppm

500ppm

1000ppm

圖4-12 [Bmim]2[Congo Red]/IL 系統中不 同萃取劑濃度對萃取率

(70)

4-3-2 比較萃取時間對萃取率的影響 4-3-2-1 Congo Red/IL 系統中攪拌時間對萃取率的影響 如圖4-13 所示,在室溫下以磁石攪拌 30 分鐘的攪拌時間條件下,足 以使萃取充分達到平衡。 0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Effi cie nc y ( % ) Time (min) 圖 4-13 Congo Red/IL 系統中攪拌時間對萃取率的影響

(71)

4-3-2-2 [Bmim]2[Congo Red]/IL 系統中攪拌時間對萃取率的影響 圖4-14 顯示萃取牛血清蛋白時攪拌時間對萃取率的影響,從圖 中可看出牛血清蛋白從水相到離子液體相,在5 分鐘時萃取率即達到 85 %,20 分鐘後可達到 95 %以上,而 30 分鐘足以使萃取充分達到 平衡,因此實驗條件將萃取時間設定於30 分鐘。 0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Efficie n cy (% ) time (min)

30秒

圖4- 14 [Bmim]2[Congo Red]/IL 系統中反 應時間對萃取率的影

(72)

4-4 pH 值對蛋白質萃取的效應

一般親和性染料在結構上都帶有磺酸根,並由於染料上磺酸根的 pKa 值極低,在一般的實驗條件下,磺酸根上所帶的氫會游離,使得

親和性染料本身帶有負電,可和蛋白質上的protonated site 結合

(deprotonated SO3 group-NH2 terminus)。文獻中也曾經以 MALDI 探

討蛋白質與磺酸類親和性染料之間的作用力, 提出兩者之間的主要

吸引力應為庫侖靜電力75。為了進一步確認親和性染料與蛋白質之間

的作用力機制為何,本實驗藉由改變蛋白質正向及反向萃取時緩衝溶

液的pH 值,觀察其萃取率的變化。牛血清蛋白的等電點(pI)為 4.6,

在pH 值為 4.0 的緩衝溶液中,是以帶正電荷的形式存在,由本實驗結

果中可看出,不論是在Congo Red/IL 系統或是在[Bmim]2[Congo

Red]/IL 系統中,牛血清蛋白的萃取率受到靜電吸引力所影響,結果 顯示剛果紅是以負電荷形式與蛋白質互相吸引而結合,蛋白質基團上

所帶的電荷隨著pH 值改變而變化,在低 pH 值時,牛血清蛋白上所

帶正電荷越多,可得到最佳正向萃取率,反之在高pH 值時,由於靜

電排斥力的作用,蛋白質可脫離親和性染料而得到較好的回收效果;

Congo Red/IL 系統與[Bmim]2[Congo Red]/IL 系統的正向萃取的實驗

結果分別如圖4-15 及圖 4-16 所示,牛血清蛋白的正向萃取率是隨著

(73)

到5.0 間可看出萃取率明顯的下降。

圖4-17 與圖 4-18 分別為兩系統的反向萃取的圖形,從實驗結

果可以發現,將緩衝溶液pH 值提高,萃取率確實隨 pH 值提升而增

加,在Congo Red/IL 系統中回收率最高可達約 30%左右,而在

[Bmim]2[Congo Red]/IL 系統中則可達近 50%,由此推論在本實驗條

件下,庫侖靜電力為其中一種親和性染料剛果紅與牛血清蛋白的結合 作用力。 圖 4-15 Congo Red/IL 系統中不同 pH 值對牛血清蛋白水溶液的正向 萃取效率 2 4 6 8 10 12 -10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Eff iciency (%) pH

(74)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 20 40 60 80 100 Ef ficiency (%) pH

圖 4-16 [Bmim]2[Congo Red]/IL 系統中不同 pH 值對牛血清蛋白水

(75)

4 6 8 10 12 -5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 E f f i c i e n c y ( % ) p H 圖 4-17 Congo Red/IL 系統中不同 pH 值的緩衝溶液的反向萃取結果

(76)

4 5 6 7 8 9 10 0 10 20 30 40 50 60 70 Eff iciency (%) pH

圖 4-18 [Bmim]2[Congo Red]/IL 系統中不同 pH 值對牛血清蛋

(77)

4-5 離子強度對蛋白質萃取的效應 蛋白質的三級結構主要會受到下列四種作用力的影響: (1) 雙 硫鍵的存在與否(2)胺基酸序列本身疏水性的差異(3) 氫鍵作用力 (4) 帶電荷的蛋白質彼此之間的離子吸引力。本實驗藉由添加鹽類改 變溶液中的離子強度,產生遮蔽效應,使得蛋白質彼此之間的離子吸 引力減弱,蛋白質的三級結構在鹽類存在的環境下產生變形,此時親 和性染料與蛋白質之間因構形互補所貢獻的親和力,因著蛋白質的變 形而減弱,蛋白質可被成功反向萃取出來。 一般親和性層析在吸附目標物後,會利用含有高鹽類濃度的水溶 液使將目標物從靜相脫附而被沖提出來,本實驗在反向萃取中分別以 加入1.0M NaSCN 的不同 pH 值的緩衝溶液及在 pH9.0 的條件下利用 不同濃度的的NaSCN 作為實驗條件,探討遮蔽效應破壞牛血清蛋白

和[Bmim]2[Congo Red]陰離子磺酸基之間的靜電作用力,使牛血清蛋

白回到水相。由圖4-19 可看出加入 1.0 M 的 NaSCN 在不同 pH 條件

下反向萃取率只能略為提升,固進一步嘗試在pH 9.0 為條件下增加

NaSCN 的濃度,結果如圖 4-20 所示,隨著離子強度的增強,遮蔽效

應愈明顯,使得蛋白質回收率有所提升,最高可達約60%,但在實驗

(78)

劑會被大量洗出,所以實驗過程中還是選用1.0M NaSCN 作為實驗條 件。 4 5 6 7 8 9 0 10 20 30 40 50 60 70 80

Efficiency

(%)

pH

without NaSCN

with 1M NaSCN

圖 4-19 [Bmim]2[Congo Red]/IL 系統中不同 pH 值及加入鹽類

(79)

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 E f f i c i e n c y ( % ) N a S C N ( M )

圖 4-20 [Bmim]2[Congo Red]/IL 系統中加入鹽類 NaSCN 的濃度對牛

(80)

4-6 分別萃取其他蛋白質水溶液

由於親和性染料為group-specific ligand,並非對單一蛋白質才具

有親和性,故為了探討[Bmim]2[Congo Red]與其他蛋白質之間作用

力,除了牛血清蛋白,本實驗也嘗試萃取其他等電點差異較大的其他 蛋白質,包含溶菌酶(lysozyme)與核醣核酸酶 A(Ribonuclease A),以 探討此系統對其他蛋白質間作用力的影響。

當利用[Bmim][PF6] 在 pH 4.0 條件下分別萃取這三種蛋白質

時,其萃取效率分別為對牛血清蛋白27.9%,對核醣核酸酶 A

28.1% ,對溶菌酶 28.0%(如表 4-2) ,而使用濃度為 9.6mM 的

[Bmim]2[Congo Red]/IL 系統的萃取相,同樣在 pH 4.0 條件下分別萃

取這三種蛋白質水溶液時,發現pI 值最低的牛血清蛋白有近 100%的

萃取率,而pI 值在中間的核醣核酸酶 A 只有 35.2 %的萃取率,但對

pI 值最高的溶菌酶又為近 100%,而使用含[Bmim]2[Congo Red]萃取

劑的系統中會因萃取劑帶有磺酸基SO3-而帶有對正電蛋白質的吸引 力,在pH 4.0 時核醣核酸酶 A 雖為帶正電而萃取率卻並未明顯提升, 故推測靜電力在此系統中並非唯一與蛋白之間的作用力,蛋白質與染 料間的親和力也為另一項主要因素,曾有研究顯示以剛果紅做為親和 性染料時對溶菌酶也有所吸附只是吸附的量較牛血親蛋白來的少 68 ,而由實驗結果顯示萃取劑[Bmim] 2[Congo Red]在 pH 為 4.0 的條

(81)

件下對溶菌酶的萃取率也為近100%,因此推測雖然溶菌酶對剛果紅

的親和力較牛血清蛋白來的小,但因溶菌酶pI 值過高造成在酸性環

境下帶有較多正電荷,靜電力的影響也較大,故也能達到近100%的

萃取率。

而在pH7.0 的條件下萃取三種蛋白質,實驗結果發現對核醣核酸

酶A 萃取時,加入萃取劑[Bmim]2[Congo Red]對萃取率並無影響,顯

示萃取劑[Bmim]2[Congo Red]對核醣核酸酶 A 無親和力的作用,而對

牛血清蛋白作萃取時不論是否加入加入萃取劑[Bmim]2[Congo Red]

都沒有任何萃取率,而對溶菌酶作萃取時則發現加入萃取劑

[Bmim]2[Congo Red]可使萃取率由原先 11.3%提升至 83.6%,綜合以

上結果以[Bmim]2[Congo Red]/IL 系統萃取蛋白質時,萃取率會深受蛋

白質與萃取劑的親和力與靜電力所影響,且若少了其中一種作用力則

萃取劑[Bmim]2[Congo Red]對蛋白質的萃取率就無顯著影響,另外親

(82)

牛血清蛋白 核醣核酸酶A 溶菌酶 等電點 (pI) 4.6 9.5 10.7 [BMIM][PF6] Ef (%) 27.9 28.1 28.0 pH4 [Bmim][PF6]+

[Bmim]2[Congo Red]

Ef (%) 98.6 35.2 97.6 [BMIM][PF6] Ef (%) -- 24.0 11.3 pH7 [Bmim][PF6]+

[Bmim]2[Congo Red]

Ef (%)

-- 24.8 83.6

(83)

第五章 結論

本實驗使用親和性染料剛果紅應用於離子液體[Bmim][PF6]

,發現親和性染料剛果紅對牛血清蛋白具有一定的親和力。當離子液 體相中的親和性染料濃度愈高時,對蛋白質的萃取效果隨之提升。並 利用將染料配體剛果紅經由簡單的離子交換過程,合成為具有親和性

的離子液體[Bmim]2[Congo Red],提升了對牛血清蛋白的萃取率。

染料配體在純化蛋白質時除了結構類似天然配體之外,其磺酸基 在一般條件下會解離帶負電荷,和蛋白質之間可經由靜電作用力達到 吸附效果,本實驗藉由調控牛血清蛋白水溶液的 pH 值,印證蛋白質 上所帶電荷越多,在正向萃取時越容易被萃取到離子液體層,且離子 強度愈強時,反萃後的蛋白質回收率則愈高,所以靜電作用力也是其 中一種能影響萃取率的因素,而由萃取其他蛋白質時可發現在

[Bmim]2[Congo Red]/IL 系統中,親和力與靜電力都為此系統與蛋白質

間的主要作用力。

染料配體因其結構不同,則純化的蛋白質種類亦有所差異,未 來可嘗試其他不同種類的染料應用於離子液體,針對其他不同蛋白質 做萃取,而結合離子液體取代傳統有機溶劑作為萃取相,減少化學溶 劑的揮發,降低了對環境的汙染,符合環保的概念。

(84)

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1-Ethyl-3-methylimidazolium Based Ionic Liquids” J. Chem. Soc., Chem. Commun. 13 (1992) 965-967.

數據

圖 4-7 剛果紅在水相及[Bmim][PF 6 ]中的 UV-visible 吸收光譜圖…47  圖  4-8 [Bmim]2[Congo Red]在 [Bmim][PF 6 ]中的 UV-visible 吸收光譜                  圖………………………………………………………………..49  圖 4-9 [Bmim] 2 [Congo Red]的校正曲線圖…………………………...50  圖 4-10 蛋白質萃取過程示意圖………………………………………51  圖 4-11 加入不同量剛果
圖 2- 2  離子液體合成步驟 8 2-1-2  離子液體的發展          第一個被發現的離子液體是 ethylammonium nitrate  ([EtNH 3 ]NO 3 )  ,在 1914 年時被合成出來 26 ,然而,其本身容易潮解, 無法在普通環境下安定存在,所以在其後數十年離子液體的發展並未 有重大突破,之後在 1951 年時 Hurley 發展出有機鋁離子液體
表 2-2 咪 唑 鹽 類 的 離 子 液 體 熔 點 7
表 2- 4  染料分子在親和層析上的應用 61
+7

參考文獻

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