實驗部份

3-1 試藥

3-1-1 合成 [BMIM][PF₆] 之藥品

(1) 1-chlorobutane, C4H9Cl, 99 %, GR grade (Janssen Chimica, Geel, Belgium)

(2) 1-methylimidazole, C4H6N2, 99 %, GRgrade (Acros, Geel, Belgium) (3) Potassium hexafluorophosphate, KPF6, 99 %, GR grade (Showa,

Tokyo, Japan)

(4) Magnesium sulfate anhydrous, MgSO4, 99 %, GR grade (Showa, Tokyo, Japan)

(5) Ethyl Acetate, CH3COOC2H5, HPLC grade (Mallinckrodt Baker, Phillipsburg, NJ, USA)

3-1-2 合成 [BMIM]₃[CB3GA] 之藥品

(1) Cibacron Blue F-3GA , C29H17ClN7Na3O11S3, GR grade (Sigma, St.

Louis, MO, USA)

(2) Silver nitrate, AgNO3, GR grade, 99.8 % (Showa, Tokyo, Japan)

(Acros, Geel, Belgium)

(4) Acetone Nitrile, HPLC grade, 99.9 % (TEDIA, Fairfield, OH, USA) (5) Menthol, CH3OH, HPLC grade, 99.9 % (TEDIA, Fairfield, OH, USA) (6) Acetone, CH3COCH3, HPLC grade, 99.9 % (TEDIA, Fairfield, OH,

USA)

3-1-3 配製緩衝溶液之試劑

(1) Hydrochloric Acid, HCl, GR grade (Showa, Tokyo, Japan) (2) Potassium chloride, KCl, GR grade (Riedel-de Haën, Seelze,

Germany)

(3) Sodium chloride, NaCl, GR grade (Riedel-de Haën, Seelze, Germany) (4) Glycine, C2H5NO2, GR grade (Riedel-de Haën, Seelze, Germany) (5) Acetic Acid, CH3COOH, HPLC grade (Mallinckrodt Baker,

Phillipsburg, NJ, USA)

(6) Sodium acetate, CH3COONa, 98.5 %, GR grade (Showa, Tokyo, Japan)

(7) Sodium dihydrogenphosphate anhydrous, NaH2PO4, 98.0 %, GR grade (Showa, Tokyo, Japan)

(8) Potassium dihydrogenphosphate, KH2PO4, 99%, GR grade (Showa, Tokyo, Japan)

(9) Tris(hydroxymethyl) aminomethane, (HOCH2)3CNH2, ACS grade (TEDIA, Fairfield, OH, USA)

(10) Sodium hydrogen carbonate, NaHCO3, 99.5 %, GR grade (Showa, Tokyo, Japan)

(11) Sodium hydroxide, NaOH, 96 %, GR grade (Showa, Tokyo, Japan) (12) D.I.W.去離子水，經由 Millipore (Bedford MA ,USA)的 Milli-Q

plus 處理

3-1-4 蛋白質分子

(1) Cytochrome c (細胞色素 c) from Horse Heart，M.W. : 12361, 97%，

pI : 10.5，(Sigma, St. Louis, MO, USA)

(2) Lysozyme (溶菌酶) from chicken egg white，M.W. : 14307，97%，

pI : 10.7，(Sigma, St. Louis, MO, USA)

(3) Ovalbumin (卵白蛋白) from chicken egg white，M.W. : 44287，

98%，pI : 4.5，(Sigma, St. Louis, MO, USA)

(4) Bovine serum albumin (牛血清蛋白)，簡稱 BSA，M.W. : 63000，

98%，pI : 4.6，(Sigma, St. Louis, MO, USA)

3-2 儀器

(1)核磁共振儀(Nuclear Magnetic Resonance, NMR): DRX-300, (Bruker, Germany); Uniytinova-500, (Varian, USA)

(2)紫外光-可見光光譜儀(UV-Visible Spectrophotometer): Hewlett Packard 8453, (Waldronn, Germany)

(3)高效能液相層析管柱(reversed-phase HPLC column): Vercopak Inertsil 7 octadecyl silica-3 (ODS-3), (建宏層析，台北)

管柱尺寸為 4.6

×

250 mm，孔徑大小為 10 μm，用於蛋白質的分析 與定量⁷⁴。

(4)梯度幫浦(Gradient Pump): Degasys DG 2410, (Lab Alliance, USA) 結合 Series Ⅲ pump，最多可做四種動相組成的梯度混合。

(5)離心機(Centrifuges): EBA20, (Hettich, Germany) 最大轉速 6000 rpm，最大離心力為 3421 g (轉速單位

g=11.18

×

R

×

rpm²

×

10^-6 , R:旋轉軸半徑(單位 cm))。

(6)質譜儀(Mass Spectroscopy): Quattro Micro, (Waters,USA) (7)熱重量分析儀(Thermogravimetric analysis, TGA):

使用 Du Pont Instrument TGA2950 儀器。

(8)微差掃描卡計(Differential Scanning Calorimetry, DSC):

使用 SEIKO EXSTAR 6000DSC 及 Computer/Thermal Analyzer。測

量方式為:取 5~10 mg 的樣品裝入鋁製的 cell 中，在通入氮氣為 100 ml/min 下，做兩階段式 DSC 測試:

1. 降溫速率 10℃/min，範圍 30℃~-70℃

2. 升溫速率 10℃/min，範圍-70℃~ 30℃

重複此步驟三次，可經由圖譜判斷離子液體的熔點。

(9)圓形二相色性分光光譜儀 Circular Dichroism (CD) Spectrometer, Aviv Model 62ADS ( Lakewood, N.J.)

3-3 實驗流程

3-3-1 離子液體之合成

本實驗使用的離子液體包含[BMIM][PF₆]、[BMIM]₃[CB3GA]。

其中[BMIM][PF₆]為疏水性離子液體，容易和水溶液分層，因此實驗 中 將 其 作 為 萃 取 相 ， 其 合 成 步 驟 參 考 相 關 文 獻 ⁷⁵。 另 外 ， [BMIM]₃[CB3GA]則是將對蛋白質具有親和性的染料 CB3GA，和離 子液體的陽離子[BMIM]⁺結合，使其帶有離子液體特性，並同時兼具 親和性的性質，在本實驗中作為萃取蛋白質的萃取劑。以下為離子液 體的合成步驟。

3-3-1-1 合成[BMIM][PF₆]

1.將 0.6 mole (62.7 ml) 1-chlorobutane 和 0.6 mole (47.8 ml)

1-methylimidazole 加入至 250 ml 圓底瓶中，並架設迴流裝置，加熱 至 80℃後，持續攪拌約 48 hr，可得到一金黃色黏稠液體

1-butyl-3-methylimidazolium chloride ([BMIM][Cl])。

2.將此黏稠液體到入分液漏斗中，加入 50 ml 的乙酸乙酯洗去未反應

3.下層液加熱至 90℃攪拌一天，去除乙酸乙酯。

4.取 0.6 mole KPF6，加入 300 ml 去離子水，室溫下攪拌至溶解。

5.將[BMIM][Cl]加入 KPF6水溶液中，攪拌約 1 hr。

6.將溶液倒入分液漏斗中，取出水層，再加入少許去離子水，除去水 層，重覆此步驟數次直到水層成中性。

7.取出下層離子液體，加入硫酸鎂除去離子液體層中的水，經重力過 濾後，即可得到 1-butyl-3-methyl imidazolium hexafluorophosphate ([BMIM][PF6])。

8.合成示意圖如圖 3-1，最後將產物測¹H-NMR，以鑑定之。

圖 3- 1、[BMIM][PF6]合成示意圖

3-3-1-2 合成 [BMIM]3[CB3GA]

1.取 2x10^-3 mole (1.68 g) Cibacron Blue F3GA (CB3GA)，溶於 50 ml 去離子水，再加入 2x10^-2 mole (3.39 g) AgNO3，室溫下攪拌 24 hr。

2.將所得溶液以 6000 rpm 轉速離心 5 min，將水相去除後，以 10 ml 冰水清洗沉澱物三次。

3.將沉澱物置於真空烘箱，40℃條件下，烘 12 hr，可得到藍色固體 Ag3CB3GA。

4.將步驟 3.所得的 Ag3CB3GA，加入 50 ml 乙晴溶解之，再加入三倍 莫耳數的[BMIM][Cl]，40℃攪拌 72 hr。

5.將所得溶液以 6000 rpm 轉速離心 5 min，去除沉澱物 AgCl，再以旋 轉濃縮機去除乙晴。

6.接著以丙酮溶解粗產物，以 6000 rpm 轉速離心 5 min，去除沉澱物，

(Ag3CB3GA 不溶於丙酮)，將丙酮抽乾後即可得到產物 [BMIM]3[CB3GA]。

7.反應如 3-1、3-2，產物以 NMR、Mass、TGA、DSC、UV-vis 鑑定。

3-3-2 製備液相/液相萃取系統

在 本 實 驗 中 萃 取 系 統 分 為 兩 種 方 式 ， 一 種 是 將 親 和 性 染 料 CB3GA 水溶液和萃取相[BMIM][PF6]攪拌作用，使部分 CB3GA 轉移 到離子液體層。另一種方式則是將親和性染料先合成為離子液體 [BMIM]3[CB3GA]，以這種具有親和性的離子液體做為萃取劑加到萃 取相中。

3-3-2-1 以親和性染料 CB3GA 為萃取劑

1.取 4x10^-4 mole (0.336 g) CB3GA 溶於 5 ml H2O，再加入 10 ml [BMIM][PF6]，攪拌平衡一天後，用去離子水清洗萃取相至水層澄 清。

2.取步驟 1.之離子液體層，利用紫外光-可見光光譜儀做定性分析。

3-3-2-2 以親和性離子液體[BMIM]3[CB3GA]做為萃取劑

1.分別將 5

×

10^-6、10^-5、2.5

×

10^-5、5

×

10^-5、10^-4、2

×

10^-4 mole 的 [BMIM]3[CB3GA]加到 10 ml [BMIM][PF6]中攪拌 10 min 後，利用

20 ml 去離子水清洗五次將過多的[BMIM]3[CB3GA]洗至水層並去 除。

2.定量方法:將[BMIM]3[CB3GA]溶於[BMIM][PF6]，配製成濃度分 別為 0.25、0.5、1.25、2.5、5.0、10.0 mM，各取 100

μ

l 並加入 4.0 ml 甲醇，由紫外光-可見光光譜儀針對波長 623 nm 吸收值做出

檢量線。再將步驟 1.平衡過後的萃取相各取 100

μ

l 並加入 4.0 ml 甲醇，測出波長 623 nm 吸收值，帶入檢量線後，即可得到萃取相 中[BMIM]3[CB3GA]的濃度。

3-3-3 配製緩衝溶液

0.05 M KCl / 0.1 M HCl 調配 pH 範圍 1.0-2.2 0.05M Glycine / 0.1M HCl 調配 pH 範圍 2.1-3.5

0.05 M CH3COOH / 0.05 M CH3COONa 調配 pH 範圍 3.6-5.0 0.05 M KH2PO4 / 0.1 M NaOH 調配 pH 範圍 5.8-6.9

0.05 M Tris(hydroxymethyl)-aminomethane / 0.1M HCl 調配 pH 範圍 7.0-9.0

0.05M NaHCO₃ / 0.1M NaOH 調配 pH 範圍 9.6-11.0 0.05M Na₂HPO₄ / 0.1M NaOH 調配 pH 範圍 10.9-12.0

3-3-4 萃取蛋白質溶菌酶

3-3-4-1 以親和性染料 CB3GA 為萃取劑

取 3-3-2-1 所得到之萃取相 2.0 ml 加入等體積 200 mg/L、pH 7.0 的溶 菌酶水溶液，以磁石攪拌 30 min，靜置 30 min，取上層水溶液做蛋白 質定量。

3-3-4-2 以親和性離子液體[BMIM]3[CB3GA]做為萃取劑

3-3-4-2-1 改變[BMIM]₃[CB3GA]濃度對萃取率影響

正向萃取:取含有 0、0.28、0.61、1.55、2.52、3.80、5.82 mM

[BMIM]₃[CB3GA]之[BMIM][PF₆] 2.0 ml 分別加入等體積 500 mg/L、

pH 4.0 的溶菌酶水溶液，以磁石攪拌 30 min，靜置 30 min，取上層水 溶液做定量。

3-3-4-2-2 攪拌時間對萃取率影響

正向萃取:取含有 3.80 mM [BMIM]₃[CB3GA]之[BMIM][PF₆] 2.0 ml 分 別加入等體積 500 mg/L、pH4.0 的溶菌酶水溶液，以磁石攪拌 0.5、1、

5、10、20、30、60 min，靜置 30 min，取上層水溶液做定量。

3-3-4-2-3 改變 pH 值對萃取率影響 (a)對正向萃取之影響

正向萃取:取含有 3.80 mM [BMIM]₃[CB3GA]之[BMIM][PF₆] 2.0 ml 分 別加入等體積 500 mg/L、pH 1.0~11.0 的溶菌酶水溶液，以磁石攪拌 30 min，靜置 30 min，取上層水溶液做定量。

(b) 對反向萃取之影響

1.正向萃取: 取含有 3.80 mM [BMIM]₃[CB3GA]之[BMIM][PF₆] 2.0ml 分別加入等體積 500 mg/L、pH 4.0 的溶菌酶水溶液，以磁石攪拌

30 min，靜置 30 min，取上層水溶液做定量。

2.反向萃取:取正向萃取完的離子液體層 1.0 ml，加入 1.0 M KCl pH 4.0~11.0 的緩衝溶液 1.0 ml，以磁石攪拌 30 min，靜置 30 min，

取上層水溶液做定量。

3-3-4-2-4 使用回收離子液體做萃取 (a)

1.將萃取過後的離子液體層加入等體積去離子水清洗去除 KCl。

2.正向萃取:取清洗過的離子液體層 2.0 ml，加入等體積 500 mg/L、pH 4.0 的溶菌酶水溶液，以磁石攪拌 30 min，靜置 30 min，取上層水 溶液做定量。

3.反向萃取:將正向萃取完的水層去除，加入 1.0 M KCl pH 11.0 的緩 衝溶液 2.0 ml，以磁石攪拌 30 min，靜置 30 min，取上層水溶液做 定量。

4.反向萃取完後，重複步驟 1.清洗離子液體層，即可重複進行步驟 2 和步驟 3 達到回收利用目的。

(b)

1.將萃取過後的離子液體層加入等體積 1.0M KCl、pH 11.0 緩衝溶液，

以磁石攪拌 30 min，重複兩次以去除殘留在萃取相中的蛋白質，再 加入等體積去離子水清洗去除 KCl。

4.0 的溶菌酶水溶液，以磁石攪拌 30 min，靜置 30 min，取上層水 溶液做定量。

3.反向萃取:將正向萃取完的水層去除，加入 1.0 M KCl、pH 8.0 的緩 衝溶液 2.0 ml，以磁石攪拌 30 min，靜置 30 min，取上層水溶液做 定量。

4.反向萃取完後，重複步驟 1.清洗離子液體層，即可重複進行步驟 2 和步驟 3 達到回收利用目的。

3-3-4-2-5 濃縮蛋白質溶菌酶

1.正向萃取: 取含有 3.80 mM [BMIM]3[CB3GA]之[BMIM][PF6] 5.0ml 加入等體積 500 mg/L、pH 4.0 的溶菌酶水溶液，以磁石攪拌 30 min，靜置 30 min，取上層水溶液做定量。

2.反向萃取:正向萃取完，將水層去除後，分別加入 5.0、2.5、1.0 ml 的 1.0 M KCl、pH 8.0 緩衝溶液，攪拌 30min，靜置 30 min，取上 層水溶液做定量。

3-3-4-2-6 溶菌酶活性測試

1.配製 pH 4、200 mg/L 溶菌酶水溶液，測量其 CD 光譜。

2.將含有 3.80 mM [BMIM]3[CB3GA]之[BMIM][PF6]加入等體積 pH 4.0、500 mg/L 溶菌酶水溶液正向萃取之後，再以等體積 1.0 M KCl、pH 8.0 緩衝溶液為做為反向萃取條件，反向萃取完，將上層

水溶液通過 Desalting column 除鹽，再進行 CD 光譜測量。

3-3-5 萃取其他蛋白質水溶液

除了溶菌酶外，本實驗也對卵白蛋白、牛血清蛋白、細胞色素 c 作初步的萃取測試，探討以[BMIM]3[CB3GA]為萃取劑時，是否能對 其他蛋白質有萃取效果，以及用於純化蛋白質的可能性。

3-3-5-1 萃取個別蛋白質水溶液

(a) 無添加萃取劑: 取[BMIM][PF₆] 2.0ml 分別加入等體積 500 mg/L，

pH 4.0、pH 7.0、pH 11.0 的蛋白質溶液，以磁石攪拌 30 min，靜 置 30 min，取上層水溶液做定量。

(b) 添加萃取劑: 取含有 3.80 mM [BMIM]₃[CB3GA]之[BMIM][PF₆] 2.0 ml 分別加入等體積 500 mg/L，pH 4.0、pH 7.0、pH 11.0 的蛋 白質水溶液，以磁石攪拌 30 min，靜置 30 min，取上層水溶液做 定量。

3-3-5-2 萃取混合蛋白質水溶液

(a) 等濃度蛋白質混合溶液

1.正向萃取: 取含有 3.80 mM [BMIM]3[CB3GA]之[BMIM][PF6] 2.0 ml

合水溶液，以磁石攪拌 30 min 靜置 30 min。

2.反向萃取: 取正向萃取完的離子液體層 1.0 ml，加入 1.0 M KCl

、pH 8.0 的緩衝溶液 1.0 ml，以磁石攪拌 30 min，靜置 30 min，取 上層水溶液做定量。

(b) 模擬雞蛋蛋白之蛋白質混合溶液

1.正向萃取: 取含有 3.80 mM [BMIM]3[CB3GA]之[BMIM][PF6] 2.0 ml 加入等體積 pH 7.0，500 mg/L 溶菌酶、7500 mg/L 卵白蛋白、2000 mg/L 牛血清蛋白混合水溶液，以磁石攪拌 30 min 靜置 30 min。

2.反向萃取: 取正向萃取完的離子液體層 1.0 ml，加入 1.0 M KCl、

pH 8.0 的緩衝溶液 1.0 ml，以磁石攪拌 30 min，靜置 30 min，取上 層水溶液做定量。

3-3-6 蛋白質定量方式

本實驗將萃取過後的蛋白質水溶液用 HPLC 分析，接上紫外 光偵測器作定量。組成蛋白質的胺基酸帶有芳香基團，在波長 280 nm 會吸光，而蛋白質骨架上的-C=O 基團在 200 nm 附近會有吸 收，但因為 200 nm 波長的光線來源不穩定，而且會受到空氣中氧 分子的干擾，因此較難應用。本實驗選擇 280 nm 光源對蛋白質作

定量。而每種蛋白質分子中的芳香基團含量不一，因此在 280 nm 的吸光能力就有差別，也因此各有不同的消光係數。

3-3-6-1 利用 HPLC 定量蛋白質水溶液

1. HPLC 儀器裝置如圖 3-2，用動相 A (含有 0.1 % TFA、20 % ACN 的水溶液)沖提 reverse phase HPLC 使平衡 10 分鐘。

2. 注入 20μL 待測物。

3. 以動相 A+B(含有 0.1 % TFA、80 % ACN 的水溶液)，在 15 分鐘內 做梯度沖提，紫外光偵測器之吸收波長設定在 280 nm。

4. 以濃度 100、200、500、1000 mg/L 的蛋白質標準品做檢量線，定 量各蛋白質水溶液濃度。

在文檔中 應用親和性離子液體於溶菌酶之萃取 (頁 36-51)