結果與討論 - 應用親和性離子液體於溶菌酶之萃取

4-1 離子液體之合成

本實驗所合成的離子液體包括[BMIM][PF₆]、[BMIM]₃[CB3GA]，

在室溫之下 [BMIM][PF₆] 為金黃色黏稠液體，與水不互溶。 [BMIM][PF₆]的¹H-NMR 如圖 4-1 所示，¹H-NMR (300 MHz, CH₃OH-d) δ: 8.93 (1H, s, NCHN), 7.73 (1H, s, CH3NCHCHN), 7.67 (1H, s,

CH3NCHCHN), 4.34 (2H, t, J=7.2 Hz, NCH2(CH2)2CH3), 4.03 (3H, s, NCH3), 1.92 (2H, m, NCH2CH2CH2CH3), 1.35 (2H, m, N(CH2)2CH2CH3), 0.93 (3H, t, J=7.2 Hz, N(CH₂)₃CH₃). [BMIM][PF₆]已是被廣泛使用的一種離子液體，其性質也已被鑑定出來⁷⁵。

[BMIM]3[CB3GA]為深藍色黏稠液體，合成步驟中先利用 AgNO3

和 CB3GA 反應形成 Ag3CB3GA，產率約 91 %。Ag3CB3GA 以乙晴溶解後，再加入[BMIM][Cl]攪拌，產生 AgCl 沉澱，移除 AgCl 和溶劑之後，即可得到[BMIM]3[CB3GA]，產率約 54 %。由[BMIM][Cl]

和[BMIM]3[CB3GA]的¹H-NMR 圖譜比對，可看出化學位移的現象，

文獻指出離子液體陰離子不同時，陽離子上的氫會有化學位移產生

24。[BMIM][Cl]的¹H-NMR 如圖 4-2，(500 MHz, DMSO-d6) δ: 9.63 (1H, s, NCHN), 7.92 (1H, s, CH3NCHCHN), 7.83 (1H, s, CH3NCHCHN), 4.20

(2H, t, J=7.0 Hz, NCH2(CH2)2CH3), 3.87 (3H, s, NCH3), 1.74 (2H, m, NCH2CH2CH2CH3), 1.21 (2H, m, N(CH2)2CH2CH3), 0.85 (3H, t, J=7.0 Hz, N(CH2)3CH3). 而[BMIM]3[CB3GA] 的 ¹H-NMR 如圖 4-3，(500 MHz, DMSO-d6) δ: 9.14 (1H, s, NCHN), 7.76 (1H, s, CH3NCHCHN), 7.69 (1H, s, CH3NCHCHN), 4.10 (2H, t, J=7.0 Hz, NCH2(CH2)2CH3), 3.83 (3H, s, NCH3), 1.74 (2H, m, NCH2CH2CH2CH3), 1.24 (2H, m, N(CH2)2CH2CH3), 0.88 (3H, t, J=7.5 Hz, N(CH2)3CH3).

而質譜儀以 ESI⁺為游離方式可看到[BMIM]+的 m/z=139.1，ESI -作為游離方式時(圖 4-4)，可看到一個陽離子[BMIM]+脫離形成 ([BMIM]₂[CB3GA])^-的荷質比 m/z=1048.3，以及([BMIM][CB3GA]) 2-的 m/z=454.5。由圖 4-5，微差掃描卡計(DSC)2-的測量結果可看出 [BMIM]₃[CB3GA]的熔點為 8.4℃，具有吸熱的特徵峰出現。從熱重量分析儀(TGA)測量得到其 T_{d (-5 %)}=250℃(T_d(%):樣品重量損失百分率的溫度)。而圖 4-6 的 UV-vis 吸收圖譜中顯示 CB3GA 的發光團在 623 nm 時有吸收， [BMIM][PF₆] 陽離子部分在 210 nm 有吸收，而 [BMIM]₃[CB3GA]則同時兼具有這兩個波段的吸收。

圖4- 1、 [BMIM][PF6] NMR圖譜

圖4- 2、 [BMIM][Cl] NMR圖譜

圖4- 3、 [BMIM]3[CB3GA] NMR圖譜

圖4- 4、 [BMIM]3[CB3GA] Mass圖譜

圖 4- 5、 [BMIM]3[CB3GA]之 DSC 圖譜

圖 4- 6、 [BMIM]3[CB3GA]之 UV-vis 圖譜

200 400 600 800

0 1 2 3 4

A b so rb en ce ( A U)

Wavelength (nm)

[BMIM]₃

[CB3GA]

CB3GA [BMIM][PF₆

]

0 10 20

[BMIM]

₃

[CB3GA]

Endothermic

Temperature (

C )

Tm= 8.4

C

4-2 製備液相/液相萃取系統

本實驗使用[BMIM][PF6]作為萃取相，因其為疏水性的離子液體，在水中溶解度為 0.13% v/v⁷⁵，和水溶液攪拌後可快速分層，其密度比水大，在兩相中位於下層，水溶液在上層。萃取劑方面則選取 CB3GA 和[BMIM]3[CB3GA]，因 CB3GA 不溶於[BMIM][PF6](如圖 4-7(b))，將其配製為水溶液後和[BMIM][PF6]攪拌，發現離子液體層由金黃色變橄欖綠，有部分 CB3GA 轉移到離子液體層，但 CB3GA 親水性高，轉移到離子液體層效率差，大部分的 CB3GA 仍留在水相，

其 UV-vis 光譜如圖 4-8，吸收波長從 623 nm 位移到 480 nm，推測 CB3GA 在[BMIM][PF6]中經長時間攪拌後，結構可能被破壞，目前尚無法鑑定出此物質為何，且在定量上有困難。用此萃取相在 pH 7.0 條件下萃取 200 mg/L 溶菌酶水溶液，萃取率約為 24.7 %。

(a) (b) (c)

圖 4- 7、萃取劑在 [BMIM][PF6]中溶解狀況

(a) [BMIM][PF6], (b) CB3GA 粉末於[BMIM][PF6]中,(c) [BMIM]3

圖 4- 8、CB3GA 轉移到[BMIM][PF6]中之 UV-vis 圖

因此進一步將 CB3GA 合成為離子液體[BMIM]3[CB3GA]，希望藉由陽離子之間的π-π 電子間作用力讓 [BMIM]3[CB3GA] 溶於 [BMIM][PF6]中，結果如圖 4-7(c)，證實[BMIM]3[CB3GA]的確能溶於萃取相，加入去離子水平衡後，分別取 100 μl 的水相和離子液體相，

加入 4.0 ml 甲醇稀釋後，利用 UV-vis 測量 623nm 吸收值，估計 [BMIM]3[CB3GA]在水相和離子液體相之間的分佈係數 KU/L= 0.02，

由此可知[BMIM]3[CB3GA]較偏向於存在於離子液體層。因此本實驗將利用[BMIM]3[CB3GA]做為萃取劑，萃取蛋白質水溶液。

400 500 600 700 800

0.0 stirred CB3GA

_(aq)

with [BMIM][PF

₆

]

4-3 萃取蛋白質溶菌酶

本實驗萃取溶菌酶之示意圖如圖 4-9，分為正向萃取及反向萃取兩步驟，正向萃取率(forward extraction efficiency, Ef)和反向萃取率 (backward extraction efficiency, Eb)以及蛋白質回收率(recovery, Et)的定義如下。

IL phase IL phase

aqueous phase

IL phase IL phase

4-3-1 改變[BMIM]3[CB3GA]濃度對萃取率影響

利用[BMIM]3[CB3GA]為萃取劑，在 pH 4.0 條件下萃取 200、

500、1000 mg/L 溶菌酶水溶液時，萃取率會隨[BMIM]3[CB3GA]濃度增加而提高，而這三種濃度的溶菌酶水溶液在[BMIM]3[CB3GA]濃度

[BMIM]

₃

[CB3GA] (mM)

200 mg/L

500 mg/L

1000 mg/L

4-3-2 攪拌時間對萃取率影響條件下進行正向萃取，反應時間分別為 0.5、1、5、10、20、30、60 min。

4-3-3 改變 pH 值對萃取率影響

漸降低。有文獻指出胺基酸在離子液體和水之間的分佈行為⁷⁶，當水

500 mg/L lysozyme

pH E f (%)

圖 4- 13、溶菌酶在不同 pH 值表面所帶電荷數 ⁷⁷

一般親和性層析在吸附目標物後，會利用含有高鹽類濃度的水溶

液使將目標物從靜相脫附而被沖提出來⁷⁸，在本實驗的反向萃取中分

別利用 1.0 M 的 NaCl 和 KCl 作為實驗條件，藉由遮蔽效應破壞溶菌酶和[BMIM]₃[CB3GA]陰離子磺酸基之間的靜電作用力，使溶菌酶回到水相。以 1.0 M 的 NaCl 在 pH 7.0 條件下反向萃取率約 40 %，而 1.0 M 的 KCl 在 pH 7.0 條件下反向萃取率可達 85 %，與文獻提出的離子半徑越大，遮蔽效應越高相符⁵⁶，因此反向萃取時選用 1.0 M 的 KCl 緩衝溶液。同樣地，改變水溶液酸鹼值，反向萃取所得到的結果正好和正向萃取相反，當 pH 值增高，溶菌酶表面電荷數減少，靜電力較弱，反向萃取率呈現增加的趨勢，如圖 4-14 所示。

圖 4- 14、 pH 值對反向萃取率的影響

含有 3.8 mM [BMIM]₃[CB3GA]針對 500 mg/L 溶菌酶水溶液在 pH 4.0 條件下進行正向萃取，反向萃取利用 pH4.0~11.0 的 1.0 M KCl 緩衝溶液為實驗條件。

4 5 6 7 8 9 10 11

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

500 mg/L lysozyme

pH

E

(% )

4-3-4 使用回收離子液體做萃取

離子液體的優勢之一即是可重複利用，減少化學廢棄物，本實驗亦利用使用過的離子液體重複萃取實驗，圖 4-15(a)是利用含有 3.8 mM 的[BMIM]3[CB3GA]的[BMIM][PF6]萃取 500 ml/L 溶菌酶，在 pH 4.0 條件下進行正向萃取，反向萃取則利用 1.0 M KCl 高濃度鹽類緩衝溶液在 pH 11.0 環境下進行，反向萃取完利用去離子水清洗萃取相，即進行下一次的正向萃取，如此重複使用離子液體八次，實驗結果顯示正向和反向萃取率皆無下降趨勢，蛋白質回收率維持在 90 % 左右。

而圖 4-15(b) 則是利用含有 3.8 mM 的 [BMIM]3[CB3GA] 的 [BMIM][PF6]在 pH 4.0 條件下正向萃取，反向萃取利用 1.0 M KCl 緩衝溶液在 pH 8.0 環境下進行，在此條件下反向萃取率約 93 %，有些許溶菌酶殘留於萃取相，因此反向萃取完利用 pH 11.0、1.0 M KCl 高濃度鹽類緩衝溶液清洗萃取相兩次，再利用去離子水清洗一次後，

進行下一次的正向萃取，從圖 4-15(b)可看出正向萃取率並無下降，

說明了含有 1.0 M KCl 的高濃度鹽類緩衝溶液在 pH 11.0 時可將離子液體層殘餘溶菌酶洗出。蛋白質回收率亦能維持於 85 %左右。由這兩個實驗得知，重複利用離子液體作正向萃取及反向萃取時，萃取率幾乎不會下降，可見離子液體中幾乎無殘留的蛋白質分子。

(a)

4-3-5 濃縮蛋白質溶菌酶

變性導致三度空間構形改變時，二級結構及三級結構皆會發生變化，

在CD光譜可直接觀測到。

因此將pH 4.0的溶菌酶水溶液和萃取過後的溶菌酶水溶液做CD 光譜的比較，由圖4-16可看出兩者之間幾乎相同，由此可證明溶菌酶在萃取過程當中，仍能保持其立體結構。

200 220 240 260 280

-10

4-4 萃取其他蛋白質

4-4-1 分別萃取蛋白質水溶液

為了探討[BMIM]3[CB3GA]與蛋白質之間作用力和選擇性，除了溶菌酶，本實驗也嘗試萃取其他蛋白質，包含牛血清蛋白、卵白蛋白、

色素細胞 c，其 HPLC 層析圖如圖 4-17。

圖 4- 17、蛋白質水溶液 HPLC 層析圖

從左至右為細胞色素 c、溶菌酶、牛血清蛋白、卵白蛋白

其中卵白蛋白和溶菌酶來源皆是雞蛋蛋白，而同屬雞蛋蛋白中的伴白蛋白(conalbumin)因價格昂貴，在此以分子量、親疏水性、等電點相近的牛血清蛋白取代，選用色素細胞 c 則是為了比較蛋白質等電點(pI)和萃取率之間的關係。

當利用含 3.8 mM [BMIM]₃[CB3GA]的萃取相，在 pH 7.0 條件下分別萃取這四種蛋白質水溶液時，發現溶菌酶有 81.2

±

2.4 %萃取率 (如表 4-2)，而色素細胞 c 亦有 6.2

±

1.5 %的萃取率，卵白蛋白和牛血清蛋白則無萃取效果。利用未加入[BMIM]₃[CB3GA]的萃取相作空白實驗，發現溶菌酶和細胞色素 c 萃取率分別為 4.4

±

1.1 %、6.1

±

0.6 %，

由此證實細胞色素 c 在未加入萃取劑時就有些許萃取率，並非 [BMIM]₃[CB3GA]造成其萃取效果，而在空白實驗有萃取效果的兩種蛋白質等電點都在 10.0 以上，推測是蛋白質在 pH 7.0 時帶正電，和萃取相[BMIM][PF₆]的陰離子有靜電吸引力。

為了進一步探討蛋白質和離子液體間的作用力，分別在 pH 4.0、

pH 11.0 條件下作萃取，可由表 4-2 看出在 pH 4.0 時四種蛋白質在空白實驗時即有萃取率，加入[BMIM]3[CB3GA]後，四種蛋白質萃取率皆在 80 %以上，在 pH 4.0 條件下此系統對於蛋白質的選擇性不佳。

而在 pH 11.0 時不論是空白實驗或加入萃取劑後，幾乎都無法萃取蛋白質，只有溶菌酶在添加[BMIM]3[CB3GA]後有 23.6

±

2.6 %的萃取

率，推測[BMIM]3[CB3GA]和溶菌酶之間除了靜電作用力，亦有其他

4-4-2 萃取混合蛋白質水溶液

和牛血清蛋白的含量提高許多，相對的進入離子液體層的比例也增

在文檔中應用親和性離子液體於溶菌酶之萃取 (頁 51-75)