應用親和性離子液體於溶菌酶之萃取
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(2) 應用親和性離子液體於溶菌酶之萃取 Extraction of Lysozyme Using a Dye-modified Ionic Liquid. 研究生 ：曾鈺評 指導教授：余 艇 博士. Student：Yu-ping Tzeng Advisor：Dr. Tiing Yu. 國立交通大學 應用化學研究所 碩 士 論 文. A Thesis Submitted to Institute of Applied Chemistry National Chiao Tung University in partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Science in Applied Chemistry June 2007 Hsinchu, Taiwan, Republic of China.. 中華民國九十六年六月. I.
(3) 應用親和性離子液體於溶菌酶之萃取. 學生: 曾鈺評. 指導教授: 余 艇. 國立交通大學應用化學所. 摘要 近年來，室溫離子液體(room temperature ionic liquids, ILs)已廣泛 應用於液相/液相萃取、有機合成及催化反應等研究領域。由於離子 液體提供較為安全的實驗環境且可回收再利用，能減低對環境的汙 染，取代傳統有機溶劑，因此被視為綠色溶劑。 在生物分子液相/液相萃取方面，已有研究發現離子液體可應用 於 萃 取 胺 基 酸 和 蛋 白 質 ， 但 是 萃 取 並 無 選 擇 性 。 Cibacron Blue F-3GA(CB3GA)是一對蛋白質有親和性的染料配體，本實驗利用 CB3GA 取代[BMIM][Cl]的陰離子，合成為具有親和性的離子液體 [BMIM]3[CB3GA] ， 將 其 作 為 萃 取 劑 ， 溶 於 疏 水 性 離 子 液 體 [BMIM][PF6]，從水溶液中萃取蛋白質溶菌酶(lysozyme)。 以含有3.8 mM [BMIM]3[CB3GA]之離子液體[BMIM][PF6]，對 500 mg/L 溶菌酶水溶液做萃取，在pH 4.0條件下，正向萃取率約為95 %。再以1.0M KCl，pH 8.0水溶液將溶菌酶萃取回水相，其反向萃取. II.
(4) 率約為93 %，溶菌酶回收率為87 %。隨著pH值降低，正向萃取率越 好，反向萃取則相反。此液相/液相萃取系統對於溶菌酶不論是正向 萃取或反向萃取，反應很快即能達到平衡。另外，我們也嘗試萃取蛋 白質混合溶液，發現對於溶菌酶有相當程度的選擇性。因此，此親和 性離子液體具備蛋白質純化和分離的潛力。. III.
(5) Extraction of Lysozyme Using a Dye-modified Ionic Liquid. Student : Yu-ping Tzeng. Advisor : Tiing Yu. Institute of Applied Chemistry National Chiao Tung University Abstract In recent years, room temperature ionic liquids (ILs) have been applied to broad research fields, such as liquid /liquid extractions, organic syntheses and catalytic reactions. ILs are recyclable and relatively safer than traditional volatile organic compounds (VOCs), so they are regarded as green solvents. It has been found that ionic liquids can be used in extracting amino acids and proteins from aqueous solutions, however, without selectivity. Cibacron Blue F-3GA (CB3GA) is an affinity dye which has been widely used for protein purification. In this study, IL [BMIM]3[CB3GA] synthesized as an extraction agent, was dissolved in a water-immiscible IL 1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate ([BMIM][PF6]) for extraction of lysozyme. The forward extraction efficiency for lysozyme was 95% using a [BMIM][PF6] solution containing 3.8 mM [BMIM]3[CB] while the aqueous phase was pH 4.0. Lysozyme was then extracted back to another aqueous solution of a buffer solution of pH 8.0 with 1.0M KCl.. The. back extraction efficiency was 93%, thus the lysozyme recovery was 87% for the complete process. As the pH of the aqueous solution decreased, the forward extraction efficiency increased, while the back extraction IV.
(6) efficiency decreased. Both the forward and back processes were found reaching equilibrium in very short time. In addition, a protein mixture was tested to examine the selectivity of this extraction system. The preliminary outcome showed good selectivity for lysozyme. This dye–modified IL may provide a potential for protein separation and purification.. V.
(7) 謝誌 回首兩年研究生涯的點點滴滴，科二前桃紅的櫻花、粉嫩的杜鵑 總讓人賞心悅目，在大廳沙發上睡覺的校狗、小七的親切態度和充斥 校園的好人，都將留在回憶裡，如今伴隨蟬鳴而來的鳳凰花，意味著 另一段新的旅程即將開始。感謝身旁的人、事、物讓我碩士班的生活 是如此豐富和精采。 本論文能順利完成，首先要感謝指導老師余艇教授，兩年來不斷 的指導研究方向，讓我受益良多。也感謝陳月枝教授和凌永健教授兩 位口試委員，百忙中抽空審閱論文、給予寶貴的意見，使本論文能夠 臻於完善。另外，也要感謝大學和研究所教導過我的老師，經由您們 給予豐富的專業知識，奠定了我在科學知識的基礎。 同實驗室的淑慧學姊，你真的很照顧我們這些小毛頭，祝福你早 日順利畢業。已經畢業的淑媺學姊，感謝你在實驗上的指導還陪我一 起熬夜作實驗、正在當兵的凱傑學長，真是越來越 man 了。在 433 一起奮鬥、吵鬧兩年的霆琪、士宗、阿暴、崧甫、培真(常客)，我們 終於畢業啦~學妹鈺君，很多事情都麻煩你了。許家的大秉、小高、 哈比人、阿川、振豪、芳銘、冷汗、阿嚕米等學長姊還有阿昆，感謝 你們的幫忙。我的好友們，玟菱、蛋黃、呆蛋、陳曉、sandy、柏村、 十字軍夥伴、慈青社夥伴等，因為你們的時常關心，在精神上給我很 大的鼓勵。 最重要的家人，真的好愛你們啊!老爸總是很愛護我、給予人生 的意見，老媽每天照顧我的胃、陪我聊天訴苦，老弟愛唱歌變魔術， 笑果十足。也要感謝每天溫馨接送，一起分享生活的鼠保。有你們的 陪伴，讓我知道自己很幸福。下一個人生階段，我會更努力的! VI.
(8) 總目錄 中文摘要....................................................................................................II 英文摘要.................................................................................................. IV 謝誌.......................................................................................................... VI 總目錄..................................................................................................... VII 表目錄...................................................................................................... XI 圖目錄..................................................................................................... XII 第一章 緒論.............................................................................................1 1-1 前言 ..................................................................................................1 1-2 研究動機 ..........................................................................................2 第二章. 研究背景與理論 ........................................................................4. 2-1 離子液體介紹 ..................................................................................4 2-1-1 離子液體的定義.......................................................................4 2-1-2 離子液體的發展.......................................................................6 2-1-3 離子液體的性質.......................................................................7 2-1-4 離子液體的應用.......................................................................9 2-2 蛋白質液相/液相萃取 ...................................................................11 2-2-1 蛋白質簡介 .............................................................................11 2-2-2 雙水相溶劑系統.....................................................................12 2-2-3 反微胞萃取法.........................................................................12 VII.
(9) 2-3 染料配體(dye-ligands)介紹...........................................................15 2-3-1 簡介 .........................................................................................15 2-3-2 染料配體與蛋白質作用力研究.............................................18 2-3-3 染料配體的應用......................................................................19 第三章 實驗部份 ..................................................................................22 3-1 試藥 ................................................................................................22 3-1-1 合成 [BMIM][PF6] 之藥品...................................................22 3-1-2 合成 [BMIM]3[CB3GA] 之藥品..........................................22 3-1-3 配製緩衝溶液之試劑.............................................................23 3-1-4 蛋白質分子 .............................................................................24 3-2 儀器 ................................................................................................25 3-3 實驗流程 ........................................................................................26 3-3-1 離子液體之合成.....................................................................26 3-3-1-1 合成[BMIM][PF6]............................................................26 3-3-1-2 合成 [BMIM]3[CB3GA] .................................................28 3-3-2 製備液相/液相萃取系統........................................................29 3-3-2-1 以親和性染料 CB3GA 為萃取劑...................................29 3-3-2-2 以親和性離子液體[BMIM]3[CB3GA]做為萃取劑 .......29 3-3-3 配製緩衝溶液.........................................................................30 3-3-4 萃取蛋白質溶菌酶.................................................................30 VIII.
(10) 3-3-4-1 以親和性染料 CB3GA 為萃取劑...................................30 3-3-4-2 以親和性離子液體[BMIM]3[CB3GA]做為萃取劑 .......31 3-3-4-2-1 改變[BMIM]3[CB3GA]濃度對萃取率影響 ............31 3-3-4-2-2 攪拌時間對萃取率影響 ...........................................31 3-3-4-2-3 改變 pH 值對萃取率影響 ........................................31 3-3-4-2-4 使用回收離子液體做萃取 .......................................32 3-3-4-2-5 濃縮蛋白質溶菌酶 ...................................................33 3-3-4-2-6 溶菌酶活性測試 .......................................................33 3-3-5 萃取其他蛋白質水溶液.........................................................34 3-3-5-1 萃取個別蛋白質水溶液 ..................................................34 3-3-5-2 萃取混合蛋白質水溶液 ..................................................34 3-3-6 蛋白質定量方式.....................................................................35 3-3-6-1 利用 HPLC 定量蛋白質水溶液......................................36 第四章 結果與討論 ..............................................................................37 4-1 離子液體之合成.............................................................................37 4-2 製備液相/液相萃取系統 ...............................................................44 4-3 萃取蛋白質溶菌酶.........................................................................46 4-3-1 改變[BMIM]3[CB3GA]濃度對萃取率影響..........................47 4-3-2 攪拌時間對萃取率影響.........................................................48 4-3-3 改變 pH 值對萃取率影響......................................................48 IX.
(11) 4-3-4 使用回收離子液體做萃取.....................................................52 4-3-5 濃縮蛋白質溶菌酶.................................................................54 4-3-6 溶菌酶活性測試.....................................................................54 4-4 萃取其他蛋白質 ............................................................................56 4-4-1 分別萃取蛋白質水溶液.........................................................56 4-4-2 萃取混合蛋白質水溶液.........................................................59 第五章 結論...........................................................................................61 參考文獻...................................................................................................62. X.
(12) 表目錄 第二章 表 2-1、 不 同 種 類 氯 化 物 之 熔 點 ........................................................4 表 2-2、 咪 唑 鹽 類 的 離 子 液 體 熔 點 ....................................................8 表 2- 3、染料分子在親和層析上的應用 ...............................................19 表 2- 4、加入金屬離子後的染料分子對不同蛋白質之純化 ...............20 第四章 表 4- 1、濃縮蛋白質溶菌酶 ...................................................................54 表 4-2、 蛋 白 質 水 溶 液 分 別 在 不 同 pH 值 的 萃 取 率 ....................58 表 4-3、 混 合 蛋 白 質 水 溶 液 之 萃 取 率 .............................................60. XI.
(13) 圖目錄 第二章 圖 2- 1、常見離子液體的陽離子 .............................................................5 圖 2- 2、離子液體合成步驟 .....................................................................5 圖 2- 3、常見離子液體陰離子與水之互溶性趨勢 .................................7 圖 2- 4、離子液體在 70℃作用力參數表示圖 ........................................9 圖 2- 6、界面活性劑、微胞及反微胞示意圖 .......................................13 圖 2- 7、 Cibacron Blue F-3GA (CB3GA)結構 .....................................16 圖 2- 8、 不 同 種 類 的 染 料 配 體 結 構 示 意 圖 ...................................17 第三章 圖 3- 1、[BMIM][PF6]合成示意圖.........................................................27 圖 3- 2、 HPLC 儀 器 裝 置 圖 ...............................................................36 第四章 圖 4- 1、 [BMIM][PF 6 ]之 NMR 圖 譜 .................................................39 圖 4- 2、[BMIM][Cl]之 NMR 圖譜........................................................40 圖 4- 3、 [BMIM] 3 [CB3GA]之 NMR 圖 譜 .......................................41 圖 4- 4、[BMIM]3[CB3GA]之 Mass 圖譜.............................................42 圖 4- 5、 [BMIM] 3 [CB3GA]之 DSC 圖 譜 .........................................43 圖 4- 6、 [BMIM] 3 [CB3GA]之 UV-vis 圖 譜 .....................................43. XII.
(14) 圖 4- 7、萃 取 劑 在 [BMIM][PF6]中溶 解 狀 況 .....................................44 圖 4- 8、CB3GA 轉移到[BMIM][PF6]中之 UV-vis 圖 .........................45 圖 4- 9、 蛋 白 質 萃 取 過 程 示 意 圖 ......................................................46 圖 4- 10、 不 同 萃 取 劑 濃 度 對 正 向 萃 取 率 的 影 響 ..........................47 圖 4- 11、 反 應 時 間 對 正 向 萃 取 率 的 影 響 .......................................48 圖 4- 12、 pH 值 對 正 向 萃 取 率 的 影 響 ..............................................49 圖 4- 13、 溶 菌 酶 在 不 同 pH 值 表 面 所 帶 電 荷 數. 77. .......................50. 圖 4- 14、 pH 值 對 反 向 萃 取 率 的 影 響 ..............................................51 圖 4- 15、 重 複 使 用 離 子 液 體 萃 取 次 數 和 萃 取 率 的 關 係 圖 ........53 圖 4- 16、 溶 菌 酶 水 溶 液 CD 光 譜 圖 ................................................55 圖 4- 17、 蛋 白 質 水 溶 液 HPLC 層 析 圖 ...........................................56. XIII.
(15) 第一章. 緒論. 1-1 前言. 隨著環保意識抬頭，綠色化學永續經營的概念逐漸被化學界重 視。綠色化學是以減低或消除化學物質對環境的衝擊為目標，發展較 安全的化學品或化學反應過程來取代危險物質的使用。工業上常利用 液相／液相萃取分離化合物，一般是使用有機溶劑和水溶液或不互溶 的兩種溶劑形成兩相，藉由欲分離的化合物在兩相之間的分佈不同， 達到分離的目的。大部分的萃取過程需使用大量有毒、高揮發性、易 燃的有機溶劑，在操作安全性上有許多考量及限制，大量的有機廢棄 物對於環境亦會造成污染，使用過後需要依環保法規來處理這些化學 廢棄物。因此，尋找降低對環境負擔的分離溶劑是迫切需要的課題。 室溫離子液體(room temperature ion liquids-RTILs)是一能取代傳 統有機溶劑的物質，為陰陽離子組成的有機熔融鹽類，在室溫或接近 室溫的溫度下為液體。可藉由改變其陽離子和陰離子的種類，控制它 們的親水性、疏水性和黏度等性質，因其具有無毒、低熔點、低揮發 性、不可燃性、可回收1使用等特質，與有機溶劑相較之下，可降低 實驗上的操作風險，因此離子液體被認為是一種新的「綠色溶劑」2。 近年來有關離子液體的研究和應用文獻急速增加，在化學方面已將之 1.
(16) 應用在分離科學3、有機合成4,5,6、催化反應4,5,7以及電化學8等領域。 隨著離子液體的研究發展，其應用將更深入、更廣泛，使其在綠色化 學的重要性相對增加。 蛋白質在生物體內扮演重要的角色，溶菌酶(lysozyme)是一種可 溶解細菌細胞壁的酵素，廣泛存於生物中，包括動物的淚水、口水及 人乳、雞蛋蛋白等。其中以雞蛋蛋白中的溶菌酶與人體內的溶菌酶具 有相似的性質，也是自然界溶菌酶含量最多的。液相／液相萃取應用 在純化蛋白質方面，已發展出的有雙水相系統9以及利用反微胞法10,11 萃取蛋白質。. 1-2 研究動機. 離子液體應用在蛋白質的液相/液相萃取研究中，已發現在帶有 羥基(hydroxyl-group)的有機陽離子、疏水性陰離子的離子液體中添加 皇冠醚類(crown ethers)，可將蛋白質細胞色素c (cytochrome c)從水溶 液中萃取到離子液體層12，隨著離子液體層中的含水量增加，蛋白質 萃 取 率 也 明 顯 增 加 。 本 實 驗 室 也 曾 利 用 離 子 液 體 1-butyl-3-methylimidazolium hexafluorophosphate ([BMIM][PF6])當作 萃取劑13，[BMIM][PF6]加入乙酸乙酯(ethyl acetate)之後和水可形成兩 相系統，利用調控pH值，改變蛋白質表面所帶電荷，藉由離子液體 的陰離子和蛋白質間的靜電吸引力達到萃取目的。但此實驗必須在強 2.
(17) 酸條件之下才有好的萃取效果，對蛋白質活性可能會造成影響。 由於親和性染料Cibacron Blue F-3GA (CB3GA)和蛋白質溶菌酶 (lysozyme)之間具有親和作用力14，能提高在萃取蛋白質上的選擇性。 因此本實驗將CB3GA合成為離子液體[BMIM]3[CB3GA]當作萃取 劑，將[BMIM]3[CB3GA]溶於離子液體[BMIM][PF6]中，和蛋白質水 溶液形成兩相，利用液相/液相萃取將蛋白質萃取到離子液體相中， 因所使用的萃取相為離子液體，可回收重複萃取，取代傳統有機溶 劑，達到安全、環保之目的。. 3.
(18) 第二章. 研究背景與理論. 2-1 離子液體介紹. 2-1-1 離子液體的定義 離子液體是由陽離子和陰離子組成的熔融鹽類，和無機鹽類(如 氯化鈉)所不同的是離子液體的陽離子為有機離子，熔點和無機鹽類 差異非常大15，如表2-15，一般將熔點低於100℃的融鹽稱為離子液體 (room temperature ion liquids, ILs)。. 表 2-1、 不 同 種 類 氯 化 物 之 熔 點. 5. 離子液體可經由特定陽離子和陰離子，透過不同組合方式可高達 1018種，常見陽離子如圖2-15，這些陽離子除了本身碳鏈長短可任意 改變，例如陽離子1-alkyl-3-methylimidazolium ([CnMIM]+, n為線性烷 基碳的數目)，還可和不同的有機或無機的陰離子形成種類廣泛的離 子液體，因此離子液體又被稱作是「可設計合成的溶劑」(designer 4.
(19) solvent)。一般常見的離子液體陰離子有hexafluorophosphate(PF6-)、 tetrafluoroborate(BF4-)、bis[(trifloromethyl)sulfonyl]amide [(CF3SO2)2N]-、ethanoate(CH3CO2-)、trifluoroethanoate(CF3CO2-)、 trifluoromethylsulfonate(CF3SO3-)、及halide(Br-,Cl-,I-)。不同形式的離 子液體在物性和化性上有相當大的差異，其基本的合成實驗流程如圖 2-25。. 圖 2- 1、常見離子液體的陽離子 5. 圖 2- 2、離子液體合成步驟 5 5.
(20) 2-1-2 離子液體的發展 數十年來離子液體的相關文獻逐年快速成長，其發展最早是在 1914 年，ethylammonium nitrate ([EtNH3]NO3)低溫時以離子態液體呈 現而被報導出來，接著在 1951 年時 Hurley 發展出有機鋁離子液體 N-ethylpyridinium bromide- aluminium chloride ([EtPy]Br-AlCl3)，並拿 來作為電鍍鋁的浸漬液 16。隨後一直到 1970 年代 Osteryoung 和 Wilkes 才成功製備出一系列氯化鋁陰離子的融鹽(chloroaluminate melts)17， 從此離子液體被大量的應用在電化學。1992 年，Wilkes 研究團隊將 AgBF4 加入[EMIM][I]反應後，發展出離子液體[EMIM][BF4]18，這種 離子液體在水及空氣中都相當安定，使得咪唑(imidazolium)類的陽離 子所組成的離子液體在應用方面引起重視 19，往後所發展的離子液體 皆以此種類為主。 近年來，一些具有特殊功能性的離子液體也陸續被合成出來，例 如:含DNA離子液體 20 以及利用胺基酸作為陰離子的離子液體等等 21. 。另外，日本東京大學賓口宏夫教授在實驗中發現帶有金屬磁性的. 離子液體22，他們推測此種物質為非液體亦非固體的狀態，若進一步 得到證實，此種新物質狀態可能推翻一般所認為的物質三態。. 6.
(21) 2-1-3 離子液體的性質 離子液體具有低熔點、極低蒸氣壓、不可燃性、寬的電化學窗口 (potential window)、良好的導電與導熱性、選擇性溶解力和可設計性 等特殊性質，使得離子液體應用範圍非常廣泛。 離子液體之特性會隨著陽離子和陰離子形式而有所不同，例如在 親水性方面，[BMIM][Cl]這種離子液體和水是互溶的，若將陰離子置 換成[PF6]-，形成的離子液體[BMIM][PF6]則和水不互溶。圖2-3表示 常見離子液體之陰離子對其在水中溶解度的影響23，而研究也發現陽 離子上的烷基碳鏈越長會造成離子液體疏水性越強24,25。. 圖 2- 3、常見離子液體陰離子與水之互溶性趨勢 15. 由於陽離子和陰離子之間的作用力，使得離子液體黏度比一般有 機溶劑大很多，其黏度大小受到分子之間氫鍵和凡得瓦耳力強弱的影 響，作用力越強則黏度越大，一般來說，陽離子上碳鏈越長則凡得瓦 耳力越大，造成黏度越大。在陽離子相同情況下，不 同 陰 離 子 的 離 7.
(22) 子 液 體 其 黏 度 順 序 如 下 Cl - >PF 6 - >BF 4 - >NO 3 - >(CF 3 SO 3 ) 2 N -24。離 子 液 體 的 密 度 範 圍 則 在 1.0 到 1.6 g/cm 3 之 間 ， 陽離子團越大， 密度相對減小 5，而溫 度 越 高 密 度 越 低 。 離子液體的熔點在應用上來說是重要的參考指標，其熔點決定於 陽離子的對稱性，對稱性差會影響晶體的排列，造成熔點下降，分子 間若有氫鍵作用力則會使熔點增高。另外，陰離子的種類不同也會影 響熔點。常 用 咪 唑 鹽 類 (imidazolium)的 離 子 液 體 熔 點，如 表 2-2 7。. 表 2-2、 咪 唑 鹽 類 的 離 子 液 體 熔 點. 8. 7.
(23) 2-1-4 離子液體的應用 近幾年來離子液體的應用相當廣泛，已有回顧文獻針對分析化學 方面做介紹 23,26,27，應用範圍包括液相/液相萃取、氣相層析、質譜儀 雷 射 脫 附 基 質 及 電 化 學 等 等 。 Abraham 提 出 的 “ 溶 劑 化 參 數 模 型”(solvation parameter model)28，被用來表示離子液體和溶質之間的 作用力，根據參數不同，離子液體所應用的領域也有所差異，如圖 2-4。. 圖 2- 4、離子液體在 70℃作用力參數表示圖 28 a:氫鍵鹼度(hydrogen-bond basicity ), b:氫鍵酸度(hydrogen-bond acidity), s:偶極性(dipolarity) or極化性(polarizability), r:離子液體和溶 質π電子和非鍵結電子之間作用的能力, l:分散力(dispersion forces)。 9.
(24) 因離子液體可調整成親水性或疏水性，在液相/液相萃取佔有很 大優勢。在離子液體中加入冠醚類(crown ether)分子作為萃取劑，萃 取硝酸鍶 29、重金屬離子 30、胺基酸 31 以及蛋白質 12,32;也有研究直接 在陽離子上修飾上硫醚、硫脲等官能基 33，此方法不須加入額外萃取 劑即可萃取 Hg2+、Cd2+，這樣的離子液體又稱為 task-specific ILs。用 離子液體當介質，可將奈米金和奈米棒從水相轉移到離子液體相 34， 藉由調整 pH 值，某些染料也有相轉移的現象. 35,36. 。也有利用離子液. 體及二氧化碳萃取有毒的多環芳香族後，再回收離子液體的環保分離 方法 37。 在氣相層析管柱中，離子液體因高黏度、無揮發性且在高溫穩 定，使其可填充當作靜相，對化合物亦有多種作用力 38，若為極性高 離子液體可用來分離極性樣品，反之，則可用來分離非極性樣品 39。 在電化學領域，電位窗(potential window)主要決定於溶劑本身是否容 易 被 還 原 或 氧 化 ， 離 子 液 體 和 水 比 有 較 寬 廣 的 電 位 窗 (potential window)及導電度，例如[C3H7(CH3)3N][(CF3SO2)2N]電位窗可達 5.7 V8。離子液體也可以作為質譜儀雷射脫附基質，Armstrong 等人曾用 蛋白質、胜肽及 PEG-2000 作為分析物證實其可能性 40。也曾被用來 偵測 DNA oligomer41。離子液體的應用已是綠色化學的一部分，各領 域也陸續投入離子液體的研究，其未來發展性指日可待。. 10.
(25) 2-2 蛋白質液相/液相萃取 一 般 蛋 白 質 液 相 / 液 相 萃 取 有 兩 個 步 驟 ， 正 向 萃 取 (forward extraction)與反向萃取(backward extraction)。正向萃取是將蛋白質從水 相萃取到有機相或另一水相中;移除原來蛋白質所在的水相後，添加 新的水溶液，將蛋白質再萃回到此新的水相稱為反向萃取。 2-2-1 蛋白質簡介 蛋白質是由超過50個胺基酸所形成的多胜肽鏈(polypeptide chain)，經雙硫鍵與非共價鍵的作用力結合，形成立體結構，在生物 體內扮演著非常重要的角色。本論文所使用的溶菌酶(lysozyme)是一 種可溶解細菌細胞壁的酵素，在哺乳類動物的血液、眼淚和乳汁中皆 存在，亦分佈於鳥類和植物當中，其中以鳥類的卵中含量最多。雞蛋 中的溶菌酶含量約佔3~4 %，且和人體內溶菌酶性質相似，不僅有抗 菌性亦有抗病毒之作用因此較受重視，亦可用來替代化學保存劑做為 食品中的天然抗菌劑。本實驗使用的即是雞蛋白溶菌酶(hen-egg white lysozyme)，由129個胺基酸分子所構成，分子量約為14.4 kDa，等電 點 (isoelectric point, pI) 為 10.7 ， 有 四 條 雙 硫 鍵 位 置 分 別 排 列 在 Cys6-Cys127、Cys30-Cys115、Cys64-Cys80、Cys76-Cys94。 隨著生物科技進步，蛋白質的分離和純化日益受到重視。傳統上 在分離蛋白質常用過濾、鹽析、凝膠電泳或各種層析(chromatography) 11.
(26) 等技術進行樣品分離，但這些方法只能處理少量樣品。之後發展出的 雙水相溶劑系統(aqueous two phase solvent system ) 及反微胞萃取法 (reversed micelle extraction)，可用來萃取大量的生物樣品。. 2-2-2 雙水相溶劑系統 雙水相溶劑系統是瑞典的 Albertson 於 1958 年所提出 42，因所需 成本低、操作簡單而被人們重視。所謂的雙水相溶劑系統是將兩種物 化 性 質 相 異 之 高 分 子 聚 合 物 (polymer) 或 一 種 高 分 子 與 一 種 鹽 類 (salt)，加入水溶液中，這些不同性質的大分子分別與水分子產生交互 作用力而成兩相。藉由欲分離物化合物性質差異，與兩水相分子間有 不同作用力而產生分配(partition)行為達到純化分離的效果。化合物分 子在兩相的分配情形受許多因素所影響，主要包括高分子聚合物種類 43. 、緩衝液濃度. 44,45. 、溫度. 44. 及溶液酸鹼值. 45. 等。由於分離步驟少、. 操作條件溫和、生物分子活性保存佳，且不需使用有機溶劑，目前雙 水相溶劑系統已被應用在蛋白質、核酸等生物分子的萃取分離及純化 上 43。也曾在逆流層析儀(countercurrent chromatography) 中使用，進 行蛋白質的製備分離 46,47。. 2-2-3 反微胞萃取法 微包(micelles)由界面活性劑在水溶液中的濃度大於臨界微胞濃 度(critical micelle concentration,CMC)聚集而成，疏水基團朝內，親水 12.
(27) 基團朝外，形成一個團狀的結構，如下圖 2-5。相反地，反微胞(reverse micelles)則是界面活性劑溶於有機溶劑，疏水基向外，親水基團朝內 可包圍水分子，形成水核(water pool)，一般反微胞萃取就是利用此水 核將水溶液中極性大的分子轉移到有機相中。 反微胞系統萃取的機制包含靜電作用力(electrostatic interactions) 和疏水作用力(hydrophobic interactions)。若使用離子型的界面活性 劑，反微胞則會帶電荷，若水溶液中的分子帶有相反電荷就會被吸引 到有機相;相對的若水溶液中的分子帶有和界面活性劑相同電荷，則 會產生排斥而回到水相 48。對非離子型的界面活性劑來說，靜電作用 力影響便不大，一般認為是水溶性分子疏水基部分和界面活性劑上的 疏水基之間產生凡得瓦耳作用力，而達到萃取目的 49,50。. 圖 2- 5、界面活性劑、微胞及反微胞示意圖 13.
(28) 反微胞法萃取蛋白質的效率會受到系統狀態而有所影響，例如界 面活性劑的選擇、溶液 pH 值、離子種類、離子強度及溫度等。離子 型的界面活性劑與蛋白質之間有強的靜電吸引力，因此 pH 值對萃取 效 果 來 說 是 重 要 因 素 ， 影 響 著 蛋 白 質 表 面 的 電 荷 分 佈 (charge distribution over the protein surface)，當 pH 值大於蛋白質的等電點 (pH>pI)，蛋白質的表面淨電荷為負，使用陽離子界面活性劑時，就 需要使蛋白質帶負 51;相反地，使用陰離子界面活性劑時，水溶液 pH 就需要小於蛋白質等電點(pH<pI)52。但在 pH 調控範圍上有限制性， 因為蛋白質處於過酸或過鹼條件下，會造成其變性或喪失活性，使得 萃取效果不佳 53。而非離子界面活性因靜電作用力弱，較不受 pH 值 影響，對蛋白質傷害也比較小 54，因此適合用在生物分子上。 水溶液中離子的濃度和種類亦是影響反微胞萃取蛋白質的因 素，若水溶液中的鹽類濃度小於某值，便無法構成反微胞，水相和有 機相會產生一穩定的乳化態(microemulsion)而無法分層。過去有文獻 發表 55，水溶液中的離子濃度小於 0.1 M 時，就會形成乳化態，不易 恢復澄清，對於蛋白質萃取無法達到好的效率，所以一般反微胞系統 需加入鹽類來造成穩定的分層。 當水溶液中離子濃度增加時，蛋白質表面和界面活性劑親水基之 間 的 靜 電 吸 引 力 會 受 到 干 擾 ， 稱 之 為 遮 蔽 效 應 (Debye screening effect)。不同離子種類所造成的影響亦有所差異，離子所帶電荷數越 14.
(29) 多，遮蔽效應越大，若電荷數相同，則隨著離子半徑增加，遮蔽效應 越明顯。已有研究指出離子種類對蛋白質萃取率的影響為 K+ < Rb+ < Cs+ < Na+ < Li+，當溶液中加入鉀離子遮蔽效應大，萃取效果最差 56。 且鹽類濃度增高時，因陽離子型界面活性劑親水基之間的排斥力下 降，會造成反微胞的水核變小，相對的蛋白質溶解力就下降。因此， 在反微胞系統中，鹽類濃度過高或過低都不利於蛋白質的萃取， 必須控制在一定範圍內，方能有良好的萃取效果。. 2-3 染料配體(dye-ligands)介紹. 2-3-1 簡介 在純化蛋白質的方法中親和作用力是常被利用的一種方式，所謂 的親和作用力是指生物分子和其配體(ligand)之間形成專一性結合， 並且為可逆反應，例如抗體和抗原、酵素和其受質(substrate)、酶和 酶的抑制劑等等。親和層析(affinity chromatography)就是根據這種親 和力發展出來的純化方法，原理是將配體連接到層析管柱的填充材質 上，再進行蛋白質的吸附與脫附達到分離純化作用57。 上面所提到的天然生物配體需經過複雜純化步驟、不穩定、價格 昂貴且不易固定於親和管柱上，染料配體則可以克服這些缺點，其合 成容易，成本也較低，尤其是其活性部位可輕易和管柱填充物反應而 15.
(30) 固定於管柱上，因此常用來取代天然配體純化生物分子。這種染料原 來是用在紡織業上的染色，和棉質布料間可形成共價鍵，因意外發現 blue dextran和特定的激酶(kinase)之間會產生作用力結合58。在1972 年，Roschlau和Hess首次將Cibacron Blue這種藍色染料利用共價鍵固 定到層析管柱中的Sephadex G-200上，純化yeast pyruvate kinase59。自 此之後這樣的概念便廣泛的使用在蛋白質純化上。 染料配體基本結構包含三個部分:1.發光團(chromophore)，通常是 anthroquinone、azo或phthalocyanine等。2.活性基團(reactive group)， 通常以trichloro-s-triazine為基礎，上面所帶的氯可和管柱上帶有羥基 (hydroxyl-group, -OH)的填充物反應形成共價鍵結。3.架橋(bridge)， 用來連接上述兩個部分。常見具活性的染料配體種類如下頁圖2-760。 本實驗所選擇的是已被廣泛使用的Cibacron Blue F-3GA(CB3GA)，又 稱為Procion Blue H-B，其結構如圖2-6。. 圖 2- 6、 Cibacron Blue F-3GA (CB3GA)結 構. 16.
(31) 圖 2- 7、 不 同 種 類 的 染 料 配 體 結 構 示 意 圖. 60. (a) cyanuric chloride, (b)!Procion MX series, (c) Cibacron!and Procion H, (d)!Procion H-E, (e) Monofluorotriazinyl, Cibacron, Ciba-Geigy (f) Trichloropyrimidnyl, (g) Difluorochloro-pyrimidnyl, (h) Sulfatoethyl sulfone.. 17.
(32) 2-3-2 染料配體與蛋白質作用力研究 關於染料配體和蛋白質之間作用力的研究探討，在1979年以x-ray 研究CB3GA和horse liver alcohol dehydrogenase複合物的晶體61，接著 陸續解出CB3GA-NAD(P)H:quinone reductase S-transferase. 63. 62. 和CB3GA-glutathione. 的 複 合 物 結 構 。 其 中 CB3GA-NAD(P)H:quinone. reductase複合物指出CB3GA與quinone reductase之間作用力和NADP+ 上 的 AMP 與 此 酵 素 作 用 非 常 類 似 。 另 外 在 CB3GA-glutathione S-transferase複合物中則發現CB3GA的發光團和胺基酸之間存有凡得 瓦耳力和氫鍵作用力。 近 年 來 ， 基 質 輔 助 雷 射 脫 附 質 譜 法 (matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry, MALDI MS)也應用在染料-蛋 白質作用力的研究 64,65 。結果顯示CB3GA上的磺酸基(sulfonic acid group,-SO3-)偏好和精胺酸(arginine)這種胺基酸作用，較不易和其他 氨基酸作用。精胺酸是所有胺基酸中pKa值最高，而染料上的磺酸基 pKa值低於零，在pH1~14都帶負電。由於大部分的染料配體上都帶有 磺酸基，因此推測精氨酸-磺酸基(arginine-sulfonate)這種特定的靜電 作用力能促進染料和蛋白質的結合。靜電吸引力也在此被歸為染料蛋白質作用力主要因素，蛋白質疏水性和氫鍵作用力則為次要因素。 綜合來說，染料和蛋白質之間的作用力包括:染料分子結構類似 18.
(33) 生物配體，便可和特定蛋白質的活性部位專一性結合;但某些條件下 幾乎所有的蛋白質都會被吸附到染料配體上，此時蛋白質和染料之間 便是利用靜電吸引力、疏水性、氫鍵作用力以及電荷轉移作結合。. 2-3-3 染料配體的應用 染料配體最早被應用在親和層析 66,67，不同的染料分子可用來純 化不同的蛋白質，如表 2-3 所示 68。. 表 2- 3、染料分子在親和層析上的應用 68 Enzyme. Dye. Glycerol kinase. Procion Blue MX-3G. Glucose kinase. Procion Brown H-3R. Glycerol dehydrogenase. Procion Red HE-3B. 3-Hydroxybutyrate dehydrogenase. Procion Red H-3B. Malate dehydrogenase. Procion Blue MX-4GD. Tryptophanyl tRNA synthetase. Procion Brown MX-5BR. Human serum albumin. Procion Blue HB. Carboxypetidase G2. Procion Red H-8BN. 也有研究利用金屬離子螯合在染料配體上幫助吸附蛋白質，利用 蛋白質表面給予電子能力較強的胺基酸殘基，如 histidine 上 的. 19.
(34) imidazole group、cysteine 上的 thiol group 以及 tryptophan 上的 indoyl group，和金屬離子之間有較強的作用力，加入金屬離子可增加在蛋 白質的選擇性，相關研究如表 2-460。. 表 2- 4、金屬離子後對不同蛋白質之純化 60. Carboxypetidase G2. Promoting metal ion Zn2+. Procion Red H-8BN. Alkaline phosphatase. Zn2+. Procion Yellow H-A. Hexokinase. Mg2+. Procion Green H-4G. Tyrosinase dehydrogenase. Cu2+. Procion Blue HE-RD. Ovalbumin. Al3+. Cibacron Blue F3GA. Catalase. Fe3+. Cibacron Blue F3GA. Fe3+. Congo Red. Cu2+. Congo Red. Zn2+. Cibacron Blue F3GA. Glucose oxidase. Fe3+. Cibacron Blue F3GA. Lysozyme. Cu2+. Cibacron Blue F3GA. Protein. Albumin. Dye. CB3GA已用來純化多種類的蛋白質，包含激酶(kinase)、脫氫酶 (dehydrogenase)、血清蛋白等等，除了在親和性層析上的應用69，近 年來也被用於固定在磁性粒子70及親和性薄膜71上，以吸附蛋白質溶 菌酶。也有將CB3GA合成在熱敏高分子(thermo-sensitive polymer)的 支鏈上72，利用熱敏高分子超過低溫臨界溶液溫度(lower critical solution temperature,LCST)時產生沉澱，從雞蛋蛋白中萃取溶菌酶。 20.
(35) 在液相/液相萃取方面，有研究藉由帶有羥基(-OH)的界面活性劑和 CB3GA反應，形成具有親和力的反微胞，應用在反微胞萃取法分離 蛋白質73。染料配體價格便宜且穩定，因此已許多研究將其固定在不 同材料純化不同蛋白質。. 21.
(36) 第三章. 實驗部份. 3-1 試藥. 3-1-1 合成 [BMIM][PF6] 之藥品 (1) 1-chlorobutane, C4H9Cl, 99 %, GR grade (Janssen Chimica, Geel, Belgium) (2) 1-methylimidazole, C4H6N2, 99 %, GR grade (Acros, Geel, Belgium) (3) Potassium hexafluorophosphate, KPF6, 99 %, GR grade (Showa, Tokyo, Japan) (4) Magnesium sulfate anhydrous, MgSO4, 99 %, GR grade (Showa, Tokyo, Japan) (5) Ethyl Acetate, CH3COOC2H5, HPLC grade (Mallinckrodt Baker, Phillipsburg, NJ, USA). 3-1-2 合成 [BMIM]3[CB3GA] 之藥品 (1) Cibacron Blue F-3GA , C29H17ClN7Na3O11S3, GR grade (Sigma, St. Louis, MO, USA) (2) Silver nitrate, AgNO3, GR grade, 99.8 % (Showa, Tokyo, Japan) (3) 1-butyl-3-methyl imidazolium chloride, [BMIM][Cl], GR grade 22.
(37) (Acros, Geel, Belgium) (4) Acetone Nitrile, HPLC grade, 99.9 % (TEDIA, Fairfield, OH, USA) (5) Menthol, CH3OH, HPLC grade, 99.9 % (TEDIA, Fairfield, OH, USA) (6) Acetone, CH3COCH3, HPLC grade, 99.9 % (TEDIA, Fairfield, OH, USA). 3-1-3 配製緩衝溶液之試劑 (1) Hydrochloric Acid, HCl, GR grade (Showa, Tokyo, Japan) (2) Potassium chloride, KCl, GR grade (Riedel-de Haën, Seelze, Germany) (3) Sodium chloride, NaCl, GR grade (Riedel-de Haën, Seelze, Germany) (4) Glycine, C2H5NO2, GR grade (Riedel-de Haën, Seelze, Germany) (5) Acetic Acid, CH3COOH, HPLC grade (Mallinckrodt Baker, Phillipsburg, NJ, USA) (6) Sodium acetate, CH3COONa, 98.5 %, GR grade (Showa, Tokyo, Japan) (7) Sodium dihydrogenphosphate anhydrous, NaH2PO4, 98.0 %, GR grade (Showa, Tokyo, Japan) (8) Potassium dihydrogenphosphate, KH2PO4, 99%, GR grade (Showa, Tokyo, Japan) 23.
(38) (9) Tris(hydroxymethyl) aminomethane, (HOCH2)3CNH2, ACS grade (TEDIA, Fairfield, OH, USA) (10) Sodium hydrogen carbonate, NaHCO3, 99.5 %, GR grade (Showa, Tokyo, Japan) (11) Sodium hydroxide, NaOH, 96 %, GR grade (Showa, Tokyo, Japan) (12) D.I.W.去離子水，經由 Millipore (Bedford MA ,USA)的 Milli-Q plus 處理. 3-1-4 蛋白質分子 (1) Cytochrome c (細胞色素 c) from Horse Heart，M.W. : 12361, 97%， pI : 10.5，(Sigma, St. Louis, MO, USA) (2) Lysozyme (溶菌酶) from chicken egg white，M.W. : 14307，97%， pI : 10.7，(Sigma, St. Louis, MO, USA) (3) Ovalbumin (卵白蛋白) from chicken egg white，M.W. : 44287， 98%，pI : 4.5，(Sigma, St. Louis, MO, USA) (4) Bovine serum albumin (牛血清蛋白)，簡稱 BSA，M.W. : 63000， 98%，pI : 4.6，(Sigma, St. Louis, MO, USA). 24.
(39) 3-2 儀器 (1)核磁共振儀(Nuclear Magnetic Resonance, NMR): DRX-300, (Bruker, Germany); Uniytinova-500, (Varian, USA) (2)紫外光-可見光光譜儀(UV-Visible Spectrophotometer): Hewlett Packard 8453, (Waldronn, Germany) (3)高效能液相層析管柱(reversed-phase HPLC column): Vercopak Inertsil 7 octadecyl silica-3 (ODS-3), (建宏層析，台北) 管柱尺寸為 4.6 × 250 mm，孔徑大小為 10 μm，用於蛋白質的分析 與定量 74。 (4)梯度幫浦(Gradient Pump): Degasys DG 2410, (Lab Alliance, USA) 結合 Series Ⅲ pump，最多可做四種動相組成的梯度混合。 (5)離心機(Centrifuges): EBA20, (Hettich, Germany) 最大轉速 6000 rpm，最大離心力為 3421 g (轉速單位 g=11.18 × R × rpm2 × 10-6 , R:旋轉軸半徑(單位 cm))。 (6)質譜儀(Mass Spectroscopy): Quattro Micro, (Waters,USA) (7)熱重量分析儀(Thermogravimetric analysis, TGA): 使用 Du Pont Instrument TGA2950 儀器。 (8)微差掃描卡計(Differential Scanning Calorimetry, DSC): 使用 SEIKO EXSTAR 6000DSC 及 Computer/Thermal Analyzer。測 量方式為:取 5~10 mg 的樣品裝入鋁製的 cell 中，在通入氮氣為 100 ml/min 下，做兩階段式 DSC 測試: 1. 降溫速率 10℃/min，範圍 30℃~-70℃ 2. 升溫速率 10℃/min，範圍-70℃~ 30℃ 重複此步驟三次，可經由圖譜判斷離子液體的熔點。 25.
(40) (9)圓形二相色性分光光譜儀 Circular Dichroism (CD) Spectrometer, Aviv Model 62ADS ( Lakewood, N.J.). 3-3 實驗流程 3-3-1 離子液體之合成 本實驗使用的離子液體包含[BMIM][PF6]、[BMIM]3[CB3GA]。 其中[BMIM][PF6]為疏水性離子液體，容易和水溶液分層，因此實驗 中將其作為萃取相，其合成步驟參考相關文獻. 75. 。另外，. [BMIM]3[CB3GA]則是將對蛋白質具有親和性的染料 CB3GA，和離 子液體的陽離子[BMIM]+結合，使其帶有離子液體特性，並同時兼具 親和性的性質，在本實驗中作為萃取蛋白質的萃取劑。以下為離子液 體的合成步驟。. 3-3-1-1 合成[BMIM][PF6] 1.將 0.6 mole (62.7 ml) 1-chlorobutane 和 0.6 mole (47.8 ml) 1-methylimidazole 加入至 250 ml 圓底瓶中，並架設迴流裝置，加熱 至 80℃後，持續攪拌約 48 hr，可得到一金黃色黏稠液體 1-butyl-3-methylimidazolium chloride ([BMIM][Cl])。 2.將此黏稠液體到入分液漏斗中，加入 50 ml 的乙酸乙酯洗去未反應 物，並取出下層液於圓底瓶中。 26.
(41) 3.下層液加熱至 90℃攪拌一天，去除乙酸乙酯。 4.取 0.6 mole KPF6，加入 300 ml 去離子水，室溫下攪拌至溶解。 5.將[BMIM][Cl]加入 KPF6 水溶液中，攪拌約 1 hr。 6.將溶液倒入分液漏斗中，取出水層，再加入少許去離子水，除去水 層，重覆此步驟數次直到水層成中性。 7.取出下層離子液體，加入硫酸鎂除去離子液體層中的水，經重力過 濾後，即可得到 1-butyl-3-methyl imidazolium hexafluorophosphate ([BMIM][PF6])。 8.合成示意圖如圖 3-1，最後將產物測 1H-NMR，以鑑定之。. 圖 3- 1、[BMIM][PF6]合成示意圖 27.
(42) 3-3-1-2 合成 [BMIM]3[CB3GA] 1.取 2x10-3 mole (1.68 g) Cibacron Blue F3GA (CB3GA)，溶於 50 ml 去離子水，再加入 2x10-2 mole (3.39 g) AgNO3，室溫下攪拌 24 hr。 2.將所得溶液以 6000 rpm 轉速離心 5 min，將水相去除後，以 10 ml 冰水清洗沉澱物三次。 3.將沉澱物置於真空烘箱，40℃條件下，烘 12 hr，可得到藍色固體 Ag3CB3GA。 4.將步驟 3.所得的 Ag3CB3GA，加入 50 ml 乙晴溶解之，再加入三倍 莫耳數的[BMIM][Cl]，40℃攪拌 72 hr。 5.將所得溶液以 6000 rpm 轉速離心 5 min，去除沉澱物 AgCl，再以旋 轉濃縮機去除乙晴。 6.接著以丙酮溶解粗產物，以 6000 rpm 轉速離心 5 min，去除沉澱物， (Ag3CB3GA 不溶於丙酮)，將丙酮抽乾後即可得到產物 [BMIM]3[CB3GA]。 7.反應如 3-1、3-2，產物以 NMR、Mass、TGA、DSC、UV-vis 鑑定。. 28.
(43) 3-3-2 製備液相/液相萃取系統 在本實驗中萃取系統分為兩種方式，一種是將親和性染料 CB3GA 水溶液和萃取相[BMIM][PF6]攪拌作用，使部分 CB3GA 轉移 到離子液體層。另一種方式則是將親和性染料先合成為離子液體 [BMIM]3[CB3GA]，以這種具有親和性的離子液體做為萃取劑加到萃 取相中。. 3-3-2-1 以親和性染料 CB3GA 為萃取劑 1.取 4x10-4 mole (0.336 g) CB3GA 溶於 5 ml H2O，再加入 10 ml [BMIM][PF6]，攪拌平衡一天後，用去離子水清洗萃取相至水層澄 清。 2.取步驟 1.之離子液體層，利用紫外光-可見光光譜儀做定性分析。. 3-3-2-2 以親和性離子液體[BMIM]3[CB3GA]做為萃取劑 1.分別將 5 × 10-6、10-5、2.5 × 10-5、5 × 10-5、10-4、2 × 10-4 mole 的 [BMIM]3[CB3GA]加到 10 ml [BMIM][PF6]中攪拌 10 min 後，利用 20 ml 去離子水清洗五次將過多的[BMIM]3[CB3GA]洗至水層並去 除。 2.定量方法:將[BMIM]3[CB3GA]溶於[BMIM][PF6]，配製成濃度分 別為 0.25、0.5、1.25、2.5、5.0、10.0 mM，各取 100 μ l 並加入 4.0 ml 甲醇，由紫外光-可見光光譜儀針對波長 623 nm 吸收值做出 29.
(44) 檢量線。再將步驟 1.平衡過後的萃取相各取 100 μ l 並加入 4.0 ml 甲醇，測出波長 623 nm 吸收值，帶入檢量線後，即可得到萃取相 中[BMIM]3[CB3GA]的濃度。. 3-3-3 配製緩衝溶液 0.05 M KCl / 0.1 M HCl 調配 pH 範圍 1.0-2.2 0.05M Glycine / 0.1M HCl 調配 pH 範圍 2.1-3.5 0.05 M CH3COOH / 0.05 M CH3COONa 調配 pH 範圍 3.6-5.0 0.05 M KH2PO4 / 0.1 M NaOH 調配 pH 範圍 5.8-6.9 0.05 M Tris(hydroxymethyl)-aminomethane / 0.1M HCl 調配 pH 範圍 7.0-9.0 0.05M NaHCO3 / 0.1M NaOH 調配 pH 範圍 9.6-11.0 0.05M Na2HPO4 / 0.1M NaOH 調配 pH 範圍 10.9-12.0. 3-3-4 萃取蛋白質溶菌酶 3-3-4-1 以親和性染料 CB3GA 為萃取劑 取 3-3-2-1 所得到之萃取相 2.0 ml 加入等體積 200 mg/L、pH 7.0 的溶 菌酶水溶液，以磁石攪拌 30 min，靜置 30 min，取上層水溶液做蛋白 質定量。. 30.
(45) 3-3-4-2 以親和性離子液體[BMIM]3[CB3GA]做為萃取劑 3-3-4-2-1 改變[BMIM]3[CB3GA]濃度對萃取率影響 正向萃取:取含有 0、0.28、0.61、1.55、2.52、3.80、5.82 mM [BMIM]3[CB3GA]之[BMIM][PF6] 2.0 ml 分別加入等體積 500 mg/L、 pH 4.0 的溶菌酶水溶液，以磁石攪拌 30 min，靜置 30 min，取上層水 溶液做定量。. 3-3-4-2-2 攪拌時間對萃取率影響 正向萃取:取含有 3.80 mM [BMIM]3[CB3GA]之[BMIM][PF6] 2.0 ml 分 別加入等體積 500 mg/L、pH4.0 的溶菌酶水溶液，以磁石攪拌 0.5、1、 5、10、20、30、60 min，靜置 30 min，取上層水溶液做定量。. 3-3-4-2-3 改變 pH 值對萃取率影響 (a)對正向萃取之影響 正向萃取:取含有 3.80 mM [BMIM]3[CB3GA]之[BMIM][PF6] 2.0 ml 分 別加入等體積 500 mg/L、pH 1.0~11.0 的溶菌酶水溶液，以磁石攪拌 30 min，靜置 30 min，取上層水溶液做定量。. (b) 對反向萃取之影響 1.正向萃取: 取含有 3.80 mM [BMIM]3[CB3GA]之[BMIM][PF6] 2.0ml 分別加入等體積 500 mg/L、pH 4.0 的溶菌酶水溶液，以磁石攪拌 31.
(46) 30 min，靜置 30 min，取上層水溶液做定量。 2.反向萃取:取正向萃取完的離子液體層 1.0 ml，加入 1.0 M KCl pH 4.0~11.0 的緩衝溶液 1.0 ml，以磁石攪拌 30 min，靜置 30 min， 取上層水溶液做定量。. 3-3-4-2-4 使用回收離子液體做萃取 (a) 1.將萃取過後的離子液體層加入等體積去離子水清洗去除 KCl。 2.正向萃取:取清洗過的離子液體層 2.0 ml，加入等體積 500 mg/L、pH 4.0 的溶菌酶水溶液，以磁石攪拌 30 min，靜置 30 min，取上層水 溶液做定量。 3.反向萃取:將正向萃取完的水層去除，加入 1.0 M KCl pH 11.0 的緩 衝溶液 2.0 ml，以磁石攪拌 30 min，靜置 30 min，取上層水溶液做 定量。 4.反向萃取完後，重複步驟 1.清洗離子液體層，即可重複進行步驟 2 和步驟 3 達到回收利用目的。 (b) 1.將萃取過後的離子液體層加入等體積 1.0M KCl、pH 11.0 緩衝溶液， 以磁石攪拌 30 min，重複兩次以去除殘留在萃取相中的蛋白質，再 加入等體積去離子水清洗去除 KCl。 2.正向萃取:取清洗過的離子液體層 2.0 ml，加入等體積 500 mg/L、pH 32.
(47) 4.0 的溶菌酶水溶液，以磁石攪拌 30 min，靜置 30 min，取上層水 溶液做定量。 3.反向萃取:將正向萃取完的水層去除，加入 1.0 M KCl、pH 8.0 的緩 衝溶液 2.0 ml，以磁石攪拌 30 min，靜置 30 min，取上層水溶液做 定量。 4.反向萃取完後，重複步驟 1.清洗離子液體層，即可重複進行步驟 2 和步驟 3 達到回收利用目的。. 3-3-4-2-5 濃縮蛋白質溶菌酶 1.正向萃取: 取含有 3.80 mM [BMIM]3[CB3GA]之[BMIM][PF6] 5.0ml 加入等體積 500 mg/L、pH 4.0 的溶菌酶水溶液，以磁石攪拌 30 min，靜置 30 min，取上層水溶液做定量。 2.反向萃取:正向萃取完，將水層去除後，分別加入 5.0、2.5、1.0 ml 的 1.0 M KCl、pH 8.0 緩衝溶液，攪拌 30min，靜置 30 min，取上 層水溶液做定量。. 3-3-4-2-6 溶菌酶活性測試 1.配製 pH 4、200 mg/L 溶菌酶水溶液，測量其 CD 光譜。 2.將含有 3.80 mM [BMIM]3[CB3GA]之[BMIM][PF6]加入等體積 pH 4.0、500 mg/L 溶菌酶水溶液正向萃取之後，再以等體積 1.0 M KCl、pH 8.0 緩衝溶液為做為反向萃取條件，反向萃取完，將上層 33.
(48) 水溶液通過 Desalting column 除鹽，再進行 CD 光譜測量。. 3-3-5 萃取其他蛋白質水溶液 除了溶菌酶外，本實驗也對卵白蛋白、牛血清蛋白、細胞色素 c 作初步的萃取測試，探討以[BMIM]3[CB3GA]為萃取劑時，是否能對 其他蛋白質有萃取效果，以及用於純化蛋白質的可能性。. 3-3-5-1 萃取個別蛋白質水溶液 (a) 無添加萃取劑: 取[BMIM][PF6] 2.0ml 分別加入等體積 500 mg/L， pH 4.0、pH 7.0、pH 11.0 的蛋白質溶液，以磁石攪拌 30 min，靜 置 30 min，取上層水溶液做定量。 (b) 添加萃取劑: 取含有 3.80 mM [BMIM]3[CB3GA]之[BMIM][PF6] 2.0 ml 分別加入等體積 500 mg/L，pH 4.0、pH 7.0、pH 11.0 的蛋 白質水溶液，以磁石攪拌 30 min，靜置 30 min，取上層水溶液做 定量。. 3-3-5-2 萃取混合蛋白質水溶液 (a) 等濃度蛋白質混合溶液 1.正向萃取: 取含有 3.80 mM [BMIM]3[CB3GA]之[BMIM][PF6] 2.0 ml 加入等體積 pH 7.0、500 mg/L 溶菌酶、卵白蛋白、牛血清蛋白的混. 34.
(49) 合水溶液，以磁石攪拌 30 min 靜置 30 min。 2.反向萃取: 取正向萃取完的離子液體層 1.0 ml，加入 1.0 M KCl 、pH 8.0 的緩衝溶液 1.0 ml，以磁石攪拌 30 min，靜置 30 min，取 上層水溶液做定量。 (b) 模擬雞蛋蛋白之蛋白質混合溶液 1.正向萃取: 取含有 3.80 mM [BMIM]3[CB3GA]之[BMIM][PF6] 2.0 ml 加入等體積 pH 7.0，500 mg/L 溶菌酶、7500 mg/L 卵白蛋白、2000 mg/L 牛血清蛋白混合水溶液，以磁石攪拌 30 min 靜置 30 min。 2.反向萃取: 取正向萃取完的離子液體層 1.0 ml，加入 1.0 M KCl、 pH 8.0 的緩衝溶液 1.0 ml，以磁石攪拌 30 min，靜置 30 min，取上 層水溶液做定量。. 3-3-6 蛋白質定量方式 本實驗將萃取過後的蛋白質水溶液用 HPLC 分析，接上紫外 光偵測器作定量。組成蛋白質的胺基酸帶有芳香基團，在波長 280 nm 會吸光，而蛋白質骨架上的-C=O 基團在 200 nm 附近會有吸 收，但因為 200 nm 波長的光線來源不穩定，而且會受到空氣中氧 分子的干擾，因此較難應用。本實驗選擇 280 nm 光源對蛋白質作. 35.
(50) 定量。而每種蛋白質分子中的芳香基團含量不一，因此在 280 nm 的吸光能力就有差別，也因此各有不同的消光係數。 3-3-6-1 利用 HPLC 定量蛋白質水溶液 1. HPLC 儀器裝置如圖 3-2，用動相 A (含有 0.1 % TFA、20 % ACN 的水溶液)沖提 reverse phase HPLC 使平衡 10 分鐘。 2. 注入 20μL 待測物。 3. 以動相 A+B(含有 0.1 % TFA、80 % ACN 的水溶液)，在 15 分鐘內 做梯度沖提，紫外光偵測器之吸收波長設定在 280 nm。 4. 以濃度 100、200、500、1000 mg/L 的蛋白質標準品做檢量線，定 量各蛋白質水溶液濃度。. 圖 3- 2、 HPLC 儀 器 裝 置 圖 36.
(51) 第四章. 結果與討論. 4-1 離子液體之合成 本實驗所合成的離子液體包括[BMIM][PF6]、[BMIM]3[CB3GA]， 在 室 溫 之 下 [BMIM][PF6] 為 金 黃 色 黏 稠 液 體 ， 與 水 不 互 溶 。 [BMIM][PF6]的 1H-NMR 如圖 4-1 所示，1H-NMR (300 MHz, CH3OH-d) δ: 8.93 (1H, s, NCHN), 7.73 (1H, s, CH3NCHCHN), 7.67 (1H, s, CH3NCHCHN), 4.34 (2H, t, J=7.2 Hz, NCH2(CH2)2CH3), 4.03 (3H, s, NCH3), 1.92 (2H, m, NCH2CH2CH2CH3), 1.35 (2H, m, N(CH2)2CH2CH3), 0.93 (3H, t, J=7.2 Hz, N(CH2)3CH3). [BMIM][PF6]已是被廣泛使用的一 種離子液體，其性質也已被鑑定出來 75。 [BMIM]3[CB3GA]為深藍色黏稠液體，合成步驟中先利用 AgNO3 和 CB3GA 反應形成 Ag3CB3GA，產率約 91 %。Ag3CB3GA 以乙晴 溶解後，再加入[BMIM][Cl]攪拌，產生 AgCl 沉澱，移除 AgCl 和溶 劑之後，即可得到[BMIM]3[CB3GA]，產率約 54 %。由[BMIM][Cl] 和[BMIM]3[CB3GA]的 1H-NMR 圖譜比對，可看出化學位移的現象， 文獻指出離子液體陰離子不同時，陽離子上的氫會有化學位移產生 。[BMIM][Cl]的 1H-NMR 如圖 4-2，(500 MHz, DMSO-d6) δ: 9.63 (1H,. 24. s, NCHN), 7.92 (1H, s, CH3NCHCHN), 7.83 (1H, s, CH3NCHCHN), 4.20. 37.
(52) (2H, t, J=7.0 Hz, NCH2(CH2)2CH3), 3.87 (3H, s, NCH3), 1.74 (2H, m, NCH2CH2CH2CH3), 1.21 (2H, m, N(CH2)2CH2CH3), 0.85 (3H, t, J=7.0 Hz, N(CH2)3CH3). 而[BMIM]3[CB3GA] 的 1H-NMR 如圖 4-3，(500 MHz, DMSO-d6) δ: 9.14 (1H, s, NCHN), 7.76 (1H, s, CH3NCHCHN), 7.69 (1H, s, CH3NCHCHN), 4.10 (2H, t, J=7.0 Hz, NCH2(CH2)2CH3), 3.83 (3H, s, NCH3), 1.74 (2H, m, NCH2CH2CH2CH3), 1.24 (2H, m, N(CH2)2CH2CH3), 0.88 (3H, t, J=7.5 Hz, N(CH2)3CH3). 而質譜儀以 ESI+為游離方式可看到[BMIM]+的 m/z=139.1，ESI作為游離方式時(圖 4-4)，可看到一個陽離子[BMIM]+脫離形成 ([BMIM]2[CB3GA])-的荷質比 m/z=1048.3，以及([BMIM][CB3GA])2的 m/z=454.5。由圖 4-5，微差掃描卡計(DSC)的測量結果可看出 [BMIM]3[CB3GA]的熔點為 8.4℃，具有吸熱的特徵峰出現。從熱重 量分析儀(TGA)測量得到其 Td. (-5 %)=250℃(Td(%):樣品重量損失百分率. 的溫度)。而圖 4-6 的 UV-vis 吸收圖譜中顯示 CB3GA 的發光團在 623 nm 時 有 吸 收 ， [BMIM][PF6] 陽 離 子 部 分 在 210 nm 有 吸 收 ， 而 [BMIM]3[CB3GA]則同時兼具有這兩個波段的吸收。. 38.
(53) 39. 圖 4- 1、 [BMIM][PF 6 ] NMR 圖 譜.
(54) 40. 圖 4- 2、 [BMIM][Cl] NMR 圖 譜.
(55) 41. 圖 4- 3、 [BMIM] 3 [CB3GA] NMR 圖 譜.
(56) 42. 圖 4- 4、 [BMIM] 3 [CB3GA] Mass 圖 譜.
(57) Endothermic. [BMIM]3[CB3GA]. o. Tm= 8.4 C. 0. 10. 20 o. Temperature ( C ). 圖 4- 5、 [BMIM] 3 [CB3GA]之 DSC 圖 譜 4. [BMIM]3[CB3GA] CB3GA [BMIM][PF6]. Absorbence (AU). 3. 2. 1. 0 200. 400. 600. Wavelength (nm). 圖 4- 6、 [BMIM] 3 [CB3GA]之 UV-vis 圖 譜. 43. 800.
(58) 4-2 製備液相/液相萃取系統 本實驗使用[BMIM][PF6]作為萃取相，因其為疏水性的離子液 體，在水中溶解度為 0.13% v/v75，和水溶液攪拌後可快速分層，其密 度比水大，在兩相中位於下層，水溶液在上層。萃取劑方面則選取 CB3GA 和[BMIM]3[CB3GA]，因 CB3GA 不溶於[BMIM][PF6](如圖 4-7(b))，將其配製為水溶液後和[BMIM][PF6]攪拌，發現離子液體層 由金黃色變橄欖綠，有部分 CB3GA 轉移到離子液體層，但 CB3GA 親水性高，轉移到離子液體層效率差，大部分的 CB3GA 仍留在水相， 其 UV-vis 光譜如圖 4-8，吸收波長從 623 nm 位移到 480 nm，推測 CB3GA 在[BMIM][PF6]中經長時間攪拌後，結構可能被破壞，目前尚 無法鑑定出此物質為何，且在定量上有困難。用此萃取相在 pH 7.0 條件下萃取 200 mg/L 溶菌酶水溶液，萃取率約為 24.7 %。. (a). (b). (c). 圖 4- 7、萃 取 劑 在 [BMIM][PF6]中溶 解 狀 況 (a) [BMIM][PF6], (b) CB3GA 粉末於[BMIM][PF6]中,(c) [BMIM]3 [CB3GA]於[BMIM][PF6]中。. 44.
(59) 0.5. Absorbance (AU). 0.4. CB3GA stirred CB3GA(aq) with [BMIM][PF6]. 0.3. 0.2. 0.1. 0.0 400. 500. 600. 700. 800. Wavelength (nm). 圖 4- 8、CB3GA 轉移到[BMIM][PF6]中之 UV-vis 圖. 因此進一步將 CB3GA 合成為離子液體[BMIM]3[CB3GA]，希望 藉 由 陽 離 子 之 間 的 π-π 電 子 間 作 用 力 讓 [BMIM]3[CB3GA] 溶 於 [BMIM][PF6]中，結果如圖 4-7(c)，證實[BMIM]3[CB3GA]的確能溶於 萃取相，加入去離子水平衡後，分別取 100 μl 的水相和離子液體相， 加入 4.0 ml 甲醇稀釋後，利用 UV-vis 測量 623nm 吸收值，估計 [BMIM]3[CB3GA]在水相和離子液體相之間的分佈係數 KU/L= 0.02， 由此可知[BMIM]3[CB3GA]較偏向於存在於離子液體層。因此本實驗 將利用[BMIM]3[CB3GA]做為萃取劑，萃取蛋白質水溶液。. 45.
(60) 4-3 萃取蛋白質溶菌酶 本實驗萃取溶菌酶之示意圖如圖 4-9，分為正向萃取及反向萃取 兩步驟，正向萃取率(forward extraction efficiency, Ef)和反向萃取率 (backward extraction efficiency, Eb)以及蛋白質回收率(recovery, Et)的 定義如下。. forward extraction aqueous phase. IL phase. aqueous phase. backward extraction. IL phase. = proteins. 圖 4- 9、 蛋 白 質 萃 取 過 程 示 意 圖. 46. aqueous phase. IL phase.
(61) 4-3-1 改變[BMIM]3[CB3GA]濃度對萃取率影響 利用[BMIM]3[CB3GA]為萃取劑，在 pH 4.0 條件下萃取 200、 500、1000 mg/L 溶菌酶水溶液時，萃取率會隨[BMIM]3[CB3GA]濃度 增加而提高，而這三種濃度的溶菌酶水溶液在[BMIM]3[CB3GA]濃度 增加到 3.8 mM 時，萃取率都達到定值，接近 100 %(如圖 4-10)。而 未加入[BMIM]3[CB3GA]時，有部分的溶菌酶被萃取到離子液體層， 但達到高的萃取率是在加入[BMIM]3[CB3GA]後，因此選用含 3.8 mM [BMIM]3[CB3GA]的離子液體作為之後的實驗條件。. 100 90 80 70. Ef (%). 60 50 40 30. 200 mg/L 500 mg/L 1000 mg/L. 20 10 0 0. 1. 2. 3. 4. 5. 6. [BMIM]3[CB3GA] (mM). 圖 4- 10、 不 同 萃 取 劑 濃 度 對 正 向 萃 取 率 的 影 響 萃取劑濃度分別為 0、0.28、0.61、1.55、2.52、3.80、5.82 mM，萃 取 200、500、1000 mg/L，pH 4.0 溶菌酶水溶液。. 47.
(62) 4-3-2 攪拌時間對萃取率影響 圖 4-11 顯示萃取溶菌酶時攪拌時間對正向萃取率的影響，從圖 中可看出溶菌酶從水相到離子液體相，在 30 秒時萃取率即達到 78 %，10 分鐘後可達到 95 %以上，表示此反應很快就能達到平衡，30 分鐘之後萃取率就不再增加，因此實驗條件將萃取時間設定於 30 分 鐘。. 100 90 80 70. Ef (%). 60. 30 秒. 50 40 30 20. 500 mg/L lysozyme. 10 0 0. 10. 20. 30. 40. 50. 60. Time (min). 圖 4- 11、 反 應 時 間 對 正 向 萃 取 率 的 影 響 含有 3.8 mM [BMIM]3[CB3GA]針對 500 mg/L 溶菌酶水溶液在 pH 4.0 條件下進行正向萃取，反應時間分別為 0.5、1、5、10、20、30、60 min。. 4-3-3 改變 pH 值對萃取率影響 從圖 4-12 可發現正向萃取時，隨著 pH 值增加，溶菌酶萃取率逐. 48.
(63) 漸降低。有文獻指出胺基酸在離子液體和水之間的分佈行為 76，當水 溶液的 pH 值越低、胺基酸的疏水性越大時，胺基酸越傾向分佈於離 子液體層，因而推測胺基酸在低 pH 值是呈現正電性，和離子液體的 陰離子之間存有靜電吸引力而分佈係數較大，且 CB3GA 上磺酸基帶 的負電荷和蛋白之間亦存在有靜電作用力。由本實驗結果中可看出， 溶菌酶的萃取率受到靜電吸引力所影響，當 pH 值較低時，溶菌酶上 所帶正電荷越多，如圖 4-1377，和離子液體間靜電吸引力越大，因此 萃取效果較好，反之，當 pH 增加時，蛋白質上的正電荷數減少，靜 電吸引力減弱，導致萃取率下降。. 100 90 80 70. Ef (%). 60 50 40 30 20 10. 500 mg/L lysozyme. 0 2. 4. 6. 8. 10. pH. 圖 4- 12、 pH 值 對 正 向 萃 取 率 的 影 響 含有 3.8 mM [BMIM]3[CB3GA]針對 500 mg/L 溶菌酶水溶液在 pH 1.0~11.0 條件下進行正向萃取。. 49.
(64) 圖 4- 13、 溶 菌 酶 在 不 同 pH 值 表 面 所 帶 電 荷 數. 77. 一般親和性層析在吸附目標物後，會利用含有高鹽類濃度的水溶 液使將目標物從靜相脫附而被沖提出來 78，在本實驗的反向萃取中分 別利用 1.0 M 的 NaCl 和 KCl 作為實驗條件，藉由遮蔽效應破壞溶菌 酶和[BMIM]3[CB3GA]陰離子磺酸基之間的靜電作用力，使溶菌酶回 到水相。以 1.0 M 的 NaCl 在 pH 7.0 條件下反向萃取率約 40 %，而 1.0 M 的 KCl 在 pH 7.0 條件下反向萃取率可達 85 %，與文獻提出的 離子半徑越大，遮蔽效應越高相符 56，因此反向萃取時選用 1.0 M 的 KCl 緩衝溶液。同樣地，改變水溶液酸鹼值，反向萃取所得到的結果 正好和正向萃取相反，當 pH 值增高，溶菌酶表面電荷數減少，靜電 力較弱，反向萃取率呈現增加的趨勢，如圖 4-14 所示。. 50.
(65) 100 90 80 70. Eb (%). 60 50 40 30 20. 500 mg/L lysozyme. 10 0 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. pH. 圖 4- 14、 pH 值 對 反 向 萃 取 率 的 影 響 含有 3.8 mM [BMIM]3[CB3GA]針對 500 mg/L 溶菌酶水溶液在 pH 4.0 條件下進行正向萃取，反向萃取利用 pH4.0~11.0 的 1.0 M KCl 緩衝溶 液為實驗條件。. 51.
(66) 4-3-4 使用回收離子液體做萃取 離子液體的優勢之一即是可重複利用，減少化學廢棄物，本實驗 亦利用使用過的離子液體重複萃取實驗，圖 4-15(a)是利用含有 3.8 mM 的[BMIM]3[CB3GA]的[BMIM][PF6]萃取 500 ml/L 溶菌酶，在 pH 4.0 條件下進行正向萃取，反向萃取則利用 1.0 M KCl 高濃度鹽類緩 衝溶液在 pH 11.0 環境下進行，反向萃取完利用去離子水清洗萃取 相，即進行下一次的正向萃取，如此重複使用離子液體八次，實驗結 果顯示正向和反向萃取率皆無下降趨勢，蛋白質回收率維持在 90 % 左右。 而 圖 4-15(b) 則 是 利 用 含 有 3.8 mM 的 [BMIM]3[CB3GA] 的 [BMIM][PF6]在 pH 4.0 條件下正向萃取，反向萃取利用 1.0 M KCl 緩 衝溶液在 pH 8.0 環境下進行，在此條件下反向萃取率約 93 %，有些 許溶菌酶殘留於萃取相，因此反向萃取完利用 pH 11.0、1.0 M KCl 高濃度鹽類緩衝溶液清洗萃取相兩次，再利用去離子水清洗一次後， 進行下一次的正向萃取，從圖 4-15(b)可看出正向萃取率並無下降， 說明了含有 1.0 M KCl 的高濃度鹽類緩衝溶液在 pH 11.0 時可將離子 液體層殘餘溶菌酶洗出。蛋白質回收率亦能維持於 85 %左右。由這 兩個實驗得知，重複利用離子液體作正向萃取及反向萃取時，萃取率 幾乎不會下降，可見離子液體中幾乎無殘留的蛋白質分子。. 52.
(67) (a) Extraction efficiency (%). 100. 80. 60. 40. Ef Eb Et. 20. 0 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Reuse number. (b). Extraction efficiency (%). 100. 80. 60. 40. Ef Eb Et. 20. 0 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Reuse number. 圖 4- 15、 重 複 使 用 離 子 液 體 萃 取 次 數 和 萃 取 率 的 關 係 圖 (a) 含有 3.8 mM [BMIM]3[CB3GA]針對 500 mg/L 溶菌酶水溶液在 pH 4.0 條件下進行正向萃取，反向萃取利用 pH 11.0 的 1.0 M KCl 緩衝溶 液為實驗條件。(b) 含有 3.8 mM [BMIM]3[CB3GA]針對 500 mg/L 溶 菌酶水溶液在 pH 4.0 條件下進行正向萃取，反向萃取利用 pH 8.0 的 1.0 M KCl 緩衝溶液為實驗條件。. 53.
(68) 4-3-5 濃縮蛋白質溶菌酶 本實驗也嘗試濃縮蛋白質溶菌酶，在此理論的濃縮倍數分別為 1、2、5 倍，結果如表 4-1，隨著濃縮倍數越大回收率減少，因為濃 縮倍數越大，反向萃取時新加入的水相體積越小，可能造成溶菌酶無 法完全回到水相，導致回收率降低。不過此實驗證明了以離子液體 [BMIM]3[CB3GA]當萃取劑濃縮蛋白質的可行性。. 表 4- 1、濃縮蛋白質溶菌酶 backward theoretical experimental concentraction extraction volume value value factor (ml) (mg/L) (mg/L). recovery (%). 5. 1. 500. 427.8. 85.6. 2.5. 2. 1000. 689.9. 69.0. 1. 5. 2500. 1252.8. 50.1. 含有 3.8 mM [BMIM]3[CB3GA]針對 500 mg/L 溶菌酶水溶液在 pH 4.0 條件下進行正向萃取，反向萃取利用 pH 8.0 的 1.0 M KCl 緩衝溶液為 實驗條件。. 4-3-6 溶菌酶活性測試 本實驗利用CD光譜來確認蛋白質在萃取過程中是否有變性， CD光譜中180 nm~250 nm的遠紫外光區可觀察蛋白質的二級結構； 250 nm~350 nm的近紫外光區則可監測蛋白質的三級結構；當蛋白質 54.
(69) 變性導致三度空間構形改變時，二級結構及三級結構皆會發生變化， 在CD光譜可直接觀測到。 因此將pH 4.0的溶菌酶水溶液和萃取過後的溶菌酶水溶液做CD 光譜的比較，由圖4-16可看出兩者之間幾乎相同，由此可證明溶菌酶 在萃取過程當中，仍能保持其立體結構。. 10. recovered lysozyme native lysozyme Molecular ellipticity. 5. 0. (a). -5. (b) -10 200. 220. 240. 260. 280. Wavelength (nm). 圖 4- 16、 溶 菌 酶 水 溶 液 CD 光 譜 圖 (a)經過萃取過程之溶菌酶水溶液(正向萃取:pH 4.0;反向萃取:pH 8.0)， (b) pH 4.0 之原始態溶菌酶水溶液. 55.
(70) 4-4 萃取其他蛋白質 4-4-1 分別萃取蛋白質水溶液 為了探討[BMIM]3[CB3GA]與蛋白質之間作用力和選擇性，除了 溶菌酶，本實驗也嘗試萃取其他蛋白質，包含牛血清蛋白、卵白蛋白、 色素細胞 c，其 HPLC 層析圖如圖 4-17。. 圖 4- 17、 蛋 白 質 水 溶 液 HPLC 層 析 圖 從左至右為細胞色素 c、溶菌酶、牛血清蛋白、卵白蛋白. 56.
(71) 其中卵白蛋白和溶菌酶來源皆是雞蛋蛋白，而同屬雞蛋蛋白中的 伴白蛋白(conalbumin)因價格昂貴，在此以分子量、親疏水性、等電 點相近的牛血清蛋白取代，選用色素細胞 c 則是為了比較蛋白質等 電點(pI)和萃取率之間的關係。 當利用含 3.8 mM [BMIM]3[CB3GA]的萃取相，在 pH 7.0 條件下 分別萃取這四種蛋白質水溶液時，發現溶菌酶有 81.2 ± 2.4 %萃取率 (如表 4-2)，而色素細胞 c 亦有 6.2 ± 1.5 %的萃取率，卵白蛋白和牛血 清蛋白則無萃取效果。利用未加入[BMIM]3[CB3GA]的萃取相作空白 實驗，發現溶菌酶和細胞色素 c 萃取率分別為 4.4 ± 1.1 %、6.1 ± 0.6 %， 由此證實細胞色素 c 在未加入萃取劑時就有些許萃取率，並非 [BMIM]3[CB3GA]造成其萃取效果，而在空白實驗有萃取效果的兩種 蛋白質等電點都在 10.0 以上，推測是蛋白質在 pH 7.0 時帶正電，和 萃取相[BMIM][PF6]的陰離子有靜電吸引力。 為了進一步探討蛋白質和離子液體間的作用力，分別在 pH 4.0、 pH 11.0 條件下作萃取，可由表 4-2 看出在 pH 4.0 時四種蛋白質在空 白實驗時即有萃取率，加入[BMIM]3[CB3GA]後，四種蛋白質萃取率 皆在 80 %以上，在 pH 4.0 條件下此系統對於蛋白質的選擇性不佳。 而在 pH 11.0 時不論是空白實驗或加入萃取劑後，幾乎都無法萃取蛋 白質，只有溶菌酶在添加[BMIM]3[CB3GA]後有 23.6 ± 2.6 %的萃取. 57.
(72) 率，推測[BMIM]3[CB3GA]和溶菌酶之間除了靜電作用力，亦有其他 作用力存在。. 表 4-2、 蛋 白 質 水 溶 液 分 別 在 不 同 pH 值 的 正 向 萃 取 率. 萃取相. 溶菌酶. pI. pH4. pH7. pH11. 牛血. 細胞. 清蛋白. 色素 c. 卵白蛋白. 10.7. 4.5. 4.6. 10.5. [BMIM][PF6]. 30.2 ± 4.1[a]. 83.8 ± 6.4. 29.4 ± 3.2. 34.4 ± 4.1. 3.8mM [BMIM]3[CB3GA] in [BMIM][PF6]. 95.4 ± 1.1. 84.0 ± 4.4. 96.1 ± 1.4. 95.1 ± 4.8. [BMIM][PF6]. 4.4 ± 1.1. --[b]. --. 6.1 ± 0.6. 3.8mM [BMIM]3[CB3GA] in [BMIM][PF6]. 81.2 ± 2.4. --. --. 6.2 ± 1.5. [BMIM][PF6]. --. --. --. --. 3.8mM [BMIM]3[CB3GA] in [BMIM][PF6]. 23.6 ± 2.6. --. --. --. 萃取劑為 3.8 mM [BMIM]3[CB3GA]，蛋白質水溶液濃度為 500 mg/L。 [a]. 實驗次數為 3 次，. [b]. --無法測得。. 58.
(73) 4-4-2 萃取混合蛋白質水溶液 除了個別萃取蛋白質水溶液，本實驗也模擬雞蛋蛋白成分，將溶 菌酶、卵白蛋白和牛血清蛋白混合作初步測試。由上節的討論發現在 pH 7.0 時，含萃取劑的萃取相在這三種蛋白質中只對溶菌酶有萃取效 果，所以選擇用此條件來萃取蛋白質混合溶液。萃取結果如表 4-3(a)， 在分別萃取蛋白質溶液時，卵白蛋白和牛血清蛋白並無萃取效果，但 混合溶液中卻有部分被萃取，推測是蛋白質之間的靜電作用力所導致 78. ，因溶菌酶在 pH 7.0 的時候帶正電，卵白蛋白和牛血清蛋白帶負電，. 使得溶菌酶在萃取到離子液體層時，經由靜電作用力把其他兩種蛋白 質部分轉移到離子液體層。在反向萃取部分，選用 pH 8.0、1.0M KCl 的緩衝溶液將蛋白質從萃取相反萃回水相，表 4-3(a)顯示溶菌酶的反 向萃取率為 33.0 ± 6.1%，比個別萃取時的反向萃取率低許多，原因尚 無法確定，推測是混合蛋白質造成的影響，卵白蛋白反向萃取率為 64.7 ± 1.4 %，牛血清蛋白則偵測不到。計算蛋白質回收率，溶菌酶為 29.8 ± 6.1 %，卵白蛋白為 4.0 ± 1.5 %，溶菌酶相對濃度從 33.3 %增加 為 86.9 ± 6.1 %。 另外，針對模擬雞蛋蛋白成分的比例亦作了測試，在雞蛋蛋白中 溶菌酶佔 3.4 %，卵白蛋白佔 54.0 %，伴白蛋白佔 12.0 % (以牛血清 蛋白取代)，在此以 500 mg/L 溶菌酶、2000 mg/L 牛血清蛋白、7500 mg/L 卵白蛋白混合水溶液模擬，萃取效果如表 4-3(b)，因卵白蛋白 59.
(74) 和牛血清蛋白的含量提高許多，相對的進入離子液體層的比例也增 高，從回收率可計算出溶菌酶含量為 151.0 mg/L，卵白蛋白為 740.1 mg/L，牛血清蛋白為 166.0 mg/L，溶菌酶的相對濃度從 5.0 %提高至 14.3%。由結果得知，當卵白蛋白和牛血清蛋白濃度提高時，利用此 條件純化溶菌酶的效果不甚理想。萃取混合蛋白質的部分在此只利用 一種條件，未來可嘗試其他條件，以達到更好的純化效果。. 表 4-3、 混 合 蛋 白 質 水 溶 液 之 萃 取 率 (a) 利用 3.8 mM [BMIM]3[CB3GA]萃取 500 mg/L 溶菌酶、卵白蛋白 和牛血清蛋白混合水溶液 溶菌酶. 卵白蛋白. 牛血清蛋白. Ef (%) [a]. 83.6 ± 3.9[c]. 6.9 ± 3.2. 0.5+0.8. Eb (%) [b]. 33.0 ± 6.1. 64.7 ± 1.4. --[d]. Et (%). 29.0 ± 6.1. 4.0 ± 1.5. --. [a]. 正向萃取:pH=7.0，[b]反向萃取:1.0 MKCl,pH=8.0，[c]實驗次數:3 次， [d] --無法測得。 (b) 利用 3.8 mM [BMIM]3[CB3GA]萃取 500 mg/L 溶菌酶、2000 mg/L 牛血清蛋白、7500 mg/L 卵白蛋白混合水溶液 溶菌酶. 卵白蛋白. 牛血清蛋白. Ef (%)[a]. 87.9[c]. 17.5. 9.0. Eb (%)[b]. 34.4. 56.5. 92.7. Et (%). 30.2. 9.87. 8.3. [a]. 正向萃取:pH=7.0，[b]反向萃取:1.0 MKCl,pH=8.0，[c]實驗次數:1 次。 60.
(75) 第五章. 結論. 本實驗利用將染料配體 CB3GA 經由簡單的離子交換過程，合成 為具有親和性的離子液體[BMIM]3[CB3GA]，並將其作為萃取劑溶於 疏水性離子液體[BMIM][PF6]，萃取蛋白質溶菌酶。由實驗結果證實 此液相/液相萃取系統對於溶菌酶有良好的回收率。 染料配體能純化蛋白質除了結構類似天然配體之外，其磺酸基在 一般條件下會解離帶負電荷，和蛋白質之間可經由靜電作用力達到吸 附效果，本實驗中改變溶菌酶水溶液 pH 值，印證蛋白質上所帶電荷 越多，在正向萃取時越容易被萃取到離子液體層。除了靜電作用力之 外，蛋白質疏水性、蛋白質和離子液體之間其他作用力也可能是影響 萃取率的因素。 染料配體因其結構不同，純化的蛋白質種類亦有所差異，未來可 將不同種類的染料合成為離子液體，針對不同蛋白質做萃取。在混合 蛋白質實驗中，若能降低蛋白質之間作用力，則可提高親和性離子液 體在蛋白質上的選擇性。 本實驗液相/液相萃取過程中皆無使用有機溶劑，回收使用過後 的離子液體做萃取，溶菌酶的回收率仍能維持在一定範圍，符合環保 概念。此技術未來也許可使用於蛋白質的純化和濃縮。. 61.
(76) 參考文獻 1. P. T. Anastas, J. B. Zimmerman, “Design through the 12 principles of green engineering” Environ. Sci. Technol. A-Pages 37 (2003) 94A.. 2. L. A. Blanchard, D. Hancu, E. J. Beckman, J. F. Brennecke, “Green processing using ionic liquids and CO2” Nature 399 (1999) 28. 3. J. G. Huddleston, H. D. Willauer, R. P. Swatloski, A. E. Visser, R. D. Rogers, “Room temperature ionic liquids as novel media for ‘clean’ liquid-liquid extraction” Chem. Commun. 16 (1998) 1765.. 4. T. Welton, “Room-Temperature Ionic Liquids. Solvents for Synthesis and Catalysis” Chem. Rev. 99 (1999) 2071.. 5. P. Wasserscheid, W. Keim, “Ionic Liquids-New “Solutions” for Transition Metal Catalysis” Angew. Chem. Int. Ed. 39 (2000) 3772.. 6. C. J. Adams, M. J. Earle, G. Roberts, K. R. Seddon, “Friedel-Crafts reaction in room temperature ionic liquids” Chem. Commun. 19 (1998) 2097.. 7. R. A. Sheldon, “Catalytic reactions in ionic liquids” Chem. Commun. 23 (2001) 2399.. 8. H. Matsumoto, M. Yanagida, K. Tanimoto, M. Nomura, Y. Kitagawa, Y. Miyazaki, “Highly conductive room temperature molten salts based on small trimethylalkylammonium cations and Bis(trifluoromethylsulfonyl) imide” Chem. Lett. 29 (2000) 922. 62.
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