3-1 試藥
3-1-1 合成 [C4mim][PF6] 之藥品
1-chlorobutane, 99%, C4H9Cl, GR grade (Janssen Chimica, USA) 1-methylimidazole, 99%, C4H6N2, GRgrade (Acros, USA)
Ethyl Acetate, CH3COOC2H5, HPLC/spectro grade (Mallinckrodt, USA) Potassium hexafluorophosphate, 99%, KPF6, GR grade (Showa, Japan) Magnesium sulfate anhydrous, 99%, MgSO4, GR grade (Showa, Japan)
3-1-2 配製 Buffer solution 的試劑
Hydrochloric Acid, HCl, GR grade (Showa, Japan)
Potassium chloride, KCl, GR grade (Riedel-de Haën, Germany) Glycine, C2H5NO2, GR grade (Riedel-de Haën, Germany)
Citric Acid, 100%, HOC(COOH)(CH2COOH)2 (Anhydrous, Powder), ACS grade (J.T.Baker, USA)
Sodium Citrate, 99.6%, HOC(COONa)(CH2COONa)2·2H2O, ACS grade (J.T.Baker, USA)
Acetic Acid, CH3COOH, HPLC/spectro grade (Mallinckrodt, USA) Sodium acetate, 98.5%, CH3COONa, GR grade (Showa, Japan)
Sodium dihydrogenphosphate anhydrous, 98.0%, NaH2PO4, GR grade (Showa, Japan)
Tris(hydroxymethyl) aminomethane, (HOCH2)3CNH2, ACS grade (TEDIA, USA)
Sodium hydrogen carbonate, 99.5%, NaHCO3, GR grade (Showa, Japan) Sodium hydroxide, 96%, NaOH, GR grade (Showa, Japan)
3-1-3 蛋白質分子
Cytochrome c from Horst Heart, M.W. 12361, 97% (SIGMA, USA)
Myoglobin from equine skeletal muscle, M.W. 16952, 95-100% (SIGMA, USA)
Ribonuclease A from Bovine Pancreas, M.W. 13700, 90% (SIGMA,USA)
實驗中所使用的水為Milipore Milli-Q (Bedford, MA, USA) 所製造之 去離子水。
3-2 儀器
(1)核磁共振儀 (Bruker-DRX-300 MHz NMR)
(2)酸鹼度計 Microprocessor pH Meter SP-2200 ( Suntex )
(3)紫外光-可見光光譜儀 UV-Visible Spectrophotometer, Hewlett Packard 8453 ( Waldronn, Germany )
(4)螢光光譜儀 Fluorescence Spectrophotometer, Hitachi F-4500 ( Tokyo, Japan )
(5)圓形二相色性分光光譜儀 Circular Dichroism Spectrometer, Aviv Model 62ADS ( Lakewood, N.J.)
(6)高效能液相層析管柱:由 Polymer Laboratories 製造的 PLRP-S，
300Å，15µm 屬於 Reversed phase column，用於蛋白質的分析與定量 (7)梯度幫浦:梯度控制器 LabGrad 是由 Lab Alliance 公司製造，結合
3-3 實驗流程
3-3-1 合成 IL [C4mim][PF6]
1. 取 0.3 莫耳 1-chlorobutane 和等莫耳數的 1-methylimidazole 放入以設有迴流裝置的 250 ml 圓底燒瓶中並混合攪拌加約到 80℃，持續 24~48 小時，直到生成金黃色黏稠狀液體
1-butyl-3-methylimidazolium chloride, [C4mim]Cl。
2. 加入 50 ml 乙酸乙酯洗濯此液體並倒入分液漏斗中，取出下層 液體。
3. 取 0.3 莫耳 KPF6加入150 ml 去離子水中，攪拌直至完全溶解。
4. 將所得金黃色黏稠狀液體加入裝有 KPF6 溶液的燒杯中，以冰浴且 利用磁石攪拌約 30 分鐘，在室溫下再攪拌約 30 分鐘。
5. 攪拌後，將上述水層倒出並加入去離子水攪拌再將水層倒出，再加 入新的去離子水攪拌並倒出，重複此步驟直至水層成中性。
6. 將上層水溶液倒出後，加入硫酸鎂進行除水，再將有機層作旋轉濃 縮移除乙酸乙酯，所最後得到即為 1-butyl-3-methyl imidazolium
hexafluorophosphate, [C4mim][PF6]。
7. 合成示意圖如圖四，最後將產物拿去做 NMR 鑑定 12(圖五)。
3-3-2 細胞色素 c 正向與反向萃取 1. 配製緩衝溶液：
0.2M KCl / 0.2M HCl 調配 pH 範圍 1.0-2.1 0.1M Glycine / 0.2M HCl 調配 pH 範圍 2.2-3.5
0.1M CH3COOH / 0.1M CH3COONa 調配 pH 範圍 3.6-5.0 0.1M Citric acid / 0.1M Sodium citrate 調配 pH 範圍 5.1-6.0 0.1M Tris(hydroxymethyl)-aminomethane / 0.1M HCl 調配 pH 範 圍 7.0-9.0
0.05M NaHCO3 / 0.1M NaOH 調配 pH 範圍 10.0-11.0 0.2M NaOH / 0.2M KCl 調配 pH 範圍 12.0-13.0
2. 配製 pH 範圍 1.0-9.0 的 200 ppm 細胞色素 c 水溶液，測量 UV-Visible 吸收光譜、螢光光譜、CD 光譜，觀察細胞色素 c 是否 變性。
3. 正向萃取：
(a) 將 pH 範圍 11.0-1.0 的 200 ppm 細胞色素 c 水溶液分別取 4 ml 與含有 1 ml [C4mim][PF6]和 2 ml 乙酸乙酯的有機相置入 20 ml 樣品瓶中，以手搖晃混合 10 秒，混合完靜置 10 分鐘澄 清分層後，上層水相濃度以標準添加法校正之。此外也利用 磁石攪拌1 小時，比較萃取時間對萃取率的效應。
(b) 定量方法：使用標準添加法 (Standard Addition)，取上層水溶 液各 0.3 ml 放入五個樣品瓶中，依序添加 0、0.15、0.3、0.45、
0.6 ml 此樣品 pH 值的 200 ppm 細胞色素 c 水溶液，再全部稀 釋至 3 ml，接著測量 UV-visible 吸收值，pH1.7 以下的水溶液 取 396 nm(因為 acid- denatured state)，其它 pH 值水溶液取 409 nm 的吸收值，以線性迴歸方程式算出未知物濃度，推算萃取 率。
4. 反向萃取：
(a) 取 pH 2.7 的 200 ppm 細胞色素 c 水溶液 4 ml 與 1ml [C4mim][PF6] 和 2 ml 乙酸乙酯 的有機相在 20 ml 樣品瓶中 搖晃混合 10 秒，靜置 10 分鐘澄清分層後，將上層水相移走，
再加入 4 ml pH 範圍 2.7-12.0 的水溶液以手搖晃混合 10 秒，
混合完靜置 10 分鐘澄清分層後，上層水相濃度以標準添加法 校正之。並將反向萃取的水溶液通過Desalting column (HiTrap, column volume: 5 ml, void volume: 1.5 ml)後，進行光譜分析。
在此亦利用磁石攪拌 1 小時，比較萃取時間對反向萃取率的 效應。
(b) 定量方法：使用標準添加法，取上層水溶液各 0.3 ml 放入五 個樣品瓶中，依序添加0、0.15、0.3、0.45、0.6 ml 此樣品 pH 值的 200 ppm 細胞色素 c 水溶液，再全部稀釋至 3 ml，接著 測量 UV-visible 吸收光譜，取各水溶液 409 nm 的吸收值，以 線性迴歸方程式算出未知物濃度，推算反向萃取率。
3-3-3 肌紅蛋白正向與反向萃取
1. 緩衝溶液 如 3-3-2 所述，但 pH 2 改以 Glycine/HCl 配製。
2. 各取 8 mg 的肌紅蛋白溶解於 pH 範圍 1.0-9.0 的 20 ml 水溶液中，
由於在pH 4.0-7.0 間肌紅蛋白不易完全溶解，因此用校正曲線校正 濃度。測量水溶液UV-Visible 吸收光譜、螢光光譜、CD 光譜，觀 察肌紅蛋白是否變性。
3. 正向萃取：
(a) 將上述步驟 2 中所調配的肌紅蛋白水溶液分別取 4 ml 與含有 1 ml [C4mim][PF6]和 2 ml 乙酸乙酯的有機相置入 20 ml 樣品 瓶中，以手充分搖晃混合 10 秒，混合完靜置 10 分鐘澄清分 層後，上層水相濃度以標準添加法校正之。
(b) 定量方法：使用標準添加法，取上層水溶液各 0.3 ml 放入五 個樣品瓶中，依序添加 0、0.15、0.3、0.45、0.6 ml 此樣品 pH 值 的 肌 紅 蛋 白 水 溶 液 ， 再 全 部 稀 釋 至 3 ml ， 接 著 測 量 UV-visible 吸收值，pH 3 以下的水溶液取 370 nm (因為 acid- denatured state)，其它 pH 值水溶液取 409 nm 的吸收值，以 線性迴歸方程式算出未知物濃度，推算萃取率。
4. 反向萃取：
(a) 取步驟 2 中配製的 pH 5 肌紅蛋白水溶液 4 ml 與 1ml [C4mim][PF6] 和 2 ml 乙酸乙酯 的有機相在 20 ml 樣品瓶中 搖晃混合10 秒，靜置 10 分鐘澄清分層後，將上層水相移走，
再加入 4 ml pH 範圍 5.0-13.0 的水溶液以手充分搖晃混合 10 秒，混合完靜置 10 分鐘澄清分層後，上層水相濃度以標 準添加法校正之。並將反向萃取的水溶液通過 Desalting column 後，進行光譜分析。
(b) 定量方法：使用標準添加法，取上層水溶液各 0.3 ml 放入五 個樣品瓶中，依序添加0、0.15、0.3、0.45、0.6 ml 此樣品 pH 值 的 肌 紅 蛋 白 水 溶 液 ， 再 全 部 稀 釋 至 3 ml，接著測 量 UV-visible 吸收光譜，取各水溶液 409 nm 的吸收值，以線性 迴歸方程式算出未知物濃度，推算反向萃取率。
3-3-4 核糖核酸酶 A 正向與反向萃取
1. 緩衝溶液 如 3-3-2 所述，但 pH 2 改以 Glycine/HCl 配製。
2. 配製 pH 範圍 1.0-5.0 的 200 ppm 核糖核酸酶 A 水溶液，測量 UV-Visible 吸收光譜、螢光光譜、CD 光譜，觀察核糖核酸酶 A 是 否變性。
3. 正向萃取:
將 pH 範圍 1.0-5.0 的 200 ppm 核糖核酸酶 A 水溶液分別取 4 ml 與含有1 ml [C4mim][PF6]和 2 ml 乙酸乙酯的有機相置入 20 ml 樣 品瓶中，分別搖晃混合 10 秒，混合完靜置 10 分鐘澄清分層後，
上層水相濃度以HPLC 分析之。
4. 反向萃取:
取 pH 2 的 200 ppm 核糖核酸酶 A 水溶液 4 ml 與 1 ml [C4mim][PF6] 和 2 ml 乙酸乙酯 的有機相在 20 ml 樣品瓶中搖晃 混合 10 秒，靜置 10 分鐘澄清分層後，將上層水相移走，再加入 4 ml pH 範圍 2.0-13.0 的水溶液以手充分搖晃混合 10 秒，混合完靜 置 10 分鐘澄清分層後，上層水相濃度以 HPLC 分析之。並將反向 萃取的水溶液通過 Desalting column 後，進行光譜分析。
3-3-5 水溶液中鹽類濃度對蛋白質萃取的效應
調配不同 pH 值且 KCl 濃度分別為 0.1 M、0.2 M、0.4 M、0.6 M、
0.8 M、1 M 的細胞色素 c、肌紅蛋白及核糖核酸酶 A 水溶液，探討 水溶液中鹽類濃度對蛋白質正向萃取的影響。
3-3-6 濃縮蛋白質細胞色素 c
取 pH 2.7 的 200 ppm 細胞色素 c 水溶液 4 ml 與 1 ml [C4mim][PF6] 和 2 ml 乙酸乙酯 的有機相在 20 ml 樣品瓶中搖晃混合 10 秒，靜置 10 分鐘澄清分層後，將上層水相移走，再分別加入 0.5 ml、
1 ml、2 ml 的 pH 11 水溶液以手搖晃混合 30 秒，混合完靜置 10 分 鐘澄清分層後，上層水相濃度以標準添加法校正之，並估算回收率。
3-3-7 模擬 IL 的性質
此實驗在與[C4mim][PF6]極性相近的丁醇(表三 53)裡添加濃度分 別為2000 ppm、4000 ppm、6000 ppm、8000 ppm 的 tetrabutylammonium bromide (TBAB)模擬 IL 的性質，以驗證 IL 能萃取蛋白質可能由於其 擁有近似醇類的極性11,12與鹽類的特性。