4-1 萃取細胞色素 c
4-1-1 正向萃取
一開始嘗試利用純的[C4mim][PF6]溶解細胞色素 c，結果顯示細 胞色素c 無法溶解，文獻上記載需將細胞色素 c 做修飾才能溶於有機 溶劑中進行催化反應，54,55然而文獻上亦記載許多酵素能溶解於純的 ILs 中。29,30之後再利用純的[C4mim][PF6]與一系列不同 pH 值的細胞 色素 c 水溶液搖晃混合，發現亦無法萃取細胞色素 c。最後嘗試在 [C4mim][PF6]中加入共溶劑，發現加入乙酸乙酯或正丁醇時，即可幫 助[C4mim][PF6]相在低 pH 值水溶液時正向萃取細胞色素 c (圖六 a→
b)。
萃取結果如圖七所示，在大約 pH 3 時萃取率突然增加，但是在 pH 2 左右時萃取率又劇然下降，不過在 pH 1.7 以下又再達到幾乎 100%萃取。細胞色素 c 屬於珠狀蛋白(globular protein)的一種，且在 低pH 值時可被鹽類誘導為所謂的“熔珠＂態(Molten Globule state)，
尤其在pH 2 時。56熔珠態一般可被溫和的變性條件所誘導成，57並被 視為部分折疊的蛋白質。由圖八、圖九UV/Vis 圖譜中與文獻58相互 比較可得知，本實驗中用 HCl/KCl 所配製的 pH 2 細胞色素 c 水溶液 確實處於熔珠態。在此熔珠態時，細胞色素c 中 heme 的 Fe 離子配位
呈現mixed spin (both high spin and low spin)，因此 UV/Vis 吸收圖譜 與原始態及酸變性態皆相異。在pH 2 左右不能被萃取的原因，初步 猜測可能為蛋白質處於熔珠態時具有一個疏水核心，導致分子表面親 水性增強，不易被萃取進疏水性的[C4mim][PF6]相裡，不過仍然需有 更進一步的研究解釋此現象。但是最後發現，用Glycine/HCl 所配製 的pH 2 細胞色素 c 水溶液則可達完全的萃取，因為無金屬鹽類存在 而誘導成熔珠態。
在此實驗中也比較了萃取時間對萃取率的影響，結果顯示以手搖 晃混合10 秒與用磁石攪拌 1 小時所得到的萃取率相近(圖七)，表示 此正向萃取過程能很快達到平衡。
當細胞色素 c 被萃取進入[C4mim][PF6]相(圖六 b)後，利用光譜 觀察細胞色素 c 在[C4mim][PF6]相裡構形是否產生變化，因為文獻上 指出有機溶劑容易導致蛋白質變性而影響活性56。圖十為細胞色素 c 在 pH 7 水溶液中與在 pH 2.7 萃取進入[C4mim][PF6]相中的 UV/Vis 吸收圖譜比較，可看出細胞色素 c 在此兩種溶液中的 UV/Vis 吸收沒 有太大差異。不過由於[C4mim][PF6]對於細胞色素 c 的螢光光譜及 CD 光譜有很大的干擾，目前無法進一步得到細胞色素 c 在[C4mim][PF6] 相中的其他光譜資訊。
4-1-2 反向萃取
如圖十一所示，在 pH 3-4 之間細胞色素 c 回收率快速地增加，
pH 4-9 之間則是緩慢地上升，最後在 pH 10 以上達到幾乎 100%的回 收率。以手搖晃混合10 秒及用磁石攪拌 1 小時所得的回收率相近，
顯示反向萃取達平衡的速率與正向萃取一樣快。
將反萃出的細胞色素 c 水溶液通過 Desalting column 後(去除水溶 液中[C4mim][PF6]和乙酸乙酯對光譜的干擾)，做光譜分析。圖十二螢 光光譜中可看出，pH 1 的細胞色素 c 水溶液由於變性，導致 Tryptophan 此胺基酸外翻而增強螢光強度;59而以pH 11 反萃出的細胞色素 c 水溶 液與未萃取前pH 2.7、原始態 pH 7 的細胞色素 c 水溶液螢光強度皆 很弱，顯示細胞色素c 經由正向與反向萃取後，構形仍能維持不變。
圖十三CD 光譜中亦顯示經由 pH 11 反萃出的細胞色素 c 仍保有原本 的二級及三級結構，再次證明細胞色素c 在此相轉移的過程不會破壞 其原有的構形。
4-2 萃取肌紅蛋白
4-2-1 正向萃取
結果如圖十四所示，肌紅蛋白在 pH 5 以下能達到幾乎 100 %萃 取，且從圖十五的UV/Vis 吸收光譜可得知肌紅蛋白在 pH 3 以下由 於過酸而導致變性。此外圖十四中的pH 2 緩衝溶液是由 Glycine/HCl 所調配，如轉換以KCl/HCl 調配 pH 2 的緩衝溶液則發現萃取率下降 為50 %，原因可能為肌紅蛋白也是屬於珠狀蛋白，在低 pH 值下也會
被金屬鹽類誘導為熔珠態進而影響萃取效果。
另外也利用 UV/Vis 吸收光譜觀察肌紅蛋白萃取進入 IL 相後構形 是否產生變化，從圖十六中可得知，409 nm 此波峰無 shift，不過原 本的280 nm 及 500 nm 此兩波峰皆有 shift 的現象，原因或許與 IL 的 高極性環境有關。
4-2-2 反向萃取
如圖十七所示，肌紅蛋白在 pH 5 至 12 的回收率相當低，到了 pH 13 的回收率也不到 50 %，猜測不易回收的原因可能為肌紅蛋白屬 於較疏水性的蛋白質，不易返回水層中，因為把肌紅蛋白水溶液與正 丁醇混合分層後，即發現大約 75 % 的肌紅蛋白會被萃取進正丁醇 裡，顯示肌紅蛋白有一定的疏水性。我們也嘗試在反向萃取的水溶液 添加KCl 濃度分別為 1 M 及 2 M，探討是否能增加反向萃取率，但 發現並無效果。將反萃取出的 pH 13 水溶液通過 Desalting column 後 做光譜分析，結果顯示在螢光光譜(圖十八)與CD 光譜(圖十九)皆產 生了變異，表示肌紅蛋白在經過此相轉移過程後，立體構形已遭破壞。
4-3 萃取核糖核酸酶 A
4-3-1 正向萃取
結果如圖二十所示，核糖核酸酶 A 在 pH 3 至 pH 2 時萃取率大幅
%。利用 HCl/KCl 配製 pH 2 的緩衝溶液進行萃取測試，發現無萃取 效果，此結果可能也是蛋白質熔珠態所致，因為核糖核酸酶 A 亦是 屬於珠狀蛋白的一種。
4-3-2 反向萃取
如圖二十一所示，核糖核酸酶 A 從 pH 3 開始即可慢慢被反萃回 水相中，到了pH 13 的回收率約為 60 %，表示可以將正向萃取的核 糖核酸酶 A 全部回收至水相。從螢光光譜(圖二十二)及 CD 光譜(圖 二十三)可觀察出，回收從 pH 10 開始，核糖核酸酶 A 的光譜即產生 了變化。
4-4 水溶液中鹽類濃度對蛋白質正向萃取的效應
此實驗是為了探討水溶液中鹽類的存在，對於利用 IL 正向萃取 蛋白質是否也會跟利用反微胞萃取蛋白質一樣有遮蔽效應( screening effect )而影響蛋白質萃取。圖二十四為不同 pH 值下，不同 KCl 濃度 對於細胞色素c 正向萃取的影響，可得知 KCl 濃度越高，萃取率越低，
顯示水溶液中鹽類對於細胞色素c 的萃取會有遮蔽效應的存在，且在 pH 1 的影響大於在 pH 2.7，原因為在 pH 1 時，KCl 濃度越大，細胞 色素 c 即漸漸由酸變性態被誘導成熔珠態 (由圖二十五 UV/Vis 光譜 可觀察出，因為波峰有紅位移的趨勢)，進而更影響萃取效果。圖二
中鹽類的存在，並不會影響肌紅蛋白的萃取，可能由於肌紅蛋白疏水 程度強的原因。圖二十七為在pH 2 不同 KCl 濃度對於核糖核酸酶 A 萃取影響的結果，發現在KCl 0.1 M 即無萃取效果，表示 KCl 的存在 明顯地干擾核糖核酸酶A 的萃取。
4-5 濃縮蛋白質 細胞色素 c
在此理論的濃縮倍數分別為 2、4、8 倍，結果如表五，濃縮倍 數越大回收率漸趨減少，因為濃縮倍數越大即加入新的水相體積要越 小，會造成與 IL 相較不易均勻混合攪拌，導致回收率降低。不過此 實驗證明了以 IL 當萃取劑濃縮蛋白質的可行性。
4-6 模擬 IL 性質
在參考文獻[26]關於金奈米及金奈米棒相轉移的研究發現，當 10-undecen-1-ol 中添加 TBAB 此鹽類濃度越高時，金奈米及金奈米 棒相轉移的效率越好，以驗證 IL 能直接完全將金奈米及金奈米棒做 水相至 IL 相的轉移主要原因可能為 IL 其近似醇類的極性及鹽類的 特性。
我們初步實驗發現將 pH 5 的肌紅蛋白水溶液與正丁醇混合分層 後，大約 75 %的肌紅蛋白會被萃取進入正丁醇。而且正丁醇的極性
與IL [C4mim][PF6]相近(表三)，因此在正丁醇添加不同濃度的 TBAB 後發現，TBAB 的濃度越高，對於肌紅蛋白的萃取效果越好，如表四 所示，當添加TBAB 濃度到 8000 ppm 時，萃取率增加了 15 %。由以 上結果可驗證，IL 能萃取蛋白質，亦可能由於其擁有近似醇類的極 性及鹽類的特性所致。
4-7 IL 萃取蛋白質的機制
有文獻研究胺基酸在 IL 與水之間的分佈行為，60他們指出當胺 基酸的疏水性越強，以及水溶液的pH 值越低時，胺基酸的分佈係數 即越大(圖二十八及圖二十九)，而導致此現象的原因他們推測為胺基 酸在低pH 值是呈現正電性，會與 IL 中的陰離子有靜電吸引力而偏向 分佈於 IL 中。在本研究中，我們推測萃取機制也是由於蛋白質在低 pH 值時呈現較強的正電性，因此被[C4mim][PF6]的陰離子, PF6-,由於 靜電吸引力而萃取至IL 相中;當處在比正向萃取的 pH 值高時，蛋白 質的陰電性增強，此時蛋白質與PF6-的靜電斥力增強，導致蛋白質慢 慢被釋放至水層中。此結果也與文獻[29],[61]所提及的解釋相符，ILs 能溶解物質主要是與其陰離子與物質間的作用力有關。