A. HPLC 分析條件
層析管(Column) Merck LiChrospHer 100 RP-18e column (250x4mm) endcapped,(5μm)
保護管柱(Pre-column)Merck LichrospHer l00 RP-18 Endcapped (5μm)
檢測波長 UV 270 nm 流速 0.6 mL/min 注入量 100 μL 分析時間 22 分鐘
移動相 MeOH : ACN：0.1% acetic acid/water =3 :0.5：96.5 (用磷酸調 pH=2.8)
內部標準品 4-氯尿嘧啶(4-Chlorouracil)
B. 血漿檢品之前處理
精確量取血漿檢品 180.0 μL 置入試管中，加入 20 μL 之內部標 準品 4-氯尿嘧啶、及 20 μL 之尿嘧啶，先加入 150 μL NaOH 以 試管震盪器振盪 30 秒充分混合後，再加入 600 μL 異丙醇-乙酸 乙酯(15：85，V/V)再以試管震盪器振盪 30 秒充分混合後使血漿 蛋白沉澱。以 3500 rpm 離心 20 分鐘。吸取上清液 600 μL 置於 試管中，此步驟重複 3 次後以氮氣噴吹至乾，以 200 μL 之純水 溶解，接著以 HPLC 分析。
C. 檢量線之製作
精確量取血漿檢品 180.0 μL 置入試管中，加入 20 μL 之內部標 準品 4-氯尿嘧啶、及 20 μL 之尿嘧啶，先加入 150 μL NaOH 以 試管震盪器振盪 30 秒充分混合後，再加入 600 μL 異丙醇-乙酸 乙酯(15：85，V/V)再以試管震盪器振盪 30 秒充分混合後使血漿 蛋白沉澱。以 3500rpm 離心 20 分鐘。吸取上清液 600 μL 置於 試管中，此步驟重複 3 次後以氮氣噴吹至乾，以 200 μL 之純水 溶解，接著以 HPLC 分析。由圖譜所得之 尿嘧啶與 4-氯尿嘧啶 波峰之面積比與理論濃度作線性回歸以製作檢量線。
表 2. 尿嘧啶標準濃度血漿檢品溶液之製備
標準溶液濃度 (μg/mL)
取量 (20μL)
空白血漿體積 (μL)
濃度 (μg/mL)
800.00 20 180 80.00
100.00 20 180 10.00
50.00 20 180 5.00
25.00 20 180 25.0
6.25 20 180 0.63
3.13 20 180 0.31
1.56 20 180 0.16
0.78 20 180 0.078
D. 回收率試驗(Recovery)
F. 靈敏度試驗(Sensitivity)
最低偵測極限試驗(Limit of Detection ，LOD) ，是不斷稀釋尿嘧 啶至 3 種低濃度 390、195、97.5 ng/mL，以 HPLC 分析求得 3 組波 峰高度數據與對照的 3 種低濃度做線性回歸，可得各組回歸方程式截 距之標準偏差(σ)和總回歸方程式之斜率(S)，依 ICH 計算求得最低偵 測 極 限 (LOD=3.3xσ/s) 與 最 低 準 確 測 量 濃 度 (Limit of Quantitation,LOQ=10xσ/s) ，最後再將計算求得的 LOQ 依檢量線之 製作，採標準血漿檢品製備方法分析之。
G. 安定性試驗
(1) -30℃下尿嘧啶在家兔血漿中之安定性試驗
取 20 μL 濃度為 50 、6.25 、1.56 μg/mL 之尿嘧啶標準液，加 入 180 μL 之空白血漿中，震盪 30 秒以混合均勻，即得濃度為 5 、 0.63 、0.16 μg/mL 之尿嘧啶血漿檢品，將其分裝後置於 -30℃的冷 凍櫃中，於第 0、1、3、6、10、15、21 天分別取出 1 組檢品(n=3)。
解凍後，依血漿檢品之前處理方法處理後，以 HPLC 分析，並紀錄濃 度變化之情形。
(2) 25℃下尿嘧啶在家兔血漿中之安定性試驗
取 20 μL 濃度為 50 、6.25 、1.56 μg/mL 之尿嘧啶標準液，加 入 180 μL 之空白血漿中，震盪 30 秒以混合均勻，即得濃度為 5 、 0.63 、0.16 μg/mL 之尿嘧啶血漿檢品，將其分裝後置於室溫 25℃
下，於第 0、1、3、6、12、24、48 小時分別取出 1 組檢品 (n=3)。
解凍後，依血漿檢品之前處理方法處理後，以 HPLC 分析，並紀錄濃 度變化之情形。
2. 尿嘧啶(Uracil)在家兔體內之藥物動力學實驗
A. 實驗設計
取雄性家兔六隻，體重介於 1.7 至 3.1 公斤之間，每隻家兔以尿嘧啶 標準溶液靜脈注射及口服投藥。實驗家兔之重量、給藥順序及劑量標 示於表 3，每次給藥後至下次給藥，時間須相隔一週以上。
表 3. 實驗家兔之體重
※口服
Rabbit No. 给藥劑量
NO.1 NO.2 NO.3 NO.4 NO.5 NO.6
2 mg/kg 3.1 3.0 3.0 3.1 1.9 1.9
10mg/kg 2.7 2.7 3.2 3.2 1.9 2.4
Weight (kg)
100mg/kg 2.9 2.8 3.1 3.1 1.9 2.5
平均約為 2.69±0.49 公斤
※靜脈注射
Rabbit No.
給藥劑量
NO.1 NO.2 NO.3 NO.4 NO.5 NO.6
2mg/kg 1.7 2.9 2.7 3.1 2.7 2.4
10mg/kg 2.8 2.4 1.9 2.3 3.0 2.8
Weight (kg)
100mg/kg 3.0 2.9 2.8 2.7 2.8 3.0
表 4. 實驗家兔給藥之劑量
靜脈注射及口服
一倍 五倍 五十倍
尿嘧啶指 標成分溶
液 2 mg/kg 10 mg/kg 100 mg/kg