一、 中文摘要
神經膠質母細胞瘤是成人最常見且高侵略性的原發惡性腦腫 瘤。它的侵襲力和耐傳統療法使其成為極易復發的惡性腫瘤。
Rac 蛋白質屬於 Rho GTP 酶亞家族，其主要功能包括調節細胞運 動，增殖和存活。為了探究 Rac 蛋白質是否可以作為膠質母細胞 瘤的新治療標靶，特別是對於神經膠質母細胞瘤幹細胞，我們利 用其類癌幹細胞株建立了斑馬魚的異體移植模式來研究抑制 Rac 蛋白質對於神經膠質母細胞瘤的致癌性影響。
我們將表達控制組的 shRNA 或者是針對 Rac 蛋白質做抑制的 shRNA 序列和綠螢光蛋白的神經膠質母細胞瘤細胞株 U251-MG 和 U373-MG 培養於低分化培養液中，以形成腫瘤細胞球
(tumorspheroids)。這些體外培養的球體細胞有著幹細胞的特性。
我們將這些細胞以顯微注射的方式注射進入受精後兩天大的血管 紅螢光轉基因斑馬魚 Tg(kdr: mCherry)的卵黃囊。觀察發現注入 的癌細胞誘導了血管新生作用的發生，而表達 shRacs 細胞萎縮且 並未引發血管新生作用。另外，注射 shRacs 細胞的魚隻生存率也 較高。
從我們的研究結果，Rac 蛋白質會誘導膠質瘤幹細胞引發血
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管新生作用，並且可做為一個生物標誌。因此，Rac 蛋白質可能 可以進一步應用在神經膠質母細胞瘤的標靶治療上。
另一方面，我們也利用注射肝癌細胞株 Hep3B 進入受精後兩 天大的斑馬魚卵黃囊中，來觀察 Hep3B 細胞的遷移現象，此模式 約有 20%的魚隻可觀察到細胞遷移。
關鍵字：神經膠質母細胞瘤、肝細胞癌、斑馬魚、Rac 蛋白質與 血管新生
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I. Abstract
Glioblastoma is the most common and aggressive malignant primary brain tumor in adults. Its invasiveness and resistance to traditional
therapies make it a highly recurrent malignant disease with poor prognosis. Rac proteins belong to the Rho small GTPase subfamily,
which major functions include regulation of cell movement, proliferation, and survival. To investigate whether Rac proteins can serve as new
therapeutic targets for glioblastoma, especially for glioblastoma stem cells, we established a zebrafish xenotransplantation model to study the effects of Rac proteins in glioblastoma.
Glioblastoma cell lines U373 and U251 expressing short hairpin RNA targeting Rac proteins or control RNA sequence and green
fluorescence protein were generated and cultured in low differentiating medium to form tumorspheroids. These spheroid cells harbor stem cell properties and mimic stem cells in vitro. We injected these cells to egg yolk of zebrafish Tg(kdr: mCherry) on 2 post-fertilization-day stage(pfd).
The behaviors of the injected cells were then monitored every day by the confocal microscope.
We observed that the cells expressing control scramble RNA
sequence induced angiogenesis in the egg yolk of the fish, while the cells expressing shRacs shrank inside the fish and did not induce angiogenesis.
The overall survival rates of fishes were also higher in the fishes injected shRac cells instead of fishes with control scramble RNA cells.
From our results, we conclude that Rac proteins induce angiogenesis of glioblastoma stem cells and serve as a poor prognosis marker.
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Therefore, Rac proteins could further be the potential therapeutic targets of glioblastoma and its stem cells.
On the other hand, we also inject the hepatocellular carcinoma cell line- Hep3B into egg yolk of zebrafish on 2 pfd stage to observe the migration of Hep3B cells. We have successfully established the in vivo migration/metastasis model of Hep3B cells in zebrafish of which the metastasis rate is about 20%.
Keywords: Glioblastoma, Hepatocellular carcinoma, Zebrafish, Rac and Angiogenesis
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二、 緒論
1. 斑馬魚 (Zebrafish)
斑馬魚為鯉科(Cyprinidae)的小型亞熱帶淡水魚類，成魚體長 約 3-4 公分，適合生長的水溫為 23-28℃。其每次產卵約可產下 100-200 顆。
其為重要的脊椎模式物種生物，近年來常被利用來研究遺 傳、發育、藥物篩選、毒物測試及人類的疾病。
斑馬魚的優點在於其為脊椎動物，有著與人類相似的各種器 官，例如心血管系統。且斑馬魚早期的胚胎是透明的，有利於觀 察其發育過程的型態變化。還有，斑馬魚只需簡單的設備即能飼 養，花費較低。再者，斑馬魚的性成熟時間短，約三到四個月即 能繁衍後代，且子代數量頗多。最後，其容易進行誘發性的突 變，有利於基因功能方面的研究。
2. 腦癌 (Brain cancer)
腦癌的定義為局部腦組織細胞發生不正常的分裂增殖而生成瘤 塊。神經膠質瘤(glioma) 為最常發生在成人腦部的惡性原位腦癌，
其中包含了星細胞瘤(astrocytoma)、 寡突細胞瘤(oligodendroglioma) 和室管膜細胞瘤(ependymoma)等(Maher et al., 2001)。
在成人的原位腦癌中，大多數為神經膠質母細胞瘤。儘管治療
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的方法很多，但手術後復原情況差，治療後的中位存活時間(median survival time)約為一年(de Almeida Sassi et al., 2012; Shahar et al., 2012)，且容易復發。
在遺傳學、細胞生物學以及動物模式過去二十年的研究中，試 圖了解神經膠質母細胞瘤發生的原因以及發展，但還是尚未有個明 確的結果(Batista et al., 2014)。過去有許多的證據指出，神經膠質母 細胞瘤的起源來自於正常的膠細胞(glial cells)，但最近有越來越多的 證據將矛頭指向神經幹細胞或神經前驅細胞(Galli et al., 2004; Singh et al., 2004)。
近期有一項新的研究理論指出，神經膠質母細胞瘤之所以容易 復發的原因是有癌症幹細胞的存在。癌症幹細胞假說(The cancer stem cell hypothesis)認為，腫瘤群落中存在著一群數量極少且具有幹 細胞特性的細胞(Singh et al., 2004)。而神經膠質母細胞瘤可能含有 多潛能性的癌症幹細胞且其具有增生(populating)和再增生
(repopulating)的能力。
3. 肝癌 (Liver cancer)
肝癌在肝臟為最常見的原發性癌症，在常見的癌症當中排名第 六，且因肝癌而死亡的人口數在全球排名第三(Galuppo et al.,
2013)。而肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見的肝癌類
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型，在病例當中約佔 70%到 85% (Hai et al., 2014)。
肝癌根據來源的部位可以分成兩大類，一是源自於肝臟的原發 性肝癌，另一是轉移性肝癌，癌最初在身體其他部位產生，後來才 散到肝臟。
肝癌的發生原因至今尚未非常明瞭，但與肝炎病毒的感染(B 型 肝炎，Hepatitis B virus, HBV 或 C 型肝炎，Hepatitis C virus, HCV 等)和酗酒所造成的酒精毒性有很大關係。由於肝炎病毒會導致肝臟 反覆性的發炎，造成肝臟的損害，最後導致肝硬化而增加罹患肝癌 的機率。根據研究，在亞洲與北美洲，B 型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen, HBsAg)帶原者與非感染者相比，罹患肝癌的風險 增加了二十五至三十七倍(Hai et al., 2014)。另外，根據研究指出，
百分之八十以上的原發性肝癌與 C 型肝炎有關(Lee, 2013)。
肝癌初期的症狀並不明顯，甚至腫瘤也不會引起疼痛或者其它 症狀。大多數的患者皆是到了中晚期出現肝痛、乏力、消瘦、黃疸 或腹水等症狀才被診斷出罹患癌肝。晚期確診的病患各種治療方式 效果皆不顯著，平均只能存活三至六個月。
目前治療肝癌的方法有傳統的手術切除、肝臟移植或化學治 療。較新穎的治療方式則有經皮酒精注射治療(Percutaneous Ethanol Injection, PEI)、射頻燒灼術(Radiofrequency Ablation, RFA)或標靶治
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療等(Singla et al., 2014)。
4. 癌症幹細胞 (cancer stem cells)
在癌症生物學上，對於腫瘤的形成還沒有一套公認的理論 (Ojha et al., 2014)。最被廣為接受的說法是由於遺傳物質(DNA)的損傷而造 成的基因的突變(mutation)，例如致癌基因(oncogenes)或抑癌基因 (tumor suppressor genes)，而造成細胞的增殖與生長(growth)不受控制 而使細胞癌化(Kasai et al., 2014)。
由於研究技術的日新月異，科學家們在癌症細胞株中或者是異 質性(heterogeneous)高的臨床的癌症檢體中皆分離出一小群細胞，稱 之為邊緣細胞群(side population)，它們有著類似幹細胞的特性，會 自我更新也會分化，科學家便將這群細胞命名為類癌幹細胞(cancer stem-like cells) (Kong et al., 2014)。由於它們具有抗藥性(chemo-resistance)、抗放射性(radio-resistance)和高致腫瘤性(tumorigenicity) 以及它們與癌症的進展(progression)、轉移(metastasis)、復發
(recurrence)以及多重抗藥性(multidrug resistance)有關，所以有另一 派的科學家稱之為腫瘤起始細胞(tumor-initiating cell)或是癌症幹細 胞(Kong et al., 2014; Wong and Kumar, 2014)。
癌症幹細胞的來源科學界尚未有定論，各式各樣的理論眾說紛 紜。由於不同的組織或細胞有著不同的來源，所以許多的理論皆有
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可能是正確的。目前最被科學家相信的假說如下：
(1)由成體幹細胞突變而來：有些細胞的汰換速率(turnover rate)較 快，例如皮膚與腸道細胞，因此這類型的成體幹細胞可能累積了較 多的突變使得幹細胞癌化。 (2)幹細胞的棲位發生突變：調控幹細 胞特性的棲位發生突變也可能是使得正常的幹細胞轉變成癌症幹細 胞的原因之一(Kasai et al., 2014)。 (3)已突變的細胞發生去分化 (dedifferentiation)：已突變的細胞發生去分化的現象使其退回類幹細 胞的階段(Stiles and Rowitch, 2008)。
5. Rac 蛋白質 (ras-related C3 botulinum toxin substrate) Rac 蛋白質是屬於 Rho GTP 水解酶(GTP ase)的亞家族
(subfamily) (Aspenstrom et al., 2004)。其主要的功能是調控肌動蛋 白細胞骨架的重新排列(actin cytoskeleton rearrangement) (Ridley et al., 1992)。這個蛋白質超家族調節不同的細胞功能，包括細胞生 長、細胞骨架重組、以及幹細胞在發育過程中的恆定(Aspenstrom et al., 2004)。
除了在正常的細胞功能上扮演著重要的調節作用，越來越多 的研究已經在腫瘤發展上報導了它們的作用(Mack et al., 2011)。
Rac 蛋白含有四種亞型：Rac1, Rac2, Rac3 and RhoG (Aspenstrom et al., 2004)。其中，Rac1 是其中的主要成員並且已經被研究得最
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清楚透徹(Higashi et al., 2009)，過去的研究中發現，其會調控癌 細胞的遷移(Yang et al., 2012)。另外還有研究指出 Rac1 會調控神 經脊幹細胞(neural crest stem cell)的遷移(Mayor and Theveneau, 2014)。Rac2 主要表達在造血細胞中。其除了調控細胞遷移之 外，還參與了嗜中性球(neutrophil)胞吐作用(exocytosis)的調控 (Abdel-Latif et al., 2004)、調節環氧合酶-2 (Cyclooxygenase-2)的表 達(Azim et al., 2007)以及維持巨噬細胞的形態(Wheeler et al., 2006)。Rac3 主要表現在大腦組織中，其它組的表現量則較低 (Haataja et al., 1997)。最近的研究指出，它會負向調控細胞自噬 (autophagy)以及當作 ER α 核受體(nuclear receptor ER α)的共活化 物(co-activator) (Walker et al., 2011)。而 RhoG 仍然是被研究較少 的亞型，其在腫瘤細胞中的作用仍尚不明確(Kwiatkowska et al., 2012)。但 RhoG 被鑑定為生長因子反應基因(growth factor
response gene) (Vincent et al., 1992)，並且過去的研究中指出其與 細胞遷移和細胞存活有關(Katoh et al., 2006; Murga et al., 2002)。
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三、 材料與方法 1. 材料
(1) Zebrafish: Tg(kdr: mCherry) (2) Cell line
a. U251-MG:
U251-SC (shScramble transfected); U251-siRac2 (shRac2 stably transfected)
b. U373-MG:
U373-SC (shScramble transfected); U373-siRac1, 2, 3 (shRac1 or 2 or 3 stably transfected)
c. Hep3B (3) Chemical
a. Tricane (Sigma) b. Matrigel (BD) c. Mineral oil (Sigma)
d. DMEM/F-12 medium (Gibco) e. B-27 (Gibco)
f. bFGF, EGF (Sigma)
g. N,N-Dimethyl formamide (Sigma) (4) Micropipette (Drummond Scientific)
(5) Flaming/Brown Micropipette Puller (Sutter, P-97) (6) Microinjector (Drummond Scientific, Nanoject II) (7) Agarose mold (Adaptive Science Tools, TU-1) (8) 96-well plate
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2. 方法
(1) 培養液製備
將粉狀 DMEM/F-12 以二次水加至 1000 ml 攪拌均勻。以 0.2 μm 孔徑的濾杯過濾之。每 500 ml 加入 10 ml 的 B-27、5μg 的 bFGF、5μg 的 EGF 和 5 ml 的 Pen-Strep 抗生素即製備完成。
(2) 細胞培養
將細胞株以懸浮培養的方式培養在非細胞培養(non-cell culture)的培養皿(petri dish)中，使用上述培養液將其培養成球狀 (sphere)。這些球狀細胞有著接近癌症幹細胞(cancer stem cell)的 特性，故稱之為類癌幹細胞(cancer stem-like cells)。
(3) 細胞製備
培養成球狀的細胞以一千轉 (1000 rpm)離心 5 分鐘將細胞收 下。抽乾 medium 後加入 200 μl 的胰蛋白酶(trypsin)處理 5 分鐘 後，加入 1 ml 的 DMEM medium 以重複 pipetting 的方式打散後 計算其細胞數。取 2.5 X 105的細胞數加入 10 ml 的 DMEM/F-12 medium 繼代培養。其餘細胞離心一次，取約 1 X 105的細胞打散 至4 μl 的 DMEM/F-12 medium 中並加入體積之 20%的 matrigel 模 仿細胞在生物體內有胞外基質(extra cellulose matrix, ECM)的環 境，以備注射。
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(4) 毛細管針的製備
將毛細管架上拉針器，以下列條件進行拉針：「pressure:
500；heat: 560；pull: 100；velocity: 50；delay time: 200」。 需進 行顯微注射時，再將拉好的針在顯微鏡下以刀片斷針，口徑大小
500；heat: 560；pull: 100；velocity: 50；delay time: 200」。 需進 行顯微注射時，再將拉好的針在顯微鏡下以刀片斷針，口徑大小