I. Trip6 蛋白質在小鼠腦中之表現 II. 建立人類惡性腫瘤之斑馬魚異體移植模式

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. I. Trip6 蛋白質在小鼠腦中之表現 II. 建立人類惡性腫瘤之斑馬魚異體移植模式 I. The Expression Pattern of Trip6 in Mouse Brain II. Establishing Zebrafish Xenotransplantation Model of Human Malignant Tumors. 研究生：楊程堯 Cheng-Yao Yang 指導教授：賴韻如博士 Dr. Yun-Ju Lai 中華民國 103 年. 07 月.

(2) 致謝感謝我的指導老師，對於我不辭辛勞的指導。感謝我們研究室的同學和學弟學妹們對我的幫助。還有研究所的同班同學們，大家的日子一樣難熬，但是真的很感謝你們在這樣艱困的日子裡還不時地給我幫助、給我鼓勵甚至是帶給我快樂。感謝學長姐們在實驗技術上的教導。感謝各方大德給予我的各式各樣的援助。有時候在想，要感謝的人太多了，還真的想引用陳之藩的謝天：『要感謝的人太多了，那就謝天吧！』最後，感謝國立台灣師範大學給予我的一切。再見了！. 1.

(3) 目錄壹、TRIP 蛋白質在小鼠腦中之表現 ................................................... 3 Trip6 蛋一、中文摘要 ......................................................................................... 3 I. 英文摘要.............................................................................................. 5 二、緒論 ................................................................................................. 6 三、材料與方法 ................................................................................... 13 四、結果 ............................................................................................... 19 五、討論 ............................................................................................... 24 貳、建立人類惡性腫瘤之斑馬魚異體移植模式 .................................. 29 一、中文摘要 ....................................................................................... 29 I. 英文摘要............................................................................................ 31 二、緒論 ............................................................................................... 33 三、材料與方法 ................................................................................... 39 四、結果 ............................................................................................... 43 五、討論 ............................................................................................... 47 參、參考文獻 .......................................................................................... 51 肆、圖表................................................................................................... 62. 2.

(4) 壹、 Trip6 蛋白質在小鼠腦中之表現一、中文摘要甲狀腺素受體作用蛋白質 6 (Thyroid receptor-interacting protein 6, Trip6)是一種焦點連接(focal adhesion)分子，它調控一些細胞機制如：細胞之間的連接(cell adhesion)、細胞的遷移(cell migration)以及基因轉錄的活化 (gene transactivation)。過去研究指出 Trip6 屬於幹細胞性(stemness)的基因，在不同的幹細胞中具有較高的表現量。為了探究 Trip6 在神經幹細胞所扮演的角色，我們分別檢測了 Trip6 蛋白質在胚胎與成年小鼠大腦中的表現量。發現 Trip6 的 mRNA 主要在胚胎小鼠的腦中有表現，但在成年小鼠腦中則比較低或偵測不到。其蛋白質也只可以在胚胎小鼠的大腦中被偵測到，成年小鼠則否。另外我們在胚胎與成年小鼠的大腦組織切片中，以不同的細胞標誌與 Trip6 進行組織免疫螢光染色。包括幹細胞的標誌 Sox2、增殖中細胞的標誌 Ki67、室管膜細胞的標誌 S100β、神經母細胞的標誌 DCX、神經元的標誌 MAP2、星狀細胞的標誌 GFAP 以及小膠質細胞的標誌(Iba1)。我們發現 Trip6 主要表達在胚胎小鼠的腦室區 (ventricular zone, VZ)以及出生後小鼠的腦室下區(subventricular zone, SVZ)內的神經幹細胞(neural stem cells, NSC)中。這樣的結果支持 Trip6 可能在調控幹細胞的特性中是一個重要的關鍵。 3.

(5) 關鍵字：神經幹細胞、甲狀腺素受體作用蛋白質 6、神經新生與腦室下區. 4.

(6) I. Abstract Trip6 (Thyroid receptor-interacting protein 6) is a focal adhesion molecule and its function is related to cell adhesion, cell migration and gene transactivation. Trip6 has been identified as a “stemness” gene which expresses higher in different lineage of stem cells. To investigate the role of Trip6 in neural stem cells, we examined the expression level of Trip6 in the brains of embryonic and adult mice, and found that the mRNA of Trip6 is detected in the embryonic mouse brain but low or undetectable in the adult mice brain. Similarly, the protein level of Trip6 is only detected in the embryonic mouse brains by western blot. We also performed double immunofluorecence with Trip6 and different cellular markers, including, stem cells marker- Sox2, proliferating cells markerKi67, ependymal cells marker- S100β, neuroblast marker- DCX, neuron maker- MAP2, astrocytes marker- GFAP and microglia marker- Iba1.We found that Trip6 was expressed by neural stem cells in the ventricular zone and subventricular zone of embryonic and postnatal mouse brains, respectively. Taken together, Trip6 may play an important role in regulation of neural stem cell (NSC) properties.. Keywords: Neural stem cells, Trip6, Neurogenesis and Subventricular zone. 5.

(7) 二、緒論 1. 胚胎神經新生 (Embryonic neurogenesis) 在胚胎時期，神經系統的發育是一段複雜且全面性的過程。從胚胎階段至成年，神經新生會受到嚴謹的調控(Gotz and Huttner, 2005)。哺乳類動物在神經系統發育的階段，神經幹細胞會出現在神經管(neural tube)的腦室區(ventricular zone)，並且經由對稱分裂 (symmetric dividing)和不對稱分裂(asymmetric dividing)製造出所有神經系統的相關細胞，例如神經元、星狀細胞(astrocytes)和寡突細胞 (oligodendrocytes)等(Gotz and Huttner, 2005)。一開始，神經幹細胞會先產生前驅細胞(progenitor cells)，接著才會進一步的生成神經元和神經膠細胞(Johansson et al., 1999 )。研究指出，在大腦皮層(cerebral cortex)裡，新的神經元會沿著放射狀膠質細胞(radial glia)的軸突遷移至外層並且建立皮質層(cortical layers) (Nadarajah et al., 2001)。早期的研究發現，在發育過程中的胜肽生長因子(peptide growth factors)，例如纖維母細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和轉化生長因子(transforming growth factor-α, TGF-α)，在調控神經新生的機制中為一個很重要的因子。它們參與了許多機制的調控，例如細胞增殖(cell proliferation)、分化(differentiation)、遷移(migration)與成熟化(maturation)，甚至細胞的生存(survival) (Lee et al., 2009)。 6.

(8) 2. 成年神經新生 (Adult neurogenesis) 在成年哺乳類動物的大腦中，尚有兩個區域有神經幹細胞的存在，一個位於側腦室(lateral ventricle)旁的腦室下區(subventricular zone, SVZ)，另一個位於齒狀迴(dentate gyrus)的顆粒下層區 (subgranular zone, SGZ) (Corotto et al., 1993; Luskin, 1993; Seki and Arai, 1993)。因為如此，這兩個區域還保有神經新生 (neurogenesis) 。 (1) 位於腦室下區的神經新生在成年的哺乳類動物大腦中，腦室下區裡的神經幹細胞會產生短暫增殖細胞 (transit-amplifying cells)接著再生成神經母細胞 (neuroblast)。神經母細胞會經由喙側遷移流(rostral migratory stream, RMS) 的路徑遷移至嗅球(olfactory bulb, OB)，並進一步的分化成神經元(neuron)並且整合至嗅球的神經迴路中(Gonzales-Roybal and Lim, 2013)。這邊的神經幹細胞被研究報導指出會表現 Nestin、Vimentin 或 GFAP 等標誌(Ming and Song, 2011)。除了上述的細胞種類以外，在腦室下區的外側會有一群稱之為室管膜細胞(ependymal cells)的細胞。另外，還有屬於神經膠細胞的星狀細胞(astrocyte)和不屬於神經系統類群的小膠質細胞(microglia) (Kaneko et al., 2013)。. 7.

(9) 室管膜細胞是一種型態類似上皮細胞的神經膠細胞，其會整齊排列在大腦腦室的邊緣形成室管膜(ependymal)，它們參與了腦脊髓液(cerebrospinal fluid, CSF)的製造。星狀細胞是一種型態上類似星形的神經膠細胞，位於大腦與脊髓中，也是在人類大腦中數量最多的細胞。它們執掌許多功能，例如組成血腦屏障(blood–brain barrier, BBB)、提供營養物質給神經元、維持胞外離子的恆定以及大腦或脊髓受傷後的修復等。小膠質細胞為在中樞神經系統裡與免疫有關的細胞，其主要的功能與免疫反應有關。 (2) 位於顆粒下層區的神經新生顆粒下層區裡的神經幹細胞會最先分化成非輻射狀前驅細胞 (nonradial precursor)，接著再分化成中間型前驅細胞(intermediate progenitor cell)、神經母細胞(neuroblast)後，最後才會分化成新生的神經元，並以放射狀的途徑遷徙至較上方的顆粒層(granular layer)。大約經過八周的時間便會發育成成熟的神經元然後整合進入原有的神經迴路(Gemma and Bachstetter, 2013)，並負責空間上的記憶與學習(Ming and Song, 2011)。這邊的神經幹細胞被研究報導指出會表現 Nestin、Sox2、GFAP 或 BLBP 等標誌(Ming and Song, 2011)。. 8.

(10) 3. 神經幹細胞 (Neural stem cells, NSCs) 幹細胞主要分為兩群，胚胎幹細胞(embryonic stem cells)和成體幹細胞(adult stem cells) (NIH, 2009)。胚胎幹細胞來自囊胚(Blastula) 中的內細胞團(inner cell mass)，其具有多功能性(pluripotency)的特性，在發育的過程中能形成三個胚層，分別是內胚層(endoderm)、中胚層(mesoderm)和外胚層(ectoderm)。而成體幹細胞則來自生物體內各式各樣的組織。具有多潛能性(multipotency)，可以分化成特定組織的細胞。而上述兩種幹細胞皆具有自我更新(self-renewal)的能力。神經幹細胞屬於成體幹細胞(NIH, 2009)。在早期神經系統的發育中，神經幹細胞會以不對稱分裂的方式產生兩種子代細胞，一個為與母細胞一樣的幹細胞，另一個則是前驅細胞(progenitor cells)，而前驅細胞又可分為兩種，其一為神經性的前驅細胞(neural progenitor cells)，其將來會形成神經元。而另一種為膠細胞性的前驅細胞(glia progenitor cells)，最後會產生出星狀細胞或者是寡突細胞 (oligodendrocyte) (MAO and WANG, 2003)。然而在神經幹細胞的棲位(niche)中，型態發生因子(morphogen) 和轉錄因子(transcription factor)在調控幹細胞的自我更新和多潛能性上扮演著重要的一環(Gong et al., 2007; Wang et al., 2011; Wang et al., 9.

(11) 2005)。主要的型態發生因子，包括 wingless-type MMTV integration site family (Wnt)、骨塑型蛋白(bone morphogenetic proteins, BMP)、纖維母細胞生長因子(fibroblast growth factor, FGF)、sonic hedgehoh (Shh)以及 Notch 等，會間接的活化不同的轉錄因子來調控神經幹細胞的自我更新與分化(Liu and Zhang, 2011)。許多的轉錄因子被研究報導指出參與了調控胚胎的神經發育和出生後的神經新生(Liu and Zhang, 2011)。例如，Sox2 促進了幹細胞的增殖和維持(Ferri et al., 2004)，而 Pax6 和 Tbr1 則會誘發神經性的分化(Englund et al., 2005; Hevner et al., 2001)。 4. 甲狀腺素受體作用蛋白質 6 (Trip6) 甲狀腺素受體作用蛋白質 6 是一種焦點連接(focal adhesion)分子，同時是 zyxin 相關(zyxin-related)的銜接蛋白(adaptor protein)，它含有一個脯胺酸富含區(proline-rich region)於胺基端以及三個 LIM 結合域(LIM domains)於碳基端(Murthy et al., 1999)。由於這些特別的區域，Trip6 蛋白質與其他幾個焦點連接蛋白同屬於 zyxin 家族蛋白，例如 zyxin、lipoma preferred partner (LPP)、Ajuba 以及 LIMD1(Lin and Lin, 2011)。大部分的 zyxin 家族成員皆位於焦點連接上，但也有許多會穿梭於細胞膜於細胞和之間來驅動不同的訊息傳遞路徑(Wang and Gilmore, 2001)。透過三個 LIM 結合域、PDZ 結合區(PDZ10.

(12) binding motif)、CrkSH2 結合區(CrkSH2-binding motif)和/或其他蛋白質的作用區(interaction domain)，Trip6 蛋白質可以提供一個蛋白質作用平台來參與肌動蛋白的組裝(actin assembly)、細胞移動(cell motility)、生存(survival)以及轉錄調控(transcriptional control) (Chastre et al., 2009; Hadjipanayis and Van Meir, 2009; Lai et al., 2005; Lai et al., 2010; Lai et al., 2007; Xu et al., 2004)。除此之外，Trip6 蛋白質還參與了端粒(telomere)的保護以及宿主與病原體之間的交互作用(host-pathogen interaction)、焦點連接的組合或拆解(assembly/disassembly) 、細胞的遷移或入侵(cell migration/invasion)以及抗細胞凋亡訊息傳遞(antiapoptotic signaling) (Lin et al., 2013; Williams et al., 1998; Worley et al., 2006)。再者，當 Trip6 蛋白質與溶血磷脂酸受體 2 (lysophosphatidic acid receptor 2, LPA2)和 Fas/CD95 受體(Fas/CD95 receptor)結合，將會促進由 LPA 和 Fas 配體(ligand)所誘發的細胞遷移(Lai et al., 2005; Lai et al., 2010; Xu et al., 2004)。另外，Trip6 蛋白質透過活化 NF-κB、胞外訊號調節激酶 (extracellular signal-regulated kinase, ERK)和磷脂酰肌醇激酶 (phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)等訊息傳遞路徑來促進細胞的存活(Lai et al., 2005; Lin et al., 2013)。存在於細胞核裡的 Trip6 蛋白質 11.

(13) 更會扮演 AP-1 和 NF-κB 的輔助調節因子(coregulator)。值得注意的是，最近的研究指出 Trip6 的 mRNA 高表現於不同的幹細胞中，包括神經幹細胞(Ramalho-Santos et al., 2002)。這樣的證據指出 Trip6 是個 stemness 的基因並且似乎扮演著調控神經幹細胞特性的角色。. 12.

(14) 三、材料與方法 1. 材料 (1) Antibody a.. Trip6 antibody (1:250, Bethyl). b. Sox2 antibody (1:1000, Millipore) c.. Ki67 antibody (1:250, Novocastra Laboratones Ltd). d. S100β antibody (1:1000, Millipore) e.. Doublecortin antibody (1:1000, Millipore). f.. GFAP antibody (1:250, Sigma). g. Iba1 antibody (1:1000, Millipore) h. Map2 antibody (1:1000, Millipore) (2) Chemical a.. Sucrose. b. 4% Paraformaldehyde c.. Avertin. d. 10X PBS e.. 10X TBS. f.. 0.9% NaCl solution. g. Formaldehyde (3) Goat serum blocking buffer (4) DAPI (1:10000) (5) Antifade (Invitrogen) (6) 6-, 12- and 24-well Plate (7) Well net (8) Slide and cover slide 13.

(15) 2. 方法 (1) NIH3T3 細胞培養與轉染 (Transfection) NIH3T3 細胞以含有 10% calf serum (Invitrogen)的 DMEM (Invitrogen)培養液培養於 37℃恆溫培養箱。培養於六孔盤中(6-wells plate)達 60% - 80%滿的 NIH3T3 細胞以 Lipofectamine® 2000 (Invitrogen)依照其說明書進行轉染。使用 2 μg 的 pLVTHM-scamble shRNA 或 pLVTHM-shTrip6 轉染細胞。十六個小時後，將培養液置換成含有 0.1% BSA 的培養液進行隔夜的血清飢餓(serum starvation)。之後會加入含 10%血清之培養液 15 分鐘誘導其焦點連接形成。接著以 3%的 formaldehyde (Bionovas)固定後進行免疫螢光染色。 (2) 反轉錄聚合酶鏈鎖反應 (RT-PCR) 帶胎母鼠以及其胚胎(E16.5)的大腦組織以 Trizol® (Invitrogen)並依照其使用說明抽取 mRNA。將 2 μg 的總量 RNA 以 GoScriptTM kit (Promega)進行 RT-PCR。之後再取 2 μg cDNA 以 GoTaq® Green Master Mix (Promega)進行 PCR。PCR 的引子(primer)序列為：Trip6 forward primer: 5’- GAAGCCCAGTGGAGGTGCTG-3’；Reverse primer: 5'-ACTCCAGAAGGTCCCTCCGG-3’。. 14.

(16) (3) 西方墨點 (Western blotting) a.. 帶胎母鼠以及其胚胎(E15.5)的大腦組織以 1X SDS lysis buffer (10% SDS, 60 mM Tris-HCl pH6.8)裂解後接著以超音波震碎組織 20 秒鐘。取 60 μg 的細胞萃取液(lysate)進行 SDS-PAGE 蛋白質電泳分析。最後以 Trip6 (1:2000, Bethyl Laboratories)和 GAPDH (1:5000, GeneTex)抗體進行西方墨點分析。. b. NIH3T3 細胞在以 4 μg 的質體進行轉染 24 小時後以 1X SDS lysis buffer 收細胞萃取液，接著以 40 μg 的細胞萃取蛋白質進行 SDS-PAGE 蛋白質電泳分析。最後以 Trip6 (1:2000, Clone 16, BD Bioscience)和 β-actin (1:2000, Sigma-Aldrich)的專一抗體進行西方墨點分析。 (4) 動物操作實驗中的操作皆通過『實驗動物照護及使用小組』審查。 a.. 成年小鼠: 將小鼠以腹腔注射麻醉後，剪開其腹部並將針頭插入心臟以生理食鹽水進行灌流，待其血液灌流乾淨後換以 4% 福馬林 (Paraformaldehyde, PFA)灌流進行固定。之後將其頭部剪下進行除去腦殼取腦之動作。 15.

(17) b. 胚胎小鼠: 懷孕至 E16.5 天的小鼠以腹腔注射麻醉後，剪開其腹部並將針頭插入心臟以生理食鹽水進行灌流，待其血液灌流乾淨後換以福馬林灌流進行固定。灌流結束後將其胚胎取出放入中固定一晚。之後將其頭部剪下進行除去腦殼取腦之動作。 (5) 切片 a.. 成年小鼠: 取出大腦放進福馬林溶液中固定一晚，再換入 30%的蔗糖溶液中脫水一晚，之後放入-80℃冰箱中冷凍一晚。最後以冷凍切片機以 40 μm 的厚度做冠狀切片並將切下的腦片放入含有 1X PBS (10X PBS: 1 ml per 80 mg NaCl, 2 mg KCl, 14.4 mg NaHPO4, 2.4 mg KH2PO4)溶液的 24 孔盤中以 4℃保存。. b. 胚胎小鼠: 將取出的大腦放進 10%的蔗糖溶液中脫水一小時，之後再分別放入 20%的蔗糖溶液三小時和 30%的蔗糖溶液一晚脫水，接著放入-80℃冰箱中冷凍一晚。最後利用冷凍切片機以 30 μm 的厚度做冠狀切片並將切下的腦片放入含有 1X PBS 溶液的 24 孔盤中以 4℃保存。. 16.

(18) (6) 免疫螢光染色 (Immunofluorescence stain) 將保存在 PBS 裡的腦切片以每片間隔 8μm 的原則挑出六片。以 well-net 裝載放入 12 孔盤中，胚胎鼠放入 24 孔盤中，以 1X TBS (10X TBS: 1 ml per 0.87.7 mg NaCl, 15.8 mg Tris-HCl)清洗三次，每次 5 分鐘。清洗後以 goat serum blocking buffer (1 ml per 0.1 ml 10X TBS, 10 mg glycine, 4 μl Triton X-100, 1 mg Azide)進行 blocking 1 hr 後，以每次標定兩種標誌的方式進行免疫螢光染色 14-16 hr。再以 TBS 清洗三次，每次 5 分鐘。洗畢，進行二級抗體的染色 2 hr。一樣再重複一次 TBS 清洗的步驟後進行 DAPI 的染色 30 min。最後以 antifade 進行封片。 (7) 共軛焦顯微鏡攝影染色完畢並且封片完成的大腦切片以 Leica SP2 共軛焦顯微鏡 (confocal microscope)拍攝記錄。依照腦室下區的部分，Trip6 染色的結果選定上下界，並以每層 2 μm 的厚度拍照。以 40X 物鏡記錄的圖片計算細胞數。 (8) 計算細胞由於 Trip6 為細胞質的蛋白質，所以為了確定該細胞為表現 Trip6 的細胞，我們配合 DAPI 的染色進行計算。在每層 2 μm 厚的切片影像中，以一個矩形方框標定出需計算細胞的區域(成鼠方 17.

(19) 框面積：380 x 160 μm2；胚胎鼠方框面積：380 x 80 μm2)，將每層表現 Trip6 的細胞加總後以表現 Trip6 又共表現其他標誌的細胞總數除之，得到表現 Trip6 共表現其他標誌的百分比。. 18.

(20) 四、結果 1. Trip6 蛋白質在胚胎及成年小鼠大腦中的表現為了探究 Trip6 蛋白質在神經系統中所扮演的角色，雖然我們使用之前就在我們及其他實驗室發表的文獻中所使用過的抗體，但還是測試了該 Trip6 抗體是否能以西方墨點和免疫螢光染色的方式偵測到內生性的 Trip6 蛋白質。利用小鼠纖維母細胞(NIH-3T3 cells)經由轉染的方式將控制組的 scrambled shRNA 或削弱組的 shTrip6 的質體轉入後，進行 Trip6 免疫螢光染色。結果我們的 Trip6 抗體能確實偵測得到控制組在焦點連接分子中的 Trip6 蛋白質，而在削弱組中沒偵測到(圖 1A)。相同的，在 3T3 細胞西方墨點的實驗中，我們的 Trip6 抗體一樣未偵測到 shTrip6 組別的訊號(圖 1B)。這樣的結果顯示出我們所使用的 Trip6 抗體對 Trip6 的偵測具有專一性。接下來，為了偵測 Trip6 在小鼠大腦中是否有表現，我們抽取胚胎小鼠(E16.5)和成年小鼠大腦的總量 RNA，以 RT-PCR 檢測 Trip6 蛋白質的 mRNA 表現量。我們發現 Trip6 的 mRNA 可在 E16.5 的小鼠大腦中被偵測到，但在成鼠的表現量則較少或者是未被偵測到(圖 1C)。而在 Trip6 蛋白質層次方面與 mRNA 有著類似的結果，僅在胚胎小鼠的大腦中偵測到 Trip6 蛋白質的表現(圖 1D)。這樣的結果指出，Trip6 在神經系統中主要的功能可能與神經的發育有關，因此神 19.

(21) 經系統若是發育完成，其表現量則會降低或被抑制。 2. Trip6 蛋白質表現在胚胎小鼠(E16.5)大腦的神經幹細胞中由於我們發現 Trip6 蛋白質在胚胎小鼠的大腦中大量表現且其被報導在神經幹細胞中的含量豐富(Ramalho-Santos et al., 2002)，所以我們對胚胎小鼠大腦切片進行免疫螢光染色，來探討哪些發育中的細胞會表現 Trip6 蛋白質。我們發現在大腦腦室區(ventricular zone) 的腹側及背側，Trip6 蛋白質的表現有個梯度且向外延伸的情形，那裡剛好分別為大腦皮層或紋狀體的基層(圖 2A)。由於神經幹細胞在胚胎時期幾乎位於腦室區，所以我們將該區的大腦切片以免疫螢光染色的方式雙重標定了 Trip6 蛋白質和幹細胞的標誌 Sox2 (圖 2B、2C)，實驗的結果顯示出，在腹側及背側的腦室區中，大部分表現 Trip6 蛋白質的細胞也都會表現 Sox2，約有 90.2 ± 2.7% (圖 2E)。在胚胎發育的時期，神經幹細胞分裂的情況相當旺盛，所以我們也探究了是否表現了 Trip6 蛋白質的細胞是否也在進行分裂，所以也將該區的大腦切片以免疫螢光染色的方式雙重標定了 Trip6 蛋白質和增殖中細胞的標誌 Ki67 (圖 2D)，發現大約有 34.1 ± 2.1%表現 Trip6 的細胞也表現 Ki67 (圖 2E)。這樣的結果指出在小鼠胚胎時期，Trip6 蛋白質主要被神經幹細胞所表達。 20.

(22) 3. Trip6 蛋白質表現在成年小鼠腦室下區的神經幹細胞中中樞神經系統主要在胚胎時期發展，但在成年的大腦中仍然有兩個區域保有神經新生，一個位在腦室下區至嗅球的路徑，另一個則是位於齒狀迴(dentate gyrus, DG)。由於我們發現胚胎時期的神經幹細胞高度表現 Trip6 蛋白質，所以其很有可能在成年小鼠的神經幹細胞中被表達。雖然我們在成年小鼠大腦以反轉錄聚合酶鏈鎖反應及西方墨點的方式未偵測到或偵測到較低量的 Trip6 的訊號(圖 1C、1D)，可能是與胚胎時期相比，成年小鼠大腦中的神經幹細胞相對較少，所以很難在整個大腦的萃取物中偵測到 Trip6 蛋白質。因此，免疫螢光染色為一個較好的方式讓我們辨認在成年大腦中 Trip6 蛋白質是否有表現。我們確實發現在成年小鼠的大腦中，Trip6 在腦室下區中有表現 (圖 3A、3C-3H)，而顆粒下層區則否(圖 3B)。與胚胎小鼠的結果一致，在成年小鼠的腦室下區中，大約有 62.7 ±1.6%的細胞共同表現了 Trip6 和 Sox2 (圖 3C、3D、3D’和 3I)。但約只有 8.0 ± 0.3%表現 Trip6 蛋白質的細胞正在進行分裂(圖 3E、3F 和 3I)。由於這時的神經幹細胞是處於靜默(quiescent)的狀態，所以雙表現 Trip6 蛋白質和 Ki67 的細胞較少，故此這樣的結果是合理的。由於有文獻指出，在側腦室邊緣的室管膜細胞也會扮演成年神 21.

(23) 經幹細胞(Spassky et al., 2005)的角色，所以我們也對成年小鼠大腦切片以 Trip6 蛋白質和室管膜細胞的標記 S100β 進行免疫染色(圖 3G 和 3H)。結果顯示約有 44.4 ± 1.5%表現 Trip6 蛋白質的細胞為室管膜細胞(圖 3I)。這樣的結果顯示，在成年的小鼠的腦室下區，Trip6 蛋白質主要還是被神經幹細胞所表達。 4. 在成年小鼠大腦中的神經元、星狀細胞和小膠質細胞並不表現 Trip6 蛋白質為了研究神經幹細胞所產生的子代細胞是否也會表現 Trip6 蛋白質，所以我們也以免疫螢光染色的方法雙重標定了 Trip6 蛋白質和下述的各種標誌：神經母細胞的標誌 Doublecortin (DCX)、神經元的標誌 Microtubule-associated protein 2 (MAP2)、星狀細胞的標誌 Glial fibrillary acidic protein (GFAP)以及小膠質細胞的標誌 Ionized calcium-binding adapter molecule (Iba1)。我們發現表現 Trip6 蛋白質的細胞只有 6.7 ± 1.8%是神經母細胞(圖 4A)。另外神經元(MAP2 表現細胞)不表現 Trip6 蛋白質(圖 4B)。在胼胝體中表現 GFAP 的細胞 (即星狀細胞)也都不表現 Trip6 蛋白質(圖 4C)。為了進一步的確定非屬於神經系統的小膠質細胞是否表達 Trip6 蛋白質，我們也以相同的實驗方法進行確認，我們發現小膠質細胞也不表現 Trip6 蛋白質(圖 4D)。 22.

(24) 總結上述，在成年小鼠的腦室下區中，Trip6 蛋白質會在神經幹細胞、室管膜細胞和些許的神經母細胞這些比較前驅性的細胞中表達，而神經元、星狀細胞和小膠質細胞這些較為分化的細胞並不表達 Trip6 蛋白質。這樣的結果指出，Trip6 蛋白質在調控神經幹細胞的特性上可能扮演著重要的角色。. 23.

(25) 五、討論由前人的研究中我們可以得知，在成年哺乳類動物的大腦中，尚還有兩個地方會有神經新生的發生。一是腦室下區，另一個是顆粒下層區，而會有神經新生的發生最主要的原因是有神經幹細胞的存在。調控神經新生的機制大致上可以區分成兩個類別，內在的 (intrinsic)調控機制與外在的(extrinsic)調控機制。內在的調控機制例如對細胞週期(cell cycle)、細胞存活以及分化的調控或 bone morphogenic proteins (BMPs)、Shh 和 Wnt pathway 等訊息傳遞路徑。外在的調控機制為棲位對幹細胞的調控。 Trip6 是一個焦點連接分子，它調控著許多細胞與細胞之間的交互作用，像是細胞的遷移或者細胞與細胞之間的連接，甚至是基因的活化。早期 Trip6 蛋白質的研究皆著重於調控細胞的遷移，包含調控癌症細胞的轉移(metastasis)以及病原體的入侵(pathogen invasiveness)。而它與癌症的發展或癌細胞的生存有關的功能也經常被報導(Lai et al., 2010; Lin et al., 2013)。近年來在微陣列(microarray)技術的分析下，Trip6 蛋白質被指出表現於許多不同的幹細胞之中。這樣的證據透露出 Trip6 是一個具有幹細胞性的基因(Ramalho-Santos et al., 2002)。故其在調控幹細胞 24.

(26) 特性的機制上或許也扮演著相當重要的角色。而我們的結果顯示它會表現在胚胎小鼠與成年小鼠腦中的神經幹細胞，以及可能扮演成年時期的神經幹細胞角色的室管膜細胞中，但在其它已分化成熟後的細胞中則不表現。 Sox1, 2 and 3 皆屬於 SoxB1 這類的轉錄因子，神經幹細胞皆會表現之(Wang et al., 2006; Zappone et al., 2000)。SoxB1 與 Notch pathway 會使得神經幹細胞處於不分化的狀態(Ross et al., 2003)。有研究指出 Notch 會活化 Sox2 的表現並且抑制神經性的分化(Ehm et al., 2010)。也有文獻指出，在 RA 誘導分化的膠質母細胞瘤幹細胞中的 Notch pathway 是被負向調控的(Ying et al., 2011)。這樣的證據指出 Notch pathway 對於調控幹細胞維持在不分化的狀態下是必要的。在與我們合作實驗室的研究中發現，Trip6 會維持出生後小鼠神經幹細胞自我更新的特性並且抑制其分化。更重要的是 Trip6 會增加 Notch pathway 的活性。有研究指出，Notch 在胚胎和成年的神經幹細胞中，會抑制其分化成星狀細胞(Grandbarbe, 2003; Tanigaki et al., 2001)。Notch 也被報導指出，會維持神經幹細胞的黏著連接 (adherens junction)。失去黏著連接會引發過早的神經新生與分化 (Rousso et al., 2012)。共同合作的研究室還發現，將 Trip6 削弱後會 25.

(27) 造成分化朝向神經膠細胞分化的命運。以上的證據支持了 Trip6 為 Notch-Sox2 訊息傳遞路徑的上游，並且維持著神經幹細胞的特性和抑制它們的分化。在神經新生的時期，神經幹細胞的附著期會調控自我更新與分化之間的平衡。神經幹細胞會藉由附著於腦室的管腔表面(luminal surface)以及鄰近的前驅細胞形成一個自給的棲位(Meng and Takeichi, 2009; Zhang et al., 2010)。神經幹細胞若失去附著的狀態則與分化有關，而保持附著則會促進自我更新(Malaguti et al., 2013; Rousso et al., 2012)。這些文獻的報導主要著重於黏著連接與鈣黏蛋白(cadherin protein)。然而，關於焦點連接分子的研究多著重於細胞的遷徙，而較少與神經新生有關。值得注意的是，有文獻指出，焦點連接的動態與神經幹細胞的分化有關。焦點連接分子與鈕帶蛋白(vinculin)的缺乏會破壞神經管的形成(Xu et al., 2004)。由於我們與合作的實驗室證明了 Trip6 蛋白質在神經幹細胞中表現並調控其自我更新與分化，所以綜合起來，我們提供證據支持焦點連接分子在神經新生中扮演了重要的角色。在我們先前的研究發現 Trip6 蛋白質不只會調控細胞的移動也會調控癌細胞的生存與增殖(Lai et al., 2005; Lai et al., 2010; Lin et al., 2013)。在卵巢癌以及膠質母細胞瘤中，它活化了 ERK、Akt 以及 26.

(28) NF-κB 訊息傳遞路徑以促進細胞的移動、增殖以及生存(Lai et al., 2005; Lai et al., 2010; Lin et al., 2013)。而神經新生時，ERK、Akt 以及 NF-κB 訊息傳遞路徑對於神經幹細胞增殖與生存的調控一樣重要。因此，Trip6 蛋白質也可能會經由這些訊息傳遞路徑來調控神經幹細胞的特性。在成年小鼠的腦室下區中，Trip6 蛋白質一樣會在室管膜細胞中表現(圖 3)。室管膜細胞是在神經發育時保留在腦室區的神經膠細胞 (Spassky et al., 2005)。文獻指出，在嗅球中室管膜細胞會幫助神經幹細胞使其產生新的神經元(Johansson et al., 1999)。室管膜細胞也可以針對脊髓損傷並產生星狀細胞遷徙到損傷部位(Johansson et al., 1999)。在我們的研究中顯示 Trip6 蛋白質表現於神經幹細胞以及室管膜細胞中，這樣的結果指出 Trip6 主要表現於具有幹細胞特性的細胞中以及它可能會幫助這些細胞維持幹細胞的特性。室管膜瘤是室管膜細胞癌化而成的神經膠質瘤。根據 Neale Multi-cancer data set 的微陣列數據，Trip6 的 mRNA 也高度表現於室管膜瘤和間變性室管膜瘤中。除此之外，在 Trip6 蛋白質於膠質母細胞瘤中所扮演的角色的研究中，其也具有高度的表現量(Lai et al., 2010)。再者，Trip6 也增強了膠質母細胞瘤抗凋亡的能力以及促進腫瘤的增生(Lai et al., 2010; Lin et al., 2013)。與臨床的數據一致的 27.

(29) 是，Trip6 蛋白質具有較高表現量的膠質母細胞瘤患者，其確診後的生存期也較短(Lin et al., 2013)。這些研究指出，Trip6 蛋白質在各種膠質瘤中扮演著重要的因素。由於我們的研究結果顯示，成熟的星狀細胞不表現 Trip6 蛋白質(圖 4)，但神經幹細胞卻表現之(圖 2、 3)。而異位的表現 Trip6 蛋白質在已分化的神經膠細胞中可能是導致它們轉變為癌細胞並且使其形成腫瘤的原因。因此，Trip6 蛋白質不僅可以作為生物標誌(biomarker)，或許在惡性腦癌的標靶治療上，也可成為一個有效的治療標靶。. 28.

(30) 貳、建立人類惡性腫瘤之斑馬魚異體移植模式一、中文摘要神經膠質母細胞瘤是成人最常見且高侵略性的原發惡性腦腫瘤。它的侵襲力和耐傳統療法使其成為極易復發的惡性腫瘤。 Rac 蛋白質屬於 Rho GTP 酶亞家族，其主要功能包括調節細胞運動，增殖和存活。為了探究 Rac 蛋白質是否可以作為膠質母細胞瘤的新治療標靶，特別是對於神經膠質母細胞瘤幹細胞，我們利用其類癌幹細胞株建立了斑馬魚的異體移植模式來研究抑制 Rac 蛋白質對於神經膠質母細胞瘤的致癌性影響。我們將表達控制組的 shRNA 或者是針對 Rac 蛋白質做抑制的 shRNA 序列和綠螢光蛋白的神經膠質母細胞瘤細胞株 U251-MG 和 U373-MG 培養於低分化培養液中，以形成腫瘤細胞球 (tumorspheroids)。這些體外培養的球體細胞有著幹細胞的特性。我們將這些細胞以顯微注射的方式注射進入受精後兩天大的血管紅螢光轉基因斑馬魚 Tg(kdr: mCherry)的卵黃囊。觀察發現注入的癌細胞誘導了血管新生作用的發生，而表達 shRacs 細胞萎縮且並未引發血管新生作用。另外，注射 shRacs 細胞的魚隻生存率也較高。從我們的研究結果，Rac 蛋白質會誘導膠質瘤幹細胞引發血 29.

(31) 管新生作用，並且可做為一個生物標誌。因此，Rac 蛋白質可能可以進一步應用在神經膠質母細胞瘤的標靶治療上。另一方面，我們也利用注射肝癌細胞株 Hep3B 進入受精後兩天大的斑馬魚卵黃囊中，來觀察 Hep3B 細胞的遷移現象，此模式約有 20%的魚隻可觀察到細胞遷移。. 關鍵字：神經膠質母細胞瘤、肝細胞癌、斑馬魚、Rac 蛋白質與血管新生. 30.

(32) I. Abstract Glioblastoma is the most common and aggressive malignant primary brain tumor in adults. Its invasiveness and resistance to traditional therapies make it a highly recurrent malignant disease with poor prognosis. Rac proteins belong to the Rho small GTPase subfamily, which major functions include regulation of cell movement, proliferation, and survival. To investigate whether Rac proteins can serve as new therapeutic targets for glioblastoma, especially for glioblastoma stem cells, we established a zebrafish xenotransplantation model to study the effects of Rac proteins in glioblastoma. Glioblastoma cell lines U373 and U251 expressing short hairpin RNA targeting Rac proteins or control RNA sequence and green fluorescence protein were generated and cultured in low differentiating medium to form tumorspheroids. These spheroid cells harbor stem cell properties and mimic stem cells in vitro. We injected these cells to egg yolk of zebrafish Tg(kdr: mCherry) on 2 post-fertilization-day stage(pfd). The behaviors of the injected cells were then monitored every day by the confocal microscope. We observed that the cells expressing control scramble RNA sequence induced angiogenesis in the egg yolk of the fish, while the cells expressing shRacs shrank inside the fish and did not induce angiogenesis. The overall survival rates of fishes were also higher in the fishes injected shRac cells instead of fishes with control scramble RNA cells. From our results, we conclude that Rac proteins induce angiogenesis of glioblastoma stem cells and serve as a poor prognosis marker. 31.

(33) Therefore, Rac proteins could further be the potential therapeutic targets of glioblastoma and its stem cells. On the other hand, we also inject the hepatocellular carcinoma cell line- Hep3B into egg yolk of zebrafish on 2 pfd stage to observe the migration of Hep3B cells. We have successfully established the in vivo migration/metastasis model of Hep3B cells in zebrafish of which the metastasis rate is about 20%.. Keywords: Glioblastoma, Hepatocellular carcinoma, Zebrafish, Rac and Angiogenesis. 32.

(34) 二、緒論 1. 斑馬魚 (Zebrafish) 斑馬魚為鯉科(Cyprinidae)的小型亞熱帶淡水魚類，成魚體長約 3-4 公分，適合生長的水溫為 23-28℃。其每次產卵約可產下 100-200 顆。其為重要的脊椎模式物種生物，近年來常被利用來研究遺傳、發育、藥物篩選、毒物測試及人類的疾病。斑馬魚的優點在於其為脊椎動物，有著與人類相似的各種器官，例如心血管系統。且斑馬魚早期的胚胎是透明的，有利於觀察其發育過程的型態變化。還有，斑馬魚只需簡單的設備即能飼養，花費較低。再者，斑馬魚的性成熟時間短，約三到四個月即能繁衍後代，且子代數量頗多。最後，其容易進行誘發性的突變，有利於基因功能方面的研究。. 2. 腦癌 (Brain cancer) 腦癌的定義為局部腦組織細胞發生不正常的分裂增殖而生成瘤塊。神經膠質瘤(glioma) 為最常發生在成人腦部的惡性原位腦癌，其中包含了星細胞瘤(astrocytoma)、寡突細胞瘤(oligodendroglioma) 和室管膜細胞瘤(ependymoma)等(Maher et al., 2001)。在成人的原位腦癌中，大多數為神經膠質母細胞瘤。儘管治療 33.

(35) 的方法很多，但手術後復原情況差，治療後的中位存活時間(median survival time)約為一年(de Almeida Sassi et al., 2012; Shahar et al., 2012)，且容易復發。在遺傳學、細胞生物學以及動物模式過去二十年的研究中，試圖了解神經膠質母細胞瘤發生的原因以及發展，但還是尚未有個明確的結果(Batista et al., 2014)。過去有許多的證據指出，神經膠質母細胞瘤的起源來自於正常的膠細胞(glial cells)，但最近有越來越多的證據將矛頭指向神經幹細胞或神經前驅細胞(Galli et al., 2004; Singh et al., 2004)。近期有一項新的研究理論指出，神經膠質母細胞瘤之所以容易復發的原因是有癌症幹細胞的存在。癌症幹細胞假說(The cancer stem cell hypothesis)認為，腫瘤群落中存在著一群數量極少且具有幹細胞特性的細胞(Singh et al., 2004)。而神經膠質母細胞瘤可能含有多潛能性的癌症幹細胞且其具有增生(populating)和再增生 (repopulating)的能力。 3. 肝癌 (Liver cancer) 肝癌在肝臟為最常見的原發性癌症，在常見的癌症當中排名第六，且因肝癌而死亡的人口數在全球排名第三(Galuppo et al., 2013)。而肝細胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見的肝癌類 34.

(36) 型，在病例當中約佔 70%到 85% (Hai et al., 2014)。肝癌根據來源的部位可以分成兩大類，一是源自於肝臟的原發性肝癌，另一是轉移性肝癌，癌最初在身體其他部位產生，後來才散到肝臟。肝癌的發生原因至今尚未非常明瞭，但與肝炎病毒的感染(B 型肝炎，Hepatitis B virus, HBV 或 C 型肝炎，Hepatitis C virus, HCV 等)和酗酒所造成的酒精毒性有很大關係。由於肝炎病毒會導致肝臟反覆性的發炎，造成肝臟的損害，最後導致肝硬化而增加罹患肝癌的機率。根據研究，在亞洲與北美洲，B 型肝炎表面抗原(Hepatitis B surface antigen, HBsAg)帶原者與非感染者相比，罹患肝癌的風險增加了二十五至三十七倍(Hai et al., 2014)。另外，根據研究指出，百分之八十以上的原發性肝癌與 C 型肝炎有關(Lee, 2013)。肝癌初期的症狀並不明顯，甚至腫瘤也不會引起疼痛或者其它症狀。大多數的患者皆是到了中晚期出現肝痛、乏力、消瘦、黃疸或腹水等症狀才被診斷出罹患癌肝。晚期確診的病患各種治療方式效果皆不顯著，平均只能存活三至六個月。目前治療肝癌的方法有傳統的手術切除、肝臟移植或化學治療。較新穎的治療方式則有經皮酒精注射治療(Percutaneous Ethanol Injection, PEI)、射頻燒灼術(Radiofrequency Ablation, RFA)或標靶治 35.

(37) 療等(Singla et al., 2014)。 4. 癌症幹細胞 (cancer stem cells) 在癌症生物學上，對於腫瘤的形成還沒有一套公認的理論 (Ojha et al., 2014)。最被廣為接受的說法是由於遺傳物質(DNA)的損傷而造成的基因的突變(mutation)，例如致癌基因(oncogenes)或抑癌基因 (tumor suppressor genes)，而造成細胞的增殖與生長(growth)不受控制而使細胞癌化(Kasai et al., 2014)。由於研究技術的日新月異，科學家們在癌症細胞株中或者是異質性(heterogeneous)高的臨床的癌症檢體中皆分離出一小群細胞，稱之為邊緣細胞群(side population)，它們有著類似幹細胞的特性，會自我更新也會分化，科學家便將這群細胞命名為類癌幹細胞(cancer stem-like cells) (Kong et al., 2014)。由於它們具有抗藥性(chemoresistance)、抗放射性(radio-resistance)和高致腫瘤性(tumorigenicity) 以及它們與癌症的進展(progression)、轉移(metastasis)、復發 (recurrence)以及多重抗藥性(multidrug resistance)有關，所以有另一派的科學家稱之為腫瘤起始細胞(tumor-initiating cell)或是癌症幹細胞(Kong et al., 2014; Wong and Kumar, 2014)。癌症幹細胞的來源科學界尚未有定論，各式各樣的理論眾說紛紜。由於不同的組織或細胞有著不同的來源，所以許多的理論皆有 36.

(38) 可能是正確的。目前最被科學家相信的假說如下： (1)由成體幹細胞突變而來：有些細胞的汰換速率(turnover rate)較快，例如皮膚與腸道細胞，因此這類型的成體幹細胞可能累積了較多的突變使得幹細胞癌化。 (2)幹細胞的棲位發生突變：調控幹細胞特性的棲位發生突變也可能是使得正常的幹細胞轉變成癌症幹細胞的原因之一(Kasai et al., 2014)。 (3)已突變的細胞發生去分化 (dedifferentiation)：已突變的細胞發生去分化的現象使其退回類幹細胞的階段(Stiles and Rowitch, 2008)。 5. Rac 蛋白質 (ras-related C3 botulinum toxin substrate) Rac 蛋白質是屬於 Rho GTP 水解酶(GTP ase)的亞家族 (subfamily) (Aspenstrom et al., 2004)。其主要的功能是調控肌動蛋白細胞骨架的重新排列(actin cytoskeleton rearrangement) (Ridley et al., 1992)。這個蛋白質超家族調節不同的細胞功能，包括細胞生長、細胞骨架重組、以及幹細胞在發育過程中的恆定(Aspenstrom et al., 2004)。除了在正常的細胞功能上扮演著重要的調節作用，越來越多的研究已經在腫瘤發展上報導了它們的作用(Mack et al., 2011)。 Rac 蛋白含有四種亞型：Rac1, Rac2, Rac3 and RhoG (Aspenstrom et al., 2004)。其中，Rac1 是其中的主要成員並且已經被研究得最 37.

(39) 清楚透徹(Higashi et al., 2009)，過去的研究中發現，其會調控癌細胞的遷移(Yang et al., 2012)。另外還有研究指出 Rac1 會調控神經脊幹細胞(neural crest stem cell)的遷移(Mayor and Theveneau, 2014)。Rac2 主要表達在造血細胞中。其除了調控細胞遷移之外，還參與了嗜中性球(neutrophil)胞吐作用(exocytosis)的調控 (Abdel-Latif et al., 2004)、調節環氧合酶-2 (Cyclooxygenase-2)的表達(Azim et al., 2007)以及維持巨噬細胞的形態(Wheeler et al., 2006)。Rac3 主要表現在大腦組織中，其它組的表現量則較低 (Haataja et al., 1997)。最近的研究指出，它會負向調控細胞自噬 (autophagy)以及當作 ER α 核受體(nuclear receptor ER α)的共活化物(co-activator) (Walker et al., 2011)。而 RhoG 仍然是被研究較少的亞型，其在腫瘤細胞中的作用仍尚不明確(Kwiatkowska et al., 2012)。但 RhoG 被鑑定為生長因子反應基因(growth factor response gene) (Vincent et al., 1992)，並且過去的研究中指出其與細胞遷移和細胞存活有關(Katoh et al., 2006; Murga et al., 2002)。. 38.

(40) 三、材料與方法 1. 材料 (1) Zebrafish: Tg(kdr: mCherry) (2) Cell line a.. U251-MG: U251-SC (shScramble transfected); U251-siRac2 (shRac2 stably transfected). b. U373-MG: U373-SC (shScramble transfected); U373-siRac1, 2, 3 (shRac1 or 2 or 3 stably transfected) c.. Hep3B. (3) Chemical a.. Tricane (Sigma). b. Matrigel (BD) c.. Mineral oil (Sigma). d. DMEM/F-12 medium (Gibco) e.. B-27 (Gibco). f.. bFGF, EGF (Sigma). g. N,N-Dimethyl formamide (Sigma) (4) Micropipette (Drummond Scientific) (5) Flaming/Brown Micropipette Puller (Sutter, P-97) (6) Microinjector (Drummond Scientific, Nanoject II) (7) Agarose mold (Adaptive Science Tools, TU-1) (8) 96-well plate. 39.

(41) 2. 方法 (1) 培養液製備將粉狀 DMEM/F-12 以二次水加至 1000 ml 攪拌均勻。以 0.2 μm 孔徑的濾杯過濾之。每 500 ml 加入 10 ml 的 B-27、5μg 的 bFGF、5μg 的 EGF 和 5 ml 的 Pen-Strep 抗生素即製備完成。 (2) 細胞培養將細胞株以懸浮培養的方式培養在非細胞培養(non-cell culture)的培養皿(petri dish)中，使用上述培養液將其培養成球狀 (sphere)。這些球狀細胞有著接近癌症幹細胞(cancer stem cell)的特性，故稱之為類癌幹細胞(cancer stem-like cells)。 (3) 細胞製備培養成球狀的細胞以一千轉 (1000 rpm)離心 5 分鐘將細胞收下。抽乾 medium 後加入 200 μl 的胰蛋白酶(trypsin)處理 5 分鐘後，加入 1 ml 的 DMEM medium 以重複 pipetting 的方式打散後計算其細胞數。取 2.5 X 105 的細胞數加入 10 ml 的 DMEM/F-12 medium 繼代培養。其餘細胞離心一次，取約 1 X 105 的細胞打散至 4 μl 的 DMEM/F-12 medium 中並加入體積之 20%的 matrigel 模仿細胞在生物體內有胞外基質(extra cellulose matrix, ECM)的環境，以備注射。 40.

(42) (4) 毛細管針的製備將毛細管架上拉針器，以下列條件進行拉針：「pressure: 500；heat: 560；pull: 100；velocity: 50；delay time: 200」。需進行顯微注射時，再將拉好的針在顯微鏡下以刀片斷針，口徑大小可依實驗需求做調整。 (5) 顯微注射 (microinjection) 先將欲注射的魚隻麻醉後排列在 mold 上，再以 microinjector 架上針吸取細胞，注射點為魚隻的卵黃囊。每次注射的體積約為 9 nl，內含細胞數約為 100-200 cells。 (6) 魚隻的飼養與觀察注射完畢後，會先以螢光顯微鏡做篩檢，將沒成功注射細胞進入的魚隻剃除。之後將注射成功之魚隻，以一隻一孔的方式飼養在 96 孔盤中。由於我們所使用的轉基因斑馬魚是以 kdr 的啟動子(promoter)來驅動 mCherry。因 Kinase insert domain receptor (KDR)是一種第三型的受體酪氨酸激酶(type III receptor tyrosine kinase)，也就是我們所熟知的血管內皮生長因子受體二(vascular endothelial growth factor receptor 2, VEGFR-2)，其被廣泛表達於血管內皮細胞中，所以該斑馬魚的血管皆會發出紅色螢光以利觀察。注射當天(day 0)以及注射後第一及第二天(day 1, 2)會以共軛 41.

(43) 焦顯微鏡觀察是否有血管新生(angiogenesis)或是遷移(migration) 的情況發生並記錄之。注射過待觀察的魚隻皆飼養於 35℃之恆溫箱裡(先將恆溫箱溫度從 28℃調至 31℃使魚隻適應 1 hr 後再將溫度緩慢提升至 35℃)。所有的統計皆以 T-test 分析，誤差值為 standard error。. 42.

(44) 四、結果 1. 注射 U251-SC 與 U251-siRac2 細胞株首先，我們利用帶有控制組(U251-SC)之序列以及 GFP 報告者基因(reporter gene)的神經膠母細胞瘤細胞株進行顯微注射。因此，若是細胞有成功注射進入卵黃囊，將可於魚體內觀察到帶有綠色螢光的細胞。使用的轉基因斑馬魚 Tg(kdr: mCherry)是以 kdr 的啟動子(promoter)來驅動 mCherry。因 KDR 是一種第三型的受體酪氨酸激酶，也就是我們所熟知的血管內皮生長因子受體二，其被廣泛表達於血管內皮細胞中，所以該斑馬魚的血管皆會發出紅色螢光以利觀察。注射細胞後的魚隻會以共軛焦顯微鏡進行觀察與紀錄，結果顯示控制組(U251-SC)的細胞株在魚體裡並無發生細胞遷移的現象(圖 5A)。但是有少數的魚隻在注射後一天有觀察到血管新生的現象發生(圖 5B)。由於 Rac 蛋白質可調控細胞骨架的重組以及細胞生長，在不少文獻中皆提及其與腫瘤的發生與進程有關(Chan et al., 2005; Ridley et al., 1992; Verhaak et al., 2010)，因此我們想利用斑馬魚的模式來研究 Rac 蛋白質對於神經膠母細胞瘤的影響。我們使用會表現 shRac2 序列，可削弱 Rac2 表現量的實驗組細胞(U25143.

(45) siRac2)來進行顯微注射。與控制組(U251-SC)相比，我們觀察到實驗組 (U251-siRac2) 的存活率有較高的趨勢。故此我們進行統計，發現將 Rac2 表現量削弱後，魚隻的存活率有顯著的上升(圖 5C)。. 2. 注射 U373-SC 與 U373- siRac1 & 2 & 3 細胞株由於注射 U251-SC 之細胞株的實驗中，其在魚體內引發血管新生的效果不明顯，於是我們以同樣是神經膠母細胞瘤之細胞株的 U373-MG 進行相同的實驗，來觀察是否能增加魚隻發生血管新生作用的比率。在注射控制組細胞株(U373-SC)後進行觀察，發現與注射培養液(含 20% matrigel)的組別相比(圖 6A)，其確實能在魚體內引發血管新生作用(圖 6B)，而且效果比 U251-MG 之細胞株更為明顯。所以接下來我們便注射了將 Rac1, 2, 3 表現量削弱過後的實驗組細胞株(U373- siRac1, 2, 3)進行觀察(圖 6A)。由共軛焦顯微鏡觀察後的結果顯示，將 Rac1, 2, 3 表現量削弱後確實能降低血管新生作用的發生(圖 6C、6D 和 6E)。與控制組(U373-SC)一起進行統計分析，在注射後第一天，控制組即觀察到 29 ± 12% ~ 67 ± 6.3% 的細胞注射成功的魚隻有引發血管新生的現象，而在將 Rac1, 2 44.

(46) and 3 表現量削弱的組別裡，僅分別有 18 ± 7.4%、3.5 ± 3.5%與 15 ± 5.7%。第二天，血管新生作用發生的比率在控制組上升至 56 ± 11.1% ~ 88 ± 7.5%，實驗組則分別上升至 29.9 ± 10.1%、16.2 ± 6.1%與 32.2 ± 6%，因此 Rac 削弱組與控制組相比之下亦有明顯的下降(圖 7A)。在魚隻存活率的方面，注射後第一天控制組的存活率為 90 ± 3.5% ~ 92.5 ± 2.9%，而實驗組 Rac1-Rac2 削弱組分別為 100 ± 0%、97 ± 2.5%與 100 ± 0%。而在注射後第二天控制組的存活率降至 65 ± 4.2% ~ 69 ± 3.9%，而實驗組分別為 87 ± 4.1%、89 ± 3.9%與 86 ± 1.3%，所以實驗組的存活率比起控制組亦有明顯上升 (圖 7B)。這樣的實驗結果指出，若是將 Rac1, 2 and 3 的表現量削弱，的確可以降低 U373 癌細胞引發血管新生的現象並且提高異種腫瘤移植魚隻的生存率。 3. 斑馬魚注射 Hep3B 細胞株另外，我們利用注射肝癌細胞株(Hep3B)來建立肝癌的斑馬魚異體移植模式。在注射後第一天即可觀察到遷移的現象發生(圖 8B)。同樣的我們也注射了細胞培養液當作控制組(圖 8A)。而根據我們觀察的結果顯示約有 20 ± 6.5%細胞注射成功的魚隻會發生遷移的現象(圖 8C)。 45.

(47) 在 Hep3B 的實驗當中，我們主要觀察到的現象是細胞遷移。這也確認了 Hep3B 細胞株以斑馬魚當異體移植的模式生物是可行的。總結上述的實驗結果，可以說明我們利用斑馬魚建立的癌症模式確實可以觀察到人類的癌症細胞株可以在斑馬魚體內引發癌症病變的相關現象。所以，我們確實建立了一個斑馬魚的異體移植癌症模式。. 46.

(48) 五、討論在台灣，癌症造成人口死亡的原因一直是排行榜的前幾名，有鑑於此，我們想藉由斑馬魚建立一個癌症的研究平台，來研究有關癌症會發生的相關現象，例如血管新生、遷移等。由於斑馬魚的各項優點，如生長快速、子代多、胚胎透明且基因與人類相似度高等，提供了一個很好的脊椎動物模式，故有利於我們的研究。 Rac 蛋白質的三種亞型均被研究證實參與了腫瘤的發展。例如，Rac1 會透過 JNK 訊息傳遞路徑提高神經膠母細胞瘤細胞的存活率(Ridley et al., 1992)。根據 The Cancer Genome Atlas (TCGA)資料庫，Rac2 在間葉型的神經膠母細胞瘤中過度表現 (Colman et al., 2010; Verhaak et al., 2010)。Rac3 則在腦癌中有突變並且過度表達的現象，其也與膠質瘤呈現浸潤性生長的過程有關 (Chan et al., 2005)。LPA 會透過 Rho 蛋白的受體與 G12/13 傳遞路徑的偶聯活化它來誘導細胞的移動(Lin et al., 2010)。但或許也有其他的訊息傳遞路徑參與其中。LPA 誘導 Rac1 的活化已經被指出會促進神經膠質瘤的入侵(invasion) (Hoelzinger et al., 2008)，這顯示該途徑在神經膠質瘤發展的重要性。越來越多的研究指出 Rac 所屬的 small G proteins 在心血管的 47.

(49) 生理上扮演了重要的角色，例如它會調控心律(heart rhythm)、心臟的收縮(contraction)、心室肥大(hypertrophy)、血管新生、血管通透性(vascular permeability)以及血管收縮(vasoconstriction)等現象(Loirand et al., 2013; Roberts, 2011)。VEGF 是一種由內皮細胞 (endothelial cells)所分泌的訊息蛋白質，與血管新生有關(Liebano and Machado, 2014)，其在胚胎發育的時期以及受傷後會促進新血管的生成。而 VEGF 蛋白家族中包含了 placenta growth factor (PIGF)、VEGF-B、VEGF-C 以及 VEGF-D 等成員(Eriksson et al., 2003)。 VEGF 的各個亞型結構相似，但功能尚未區分清楚。其中， PIGF 以及 VEGF-B 不會誘發血管新生作用以及增加血管的通透度，但 VEGF-C 和 VEGF-D 則會促使血管新生作用與淋巴管新生作用(lymphangiogenesis)的發生(Eriksson et al., 2003)。過去的研究中已證實 Rac 蛋白質可以藉由 VEGF 調控內皮細胞的孔狀化 (endothelial fenestration)進而改變微血管的通透性(permeability) (Eriksson et al., 2003)。而在其它的研究中發現 VEGF 會造成細胞與細胞之間的連接瓦解並且使張力絲(stress fiber)的表現量上升，而 Rac 蛋白質會調控 VEGF 進而抑制上述的現象發生(Soga et al., 2001)。再者，Rac 蛋白質的活化會促使 VEGF 的表現量上升進而 48.

(50) 引發癌細胞的轉移(metastasis) (Lee et al., 2006)，還有 Rac 的活化也會促使癌細胞發生遷移(Yang et al., 2012)。 Rac 蛋白質的三種亞型中，有些有組織的特異性以及表達在不同的癌症細胞中。因此，Rac 蛋白質似乎是個有潛力的癌症標靶治療的標靶點。雖然 Rac1 是被研究得最多的一個亞型(Fortin Ensign et al., 2013)，但它被均勻地表達於不同的組織中(Haataja et al., 1997)，並在正常的細胞功能中扮演著重要的角色(Ridley et al., 1992)。由於這點，使其變成在標靶治療上是個不太理想的標靶點。另一方面 Rac2 以及 Rac3 由於它們表達在特定的組織裡，所以它們在癌症的標靶治療上是個更適合的標靶點。在未來的研究裡，希望能利用我們建立的癌症模式作為篩藥的平台。其中 Rac 蛋白質在我們的研究中顯示，若將其削弱後會影響腫瘤細胞的特性，因此亦可開發以 Rac 當作標靶，治療神經膠母細胞瘤的藥物。而 Hep3B 細胞株的異體移植模式中，亦能作為篩選抑制癌細胞轉移之新藥的平台。在東亞洲地區，中草藥一直被廣泛的使用，值得注意的是，近年來在篩選治療癌症的藥物當中，中草藥被視為明日之星。有鑑於中草藥的興起，我們希望透過這個癌症模式做為一個平台來進行藥物的篩檢，期望可以找出新穎、效果佳且副作用低的中草 49.

(51) 藥來治療癌症。近年來在癌症的治療上，有一派科學家認為大部分的癌症都是異質性的且含有一小群具有高致腫瘤性和高抗藥性的癌症幹細胞存在(Zhao et al., 2013)。他們相信，由於癌症幹細胞與健康的幹細胞一樣擁有自我更新與分化的能力，使得癌症具有抗藥性、高復發性和高轉移性，因此這也是癌症難以治癒的原因之一 (Zhao et al., 2013)。在我們的研究中，我們將癌症細胞株以低分化的條件培養成球狀(sphere)的類癌幹細胞(Lloyd et al., 2013)。並以這些細胞建立了斑馬魚的癌症平台，且欲利用之篩選對類癌幹細胞有治療效果的中草藥。相較於西方的化學藥物，中草藥藥性溫和且行之有年，因此希望能借此平台篩選出有效且可以針對癌症幹細胞進行治療的新藥物。在我們的研究中，對癌細胞的另一個特性－細胞增殖的現象於 U251-MG、U373-MG 和 Hep3B 的細胞株中都沒有明顯的被觀察到，爾後或許可以以其他的癌症細胞株進行實驗，以建立一個癌細胞增殖的模式。. 50.

(52) 參、參考文獻 Abdel-Latif, D., Steward, M., Macdonald, D.L., Francis, G.A., Dinauer, M.C., and Lacy, P. (2004). Rac2 is critical for neutrophil primary granule exocytosis. Blood 104, 832-839. Aspenstrom, P., Fransson, A., and Saras, J. (2004). Rho GTPases have diverse effects on the organization of the actin filament system. The Biochemical journal 377, 327-337. Azim, A.C., Cao, H., Gao, X., Joo, M., Malik, A.B., van Breemen, R.B., Sadikot, R.T., Park, G., and Christman, J.W. (2007). Regulation of cyclooxygenase-2 expression by small GTPase Rac2 in bone marrow macrophages. American journal of physiology Lung cellular and molecular physiology 293, L668-673. Batista, C.M., Mariano, E.D., Barbosa, B.J., Morgalla, M., Marie, S.K., Teixeira, M.J., and Lepski, G. (2014). Adult neurogenesis and glial oncogenesis: when the process fails. BioMed research international 2014, 438639. Chan, A.Y., Coniglio, S.J., Chuang, Y.Y., Michaelson, D., Knaus, U.G., Philips, M.R., and Symons, M. (2005). Roles of the Rac1 and Rac3 GTPases in human tumor cell invasion. Oncogene 24, 7821-7829. Chastre, E., Abdessamad, M., Kruglov, A., Bruyneel, E., Bracke, M., Di Gioia, Y., Beckerle, M.C., van Roy, F., and Kotelevets, L. (2009). TRIP6, a novel molecular partner of the MAGI-1 scaffolding molecule, promotes invasiveness. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology 23, 916-928. Colman, H., Zhang, L., Sulman, E.P., McDonald, J.M., Shooshtari, N.L., Rivera, A., Popoff, S., Nutt, C.L., Louis, D.N., Cairncross, J.G., et al. (2010). A multigene predictor of outcome in glioblastoma. Neuro-oncology 12, 49-57.. 51.

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