建立硫鐵蛋白基因轉殖阿拉伯芥品系系統

壹、利用抗生素篩選 atfd1 及 atfd3 基因轉殖阿拉伯芥

已知硫鐵蛋白以電子調控者的角色參與植物的生長發育、能量儲存及抵抗逆 境等基礎代謝路徑，因此本研究探討增加植物體內硫鐵蛋白之含量，對植物生長 發育的影響，選用 A. tumefaciens GV3101 做為轉殖用菌株，其中含帶有目標基 因的 pBI121 載體 (圖 2)，藉由 35S 啟動子讓目標基因在阿拉伯芥體內增量表 現，並帶有一段 kanamycin 抗生素之抗性基因 neomycin phosphotransferase II (npt II)，將植株種在含抗生素之培養基上，若是轉殖成功的阿拉伯芥植株，則會 有抵抗抗生素的能力並存活下來，反之則會被抗生素抑制植株生長呈現白化的情 況，藉此作為基因轉殖株的初步篩選依據，存活下之基因轉殖株初步判定為基因 轉殖阿拉伯芥品系。結果顯示，AtFd1 T0 基因轉殖株約播種 1000 顆種子中，

約 10 棵植株發芽，僅約 5 棵植株通過抗生素篩選，存活率不到 1％ (圖 3A)，

AtFd3 T0 基因轉殖株約播種 1000 顆種子當中，約 10 棵植株發芽，僅約 4 棵 植株通過抗生素篩選，存活率不到 1％ (圖 3B)，將通過抗生素篩選存活下來的 阿拉伯芥植株移盆至土壤環境培養，再抽取植物基因組 DNA (Genomic DNA) 以 PCR 進一步鑑定，將確定的基因轉殖阿拉伯芥品系培養至開花繁殖期再自花 授粉獲得 T2 及 T3 子代種子。

貳、利用 PCR 鑑定 T2

及 T

由於在基因轉殖載體中，農桿菌會將目標基因送進植物的基因組 DNA 中，

目標基因的兩側分別為花椰菜嵌紋病毒 35S 啟動子及農桿菌 nopaline synthase (nos) 基因終止子的基因序列，而未轉殖的阿拉伯芥並未有這兩段基因序列。為 了確認農桿菌是否將目標基因送進植物的基因組 DNA 中，可以利用此兩段基

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因設計引子來檢測基因轉殖阿拉伯芥品系是否存在轉殖基因的序列，所以本次將 利用 PCR 篩選出基因轉殖阿拉伯芥品系。首先將帶有目標基因的載體利用設計 出的 35S 及 NOS 引子經由 PCR 技術後，結果顯示帶有 atfd1 基因的載體，經 PCR 後可在 761 bp 可以發現有訊號的出現，帶有 atfd3 基因的載體，經 PCR 後可在 773 bp 可以發現有訊號的出現 (圖 4A)，確定此引子可以用來檢測基因 轉殖株，再抽取待檢測 AtFd1 及 AtFd3 基因轉殖株阿拉伯芥的基因組 DNA 利用同樣方式進行 PCR，結果顯示，檢測 AtFd1 3-11 基因轉殖阿拉伯芥品系，

皆在 761 bp 發現有一訊號 (圖 4B)，檢測 AtFd3 2-4-1 基因轉殖阿拉伯芥品系，

皆在 773 bp 發現有一訊號 (圖 4C)，而未轉殖基因阿拉伯芥或者基因轉殖未成 功的阿拉伯芥，則沒有發現此訊號。

為了進一步確認獲得的 T2 及 T3 子代基因轉殖阿拉伯芥品系其遺傳特性，

利用移 傳率判 斷轉 殖進去 的基 因是 同型合 子 (Homozygote) 或是 異型 合 子 (Heterozygote)，計算其 PCR 鑑定比例，若是同型合子檢測比例應約為 4：0，

若是異型合子檢測比例應為 3：1。實驗中各基因轉殖株檢測的株數經過兩次 PCR 檢測後皆無訊號被判定為非轉殖成功的植株。結果顯示，Fd1 2-4 基因轉殖 阿拉伯芥品系共檢測了 25 棵，其中有 23 棵被鑑定為基因轉殖株，其檢測率為 92%；Fd1 3-11 基因轉殖阿拉伯芥品系共檢測了 61 棵，其中有 60 棵被鑑定為 基因轉殖株，其檢測率為 98%；Fd1 4-18 基因轉殖阿拉伯芥品系共檢測了 32 棵，

其中有 31 棵被鑑定為基因轉殖株，其檢測率為 97%；Fd3 2-4-1 基因轉殖阿拉 伯芥品系共檢測了 58 棵，其中有 50 顆被鑑定為基因轉殖株，其檢測率為 86%；

Fd37-6-9 基因轉殖阿拉伯芥品系共檢測了 74 棵，其中有 70 棵被鑑定為基因轉 殖株，其檢測率為 95%；Fd3 8-3 基因轉殖阿拉伯芥品系共檢測了 73 棵，其中 有 66 棵被鑑定為基因轉殖株，其檢測率為 90%；野生型阿拉伯芥品系共檢測 了 66 棵，皆被鑑定為未基因轉殖株 (表 1)。由此結果可推測，T₂ 及 T₃ 基因 轉殖阿拉伯芥品系皆為同型合子之基因轉殖阿拉伯芥品系。

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參、利用 RT-PCR 及 Q-PCR 偵測在種子萌芽期基因轉殖阿拉伯芥 fd1-mRNA 及 fd3-mRNA 之變化

進一步確認目標基因是否有轉錄 (transcription) 產生 RNA，並為了比較目 標基因的 RNA 表現量的變化，利用 RT-PCR 檢測基因轉殖株目標基因的 mRNA 是否有被增量表現，由於在野生型阿拉伯芥體內的 atfd1 mRNA 表現量 是很微量的，應該低於基因轉殖阿拉伯芥品系。本次抽取植株的 Total RNA，以 相同 mRNA 含 量 做 為 模 版 ， 使 用 目 標 基 因 設 計 專 屬 引 子 ( 附錄 1) 進行 RT-PCR，比較基因轉殖株與未基因轉殖株中目標基因的表現量。以

elongation factor-1 alpha (ef1α) 作為定量控制組 (loading control)，確認本實驗所加入的

結果顯示，Fd1 2-4 基因轉殖阿拉伯芥品系中 atfd1 基因的含量有增幅約 57 倍 的表現，Fd1 4-18 基因轉殖阿拉伯芥品系中 atfd1 基因的含量有增幅約 127 倍 的表現 (圖 6A)，Fd3 7-6-9 基因轉殖阿拉伯芥品系中 atfd3 基因的含量有增幅約 7 倍的表現，Fd3 8-3 基因轉殖阿拉伯芥品系中 atfd3 基因的含量有增幅約 15 倍 的表現 (圖 6B)。以上結果得知本次使用之基因轉殖阿拉伯芥體內之 fd mRNA 皆有被增量表現。

肆、利用西方墨點法偵測阿拉伯芥中 AtFd1 及 AtFd3 蛋白含量

為了比較基因轉殖與未轉殖阿拉伯芥體內 AtFd1 及 AtFd3 蛋白質有無差 異，在增量表現的 RNA 轉譯 (translation) 成蛋白質後，進一步偵測阿拉伯芥體

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內目標蛋白質變化含量，採用西方墨點法進行試驗，選用 PFLP 重組蛋白質被 用來製備 AtFd1 之多元抗體，此抗體是來自甜椒的重組蛋白，可辨識阿拉伯芥、

玉米、水稻及番茄等植物體內的光合作用型硫鐵蛋白，此多元抗體可以成功偵測 到阿拉伯芥體內的 AtFd1 蛋白質；選用 AtFd3 重組蛋白質被用來製備 AtFd3 之多元抗體，此抗體是來自阿拉伯芥的重組蛋白，多元抗體分別可以成功偵測到 阿拉伯芥體內的 AtFd3 蛋白質。結果顯示生長 30 天的植株葉片組織蛋白萃取 液進行SDS 電泳後會出現明顯訊號。以 WT 當做 1 比較其他品系的目標蛋白 相對變化量，Fd1 2-4 基因轉殖阿拉伯芥品系有約 4.3-4.5 倍的增幅 (圖 7A)，

Fd1 4-18 基因轉殖阿拉伯芥品系有約 4.6 倍的增幅 (圖 7B)，Fd3 8-3、Fd3 2-4-1 及 Fd3 7-6-9 基因轉殖阿拉伯芥品系分別有 2.2-2.8、4.5-5.1 及 2.3 倍的增幅 (圖 7C)，利用西番紅 (Poncean S solution) 染色及考馬斯亮藍 (coomassie blue) 染色總量蛋白質當作實驗的對照組。以上結果得知本次使用之基因轉殖阿拉伯芥 體內之 Fd 蛋白質皆有被增量表現。