第一章、 前言
第四節、 研究目的
前人研究中發現硫鐵蛋白在植物體內參與很多生長代謝的路徑，為了瞭解在 植物體內增量表現光合作用及非光合作用型硫鐵蛋白，對於生長發育及離子敏感 性有何影響，本次實驗利用阿拉伯芥作為模式植物，將光合作用及非光合作用型 硫鐵蛋白分別增量表現於阿拉伯芥當中，觀察基因轉殖植株分別在種子萌芽期、
營養生長期及開花繁殖期的影響變化；我們推測增量表現光合作用及非光合作用 型硫鐵蛋白可能會影響清除 ROS 相關基因，故進一步偵測基因轉殖阿拉伯芥體 內清除 ROS 相關基因之變化，以及對於離子敏感性有何影響，在本實驗將改變 基因轉殖植株生長環境中內源性的離子濃度，另一實驗則是以額外添加外源性離 子讓基因轉殖植株受到離子毒害時的變化。
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第二章、 材料與方法
第一節、 實驗材料
壹、菌株材料
大腸桿菌分別為 Escherichia coli DH5α、E. coli DH5α pBI121-atfd1、E. coli DH5α pBI121-atfd3、E. coli M15 (Qiagen, Germany)。E. coli DH5α 培養於 Luria Bertani 培養基 (LB medium) ；E. coli DH5α pBI121-atfd1 及 E. coli DH5α pBI121-atfd3 菌株培養於含 50 ppm 卡那黴素 (kanamycin, Kan) (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) 的 LB 培養基；E.coli M15 菌株培養於含 50 ppm Kan 的 LB 培養基；E. coli M15 pQE30-atfd1 及 E. coli M15 pQE30-atfd3 菌株培養於含 50 ppm Kan 及 100 ppm 氨青黴素 (ampicillin, Amp) (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) 的 LB 培養基。農桿菌分別為 Agrobacterium tumefaciens GV3101、A. tumefaciens GV3101 pBI121-atfd1 及 A. tumefaciens GV3101 pBI121-atfd3，A. tumefaciens GV3101 培養於含 25 ppm 建大黴素 (gentamicin, Gen) (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) 的 LB 培養基；A. tumefaciens GV3101 pBI121-atfd1 及 A. tumefaciens GV3101 pBI121-atfd3 菌株培養於含 25 ppm Gen 及 50 ppm Kan LB 培養基。
貳、植物材料
阿拉伯芥品種為 Arabidopsis thaliana cv. Columbia，以此做為實驗組中的野 生株 (Wild Type, WT)，將此 A. thaliana cv. Columbia 品種阿拉伯芥增量表現
atfd1 即得到 AtFd1 轉基因阿拉伯芥，品系分別為 Fd1 2-4、Fd1 3-11 及 Fd1 4-18，
將此 A. thaliana cv. Columbia 品種阿拉伯芥增量表現 atfd3 即得到 AtFd3 轉基 因阿拉伯芥，品系分別為 Fd3 2-4-1、Fd3 7-6-9 及 Fd3 8-3，培育條件與非轉基 因品種相同。
参、植物培養條件
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播種之前會先將阿拉伯芥種子利用次氯酸鈉 (1%) 滅菌，並放置於黑暗環境 中 4℃ 進行春化作用 12 小時後，將阿拉伯芥種子播種於 Murashige and Skoog 培養基 (MS medium)(Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)，含 0.5% gelrite，pH 6.0，
待生長 15 天後將植株移盆至 3 吋的塑膠軟盆中，生長環境為 12 小時光照，12 小時黑暗，日夜溫度 22℃，光強度為 12 μmol m-2 s-1。
第二節、 實驗方法
壹、 轉殖植物的建立
首先挑選 A. tumefaciens GV3101 pBI121-atfd1 及 A. tumefaciens GV3101 pBI121-atfd3 菌落並在 50 ml 含 25 ppm Gen 及 50 ppm Kan 的 LB 培養液中 培養。以 1,000 ×g 離心 5 分鐘，去除上清液並以轉殖培養基重新懸浮菌體，即 為轉殖緩衝液。待阿拉伯芥培育至繁殖期，取花序約 15 公分的阿拉伯芥植株，
剪掉植株的果莢及已開的花，然後剪取適當大小的封口膜 (parafilm) (Pechiney Plastic Packaging, Chicago, USA)，將其套在植盆的土上，以避免土掉落。將植物 倒扣使花序浸泡於轉殖緩衝液中。以 700 mm Hg 進行真空抽氣 15 分鐘。然後 將浸泡後的植物平躺，靜置於黑暗中，待隔天再立起。約一個月至兩個月使植株 自交即可收到 atfd1 及 AtFd3 基因轉殖阿拉伯芥種子。
貳、 抗生素篩選基因轉殖阿拉伯芥
將基因轉殖阿拉伯芥種子播種於含有 50 ppm Kan 之 MS 培養基中，轉殖 成功的阿拉伯芥植株，則會有抵抗抗生素的能力並存活下來，反之則會被抗生素 抑制植株生長呈現白化的情況；待植株生長第 15 天時，將順利存活之植株移盆 至 3 吋的塑膠軟盆中，並放於植物培養箱生長，生長環境為 12 小時光照，12 小 時黑暗，日夜溫度 22℃，光強度為 12 μmol m-2 s-1。
參、 植物基因組 DNA 分析 一、植物基因組 DNA 抽取
植 物基因組 DNA 的抽取是利用植物基因組 DNA 迷你試劑組 (plant genomic DNA mini kit) (Geneaid Biotech, Taipei, Taiwan)。取約 0.05 g 阿拉伯芥嫩
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葉組織放入 1.5 ml 微量離心管中，加入液態氮磨碎。加入 400 μl GP1 緩衝液 及 5 μl RNase A 後均勻混合，放入 65℃ 水浴槽 10 分鐘使細胞破裂。再加入 100 μl GP2 緩衝液並置於冰上 3 分鐘，使醣類及蛋白質沉澱下來。將此混合液 取出置入過濾管柱 (filter column)，以 1,000 ×g 離心 1 分鐘，去除葉片組織。
將此濾液加入 750 μl 的 GP3 緩衝液，輕輕上下搖晃加以混合。將混合液吸入 GD 管柱 (GD column) 中，以 13,000 ×g 離心兩分鐘並丟棄廢液。加入 400 μl W1 緩衝液，以 13,000 ×g 離心 30 秒並丟棄廢液，加入 600 μl Wash 緩衝液 (Wash buffer)，以 13,000 ×g 離心 30 秒並丟棄廢液。再以 13,000 ×g 空轉 3 分 鐘，去除多餘溶液。將 GD 管柱 (GD column) 放置於新的 1.5 ml 離心管中，
加入 30 μl 預熱 65℃ 的洗脫緩衝液 (elution buffer)，靜置 5 分鐘。以 13,000
×g 離心 30 秒。所收集的濾液即含有高含量的植物基因組 DNA。
二、聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR) 鑑定基因轉殖株
利用 PCR 技術確定轉基因阿拉伯芥是否有轉基因的存在。PCR 反應條件 如下：5 μg 的植物基因組 DNA，1 μl 的 10 mM 脫氧核醣核酸 (deoxynucleotide triphosphate, dNTP) 混合液 (Violet bioscience, Taipei, Taiwan)，3 μl 的 10 倍 PCR 緩衝溶液 (Violet bioscience, Taipei, Taiwan)，1 μl 的 1 μM 35S 啟動子引 子 (5’-AAG GGA TGA CGC ACA ATC CCA CTA TCC TTC-3’) (Blossom Biotechnologies Inc., Taipei, Taiwan) (Huang et al., 2007)，1 μl 的 1 μM NOS 終止 子引子 (5’-TGA TAA TCA TCG CAA GAC CGG CAA CAG GAT-3’) (Blossom Biotechnologies Inc., Taipei, Taiwan) (Huang et al., 2007)，0.05 μl 的 TaqPlus precisionTM 聚合酶酵素 (Violet Bioscience, Taipei, Taiwan)，最後添加無菌水，使 其最終體積為 30 μl。PCR 反應器的設定如下：預熱反應為 94℃ 加熱 5 分鐘，
循環反應為 94℃，60 秒；62℃，45 秒；72℃，45 秒。此條件循環 30 次，最 後 再 以 72 ℃ 反 應 10 分 鐘 。 將 所 得 到 PCR 產 物 注 入 於 由 0.5 倍 的 Tris-acetate-EDTA (TAE) 緩衝溶液與 洋菜凝膠粉 (agarose-LE 1200) (Taiwan Agar-Agar, Chiayi, Taiwan) 配製的 1% 洋菜凝膠。以 16.67 v cm-1 條件進行電泳 分離。待 DNA 電泳分離後，取出膠體並浸泡於含 0.5 μg mL-1 之溴化乙錠 (ethidium bromide, EtBr) (Zymeset Biology, Taipei, Taiwan) 溶液 10 分鐘，再泡至 於水中進行脫色 10 分鐘，最後以電泳膠數位影像系統拍攝。即可鑑定基因轉殖
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是否成功。
肆、 植物總量 RNA 基因表現量分析 一、植物總量 RNA 抽取
植物總量 RNA 的抽取是利用植物總 RNA 迷你試劑組 (plant total RNA extraction miniprep system) (Viogene, Taipei, Taiwan)。取約 0.05 g 左右阿拉伯芥 嫩葉組織放入 1.5 ml 微量離心管中，加入液態氮磨碎。加入 450 μl RX 緩衝液 後均勻混合，進行震盪使細胞破裂。將此混合液取出置入過濾管柱 (Shearing column)，以 10,000 ×g 離心 2 分鐘，移除葉片組織。將此濾液加入 230 μl 的 酒精 (98-100%)，輕輕上下搖晃加以混合。將混合液吸入植物總 RNA 迷你管柱 (plant total RNA mini column) 中，以 8,000 ×g 離心 1 分鐘並丟棄廢液。加入 500 μl WF 洗滌緩衝液 (WF buffer)，以 13,000 ×g 離心 30 秒並丟棄廢液，加 入 700 μl WS 洗滌緩衝液 (WS buffer)，以 13,000 ×g 離心 30 秒並丟棄廢液，
此步驟重複 2 次。再以 13,000 ×g 空轉 3 分鐘，去除多餘溶液。將植物總 RNA 迷你管柱 (plant total RNA mini column) 放置於新的 1.5 ml 離心管中，加入 30 μl 二次蒸餾水 (RNase-free)，以 13,000 ×g 離心 30 秒。所收集的濾液即含有高 含量的植物總 RNA。
二、反轉錄聚合酶連鎖反應 (reverse transcription-PCR, RT-PCR)
利用 RT-PCR 技術確定轉基因阿拉伯芥中轉基因的表現。RT-PCR 反應條 件如下：1 μg 的植物總 RNA，6 μl 的五倍反應混合溶劑 (reaction mix buffer ) ， 1 μl 的 1 μM 引子 (附錄 1)，1 μl 的酵素混合溶劑 (Enzyme mix buffer)，最後 添加無菌水，使其最終體積為 30 μl。RT-PCR 反應器的設定如下：反轉錄條件 為 50℃，30 分鐘； PCR 預熱反應為 94℃ 加熱 5 分鐘，循環反應為 94℃，
60 秒；48-54℃ (視引子條件而定)，45 秒；72℃，45 秒。此條件循環 35 次，
最後再以 72℃ 反應 10 分鐘。將所得到 RT-PCR 產物注入於由 0.5 倍的 Tris-acetate-EDTA (TAE) 緩衝溶液與 洋菜凝膠粉 (agarose-LE 1200) (Taiwan Agar-Agar, Chiayi, Taiwan) 配製的 1% 洋菜凝膠。以 16.67 v cm-1 條件進行電泳 分離。待 DNA 電泳分離後，取出膠體並浸泡於含 0.5 μg mL-1 之溴化乙錠 (ethidium bromide, EtBr) (Zymeset Biology, Taipei, Taiwan) 溶液 10 分鐘，再泡至
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於水中進行脫色 10 分鐘，最後以電泳膠數位影像系統拍攝。即可鑑定基因轉殖 是否成功。
三、定量即時聚合酶連鎖反應 (quantitative RT-PCR , Q-PCR)
利用 Q-PCR 技術即時定量轉基因阿拉伯芥中基因的相對變化值。Q -PCR 反應條件如下：1 μg 的植物總 RNA，6 μl 的五倍反應混合溶劑 (reaction mix buffer ) ，1 μl 的 1 μM 引子 (附錄 1)，1 μl 的酵素混合溶劑 (Enzyme mix buffer)，15 μl 賽普格林混合試劑 (SYBR Green Master Mix) (Applied Biosystems, Taipei, Taiwan)，最後添加無菌水，使其最終體積為 30 μl。Q -PCR 反應器的設 定如下：反轉錄條件為 50℃，30 分鐘； PCR 預熱反應為 94℃ 加熱 5 分鐘，
循環反應為 94℃，60 秒；48-54℃ (視引子條件而定)，45 秒；72℃，45 秒。
此條件循環 35 次，最後再以 72℃ 反應 10 分鐘。
伍、 蛋白質分析 一、 蛋白質含量測定
實驗中測量蛋白質含量的方式是蛋白質微量分析法 (Bio-Rad protein assay microassay procedure kit) (Bio-Rad, Taipei, USA)。取約 0.05 g 左右阿拉伯芥嫩葉 組織放入 1.5 ml 微量離心管中，加入液態氮磨碎。加入 1000 μl 蛋白萃取液，
經震盪機均勻震盪 10 秒後冰浴 30 秒。上述步驟重複三次後，以 7,800 ×g 離 心 5 分鐘取上層溶液，即為待偵測蛋白溶液。配製染色試劑溶液，即五倍稀釋 的 Bio-Rad protein assay buffer (Bio-Rad, Taipei, USA)，利用 Whatman No.1 濾紙 (Whatman International, England) 過濾。準備 0、2、5、10 及 20 μg μl-1 的小牛 血清蛋白 (bovine serum albumin, BSA) 溶液作為標準蛋白溶液。各取 10 μl 不同濃度的標準蛋白溶液或待偵測蛋白質溶液，分別與 190 μl 無菌水及 800 μl 的染色試劑溶液均勻混合，靜置反應 5 分鐘，取出混合液偵測吸光值 (O.D.595)。
把標準蛋白溶液的吸光值對蛋白質濃度作圖，計算出回歸直線公式，再將待偵測 蛋白質溶液的吸光值代入，以內插法算出其蛋白質溶液濃度。
二、 聚丙烯醯胺膠體電泳 (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel
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electrophoresis, SDS-PAGE)
首先準備五倍泳動緩衝液 (running buffer)，六倍樣本緩衝液 (sample buffer)。
將製作迷你電泳膠的玻璃片經 70% 酒精 (ethanol) 清洗乾淨後，將玻璃片利用 製膠夾夾住，並放至製膠台上固定住，組合成鑄膠槽。取 2.5 ml 的 30% 丙烯 醯胺溶液 (acrylamide：bis-acrylamide=29.2：0.8) (Merck, Darmstadt, Germany))，
1.3 ml 的 1.5 M Tris-HCl, pH 8.8 (Merck, Darmstadt, Germany)，50 μl 的 10% 十 二烷基硫酸鈉 (sodium dodecyl sulfate, SDS) (Amresco, Solon, USA)，50 μl 的 10% 過硫酸銨 (ammonium persulfate, APS) (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)，1.1 ml 的水及 2 μl 的四甲基二乙胺(N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine, TEMED) (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) 混合成 5 ml 的分離膠體溶液。將此溶液注入鑄 膠槽中，並在膠體上覆蓋少量的異丙醇 (isopropanol) (Panreac, Barcelona, Spain)。
待膠體凝固，界面形成後，將異丙醇倒掉。取 0.5 ml 的 30% 丙烯醯胺溶液，
0.38 ml 的 0.5 M Tris-HCl, pH 6.8，30 μl 的 10% SDS，30 μl 的 10% APS，2.1 ml 的水及 3 μl 的 TEMED 混合成 3 ml 的焦集膠體溶液。再將此溶液注入分 離膠體上，並插入齒槽模待凝固。把完成後的膠片，取下齒槽模及製膠夾，裝入 電泳槽內。然後電泳槽添加一倍泳動緩衝液。將適量的樣本蛋白質分別與五分之 一體積的六倍樣本緩衝液混合，經沸水浴 15 分鐘，冷卻後快速離心，然後將樣 本 混 合 液 與 預 染 蛋 白 質 標 記 (prestained protein marker) (GeneReach Biotechnology, Taichung, Taiwan) 分別注入樣本槽中。通以 80 伏特的電壓 30 分鐘，再提升電壓至 120 伏特，待 Marker 中 18 kDa 到達膠體長度的三分之 二位置，關閉電源。取出膠體可供考馬斯亮藍 (coomassie blue) 染色、西番紅 (Poncean S) 染色或西方墨點法之使用。
三、 膠體考馬斯亮藍 (coomassie blue) 染色
將 SDS-PAGE 電泳膠片浸泡於考馬斯亮藍 (coomassie blue) 染劑中一小時。
接著改為考馬斯亮藍 (coomassie blue) 退染劑，浸泡 30 分鐘後，改換成稀釋 0.5 倍的考馬斯亮藍 (coomassie blue) 退染劑進行褪色。
四、 西番紅 (Poncean S) 染色
將已轉印蛋白的轉印膜浸泡於西番紅 (Poncean S solution) 染劑中約 30
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分鐘，待轉印膜上呈色出來後，以清水清洗並置於 3 mm 濾紙上乾燥。
五、 蛋白質電泳膠封片
封片的方式是利用 DryEase mini-gel drying system kit (Invitrogen, USA)。取 出 2 張 半 透 膜 (mini-cellophanes) 與 SDS-PAGE 電 泳 膠 片 一 同 浸 泡 過
封片的方式是利用 DryEase mini-gel drying system kit (Invitrogen, USA)。取 出 2 張 半 透 膜 (mini-cellophanes) 與 SDS-PAGE 電 泳 膠 片 一 同 浸 泡 過