第一章、 前言
第一節、 硫鐵蛋白之介紹
第一章、 前言
第一節、 硫鐵蛋白之介紹
壹、硫鐵蛋白之分類
硫鐵蛋白 (ferredoxin, Fd) 是一群具有 2Fe-2S 官能基的蛋白質，主要的功 能區之胺基酸排列為 CX4CX2CXnC，其中 C 代表的是胺基酸 cysteine。cysteine 透過特定的序列結合細胞中 2 價或 3 價的鐵離子鍵結形成錯合離子的螯合物，
再藉由電子來改變當中鐵離子的帶電狀況 (Fe2+↔Fe3+)，成為生物體內氧化還原 反應 (oxidation-reduction reaction) 的調控者。Fd 蛋白質具有許多不同還原電位 的異構蛋白 (isoproteins)，目前已經被報告的 Fd 異構蛋白超過 200 多種，分 別在原核與真核生物中均有發現 (Hanke et al., 2004)。在藍綠藻方面 Anabaena
variabilis 目 前 已 發 現 有 七 種 以 上 的 Fd ， 分 別 為 Av1 (gi157831119) 、 Av2
(gi75906422)、Av3 (gi75906791)、Av4 (gi75907204)、 Av5 (gi75907755)、Av6 (gi75910144) 及 Av7 (gi75910456)。在另一隻藍綠藻 Synechocystis sp. PCC 6803 中也發現三種 Fd：Ssp1 (gi16329789)、Ssp 2 (gi16330020)、Ssp 3 (gi16330840)。在 水 稻 (Oryza sativa) 體 內 發 現 的 Fd 有 Os1 (gi115456441) 、 Os2 (gi115458276) 、Os3 (gi115464151)、Os4 (gi18698985)、Os5 (gi2305115) 及 Os6 (gi56784805) 等六種以上的 Fd。在太陽花 (Helianthus annuus) 等經濟作物中也 有被發現兩種以上的 Fd，如 HaFd1 (gi37779195) 及 HaFd2 (gi68137465) 等 (Venegas-Caleron et al., 2009)。在玉米 (Zea mays) 體內發現的 Fd 有 Zm1 (gi119928) 、 Zm2 (gi119961) 、 Zm3 (gi3417455) 及 Zm4 (gi119958) 。 番 茄 (Lycopersicon esculentum cv Momotaro) 也有五種 Fd (FdA, FdB, FdC, FdD, and FdE) 被發現，阿拉伯芥體內的 Fd 已經被報告的也超過 6 種以上 (Green et al., 1991, Aoki et al., 1996)。其中以阿拉伯芥 (Arabidopsis thaliana cv. Columbia) 體 內 Fd 相關研究最為完整。
Fd 異構蛋白中可以依據其在植物體內分佈的位置及胺基酸序列的相似性 被分為兩大類型：第一類型為光合作用型硫鐵蛋白質 (photosynthetic-type Fd, PT-Fd)，此類 Fd 主要存在於植物綠色組織的葉綠體中，也被稱為葉部型 Fd (leaf-type Fd, LT-Fd)，該 Fd 負責參與光合作用反應中電子傳遞的工作。在一般
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狀態下光合作用的光反應電子傳遞路徑會偏向直線型電子傳遞路徑 (linear electron flow, LEF)，在進行 LEF 路徑時 PSI 會將電子傳給 Fd，而 Fd 接受電 子後再傳給 FNR，將 NADP+ 還原成 NADPH (Hanke et al., 2004)。另外，植物 面對逆境時，Fd 也可能會將電子交給細胞色素蛋白 (Cytochrome b6f complex, cytb6f)，形成所謂的循環式電子傳遞路徑 (cyclic electron flow, CEF)，當該循環路 徑發生時，雖然可以快速獲得 ATP，但是並不會產生 NADPH，暗反應將也因 此無法順利運行，取而代之的是產生許多色素或二次代謝物 (Joliot and Joliot, 2006)。
第二類型為非光合作用型硫鐵蛋白質 (non-photosynthetic-type Fd, NT-Fd) 又稱為根部型 Fd (root-type Fd, RT-Fd)。此類型的 Fd 常出現在植物儲存性組織 中，例如根部、種子、果實等的澱粉體 (amyloplast) 中。在西元 2006 年，Balmer 等人使用蛋白質體學及免疫學方法，在小麥胚乳分離出來的澱粉體 (amyloplast) 中，發現由 NT-Fd 與硫氧還原蛋白 (thioredoxin, Trx) 所組合成的 Fd/Trx 系統。
他們推測該 Fd/Trx 系統參與了澱粉體中澱粉的新陳代謝、脂質生合成、胺基酸 生合成、核苷酸生合成及蛋白質的摺疊等數幾個反應，且經由此系統可以改變葉 片組織的光合作用反應效率進而調節儲存性組織中澱粉體的代謝反應 (Balmer et al., 2006)。
貳、阿拉伯芥體內之 Fd 異構硫鐵蛋白
目前在阿拉伯芥中的 Fd 異構蛋白可以依據在植物體內分佈與特性被分為 三種不同類型。第一類型 PT-Fd，在阿拉伯芥葉部可分離 AtFd1 (At1g10960) 及 AtFd2 (At1g60950)。其中 AtFd1 的還原電位為 -425 mV，148 個胺基酸序列，
分子量為 15.89 kDa，等電點為 4.17；而 AtFd2 的還原電位為 -433 mV，148 個 胺基酸序列，分子量為 15.54 kDa，等電點為 4.10。兩者的功能負責在葉綠體光 合作用反應中進行電子傳遞 (Hanke et al., 2004)。為了探討該 PT-Fd 在光合作用 反應所扮演的角色，有學者利用 RNA 干擾 (RNA interference, RNAi) 的技術去 改變阿拉伯芥體內 Fd 異構蛋白的表現量，藉以探討 PT-Fd 在光合作用反應所 扮演的角色，該研究的結果顯示，其中 atfd2-RNAi 轉基因阿拉伯芥的 LEF 效率 與 葉 綠 素 螢 光 (chlorophyll fluorescence) 中 的 光 化 學 抑 制 (photochemical quenching) 效率比未轉基因阿拉伯芥來的低，而葉綠素螢光中的非光化學抑制
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(non-photochemical quenching) 有較高效率，在 atfd1-RNAi 轉基因阿拉伯芥方面，
其葉綠素螢光中的非光化學抑制有較高效率。而 atfd3-RNAi 轉基因阿拉伯芥的 轉基因阿拉伯芥體內的過氧化物 (reactive oxygen species, ROS) 含量比一般未轉 機阿拉伯芥來的高，因此推斷 AtFd2 也參與了植物體內 ROS 生合成反應 (Voss et al., 2008)。而另外的學者研究也指出利用葉綠體基因轉殖技術，培育出 增量表現 AtFd2 之轉基因煙草，該轉基因煙草植株之非光化學抑制效率有明顯 增高的現象，這也意味增量表現 PT-Fd 之轉基因植株會增強從葉綠體基質中的 Fd-quinone oxidoreductase (FQR) 往 Plastoquinone (PQ) 的電子傳遞 (Yamamoto et al., 2006)。 (anti-sense)，培育出 pflp anti-sense 轉殖基因煙草，此改變可以降低該轉基因菸 草體內總量 Fd 的一半，在生長兩個禮拜時，其株高與葉片長比一般未轉基因煙 草短，顯示降低煙草體內 Fd 含量可能會導致植物生長出現延遲的現象 (Huang et al., 2007a)。
第二類型 NT-Fd，在阿拉伯芥儲存性組織中可分離到 AtFd3 (At2g27510)。
其還原電位為 -337 mV，155 個胺基酸，分子量大小為 16.63 kDa，等電點為 4.92。
AtFd3 對 PSI 的親和力較低，但在光合作用被限制時，例如黑暗或葉片發育初 期，在葉片表現 AtFd3 可以增加植物代謝的效率 (Hanke et al., 2004)。目前研究 報告指出 AtFd3 對於生長代謝較不清楚。有報告指出利用 RNAi 技術降低
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AtFd3 含量，培育出 atfd3-RNAi 轉基因阿拉伯芥，該基因轉殖株之生長發育及 光合作用效率皆與未基因轉殖株無明顯差異，說明了 AtFd3 在阿拉伯芥中生長 發育及光合作用效率較不明顯 (Hanke and Hase, 2008)。
第三類型， 從阿拉伯 芥基因組 DNA 中也可以 發現其他 的 Fd ，包 括 AtFd1mi (At1g32550) 及 AtFd2mi (At4g14890)。其中 AtFd1mi 的胺基酸序列為 181 個，分子量 20.38 kDa、等電點為 5.63，而 AtFd2mi 的胺基酸序列為 154 個，
分子量 16.73 kDa，等電點為 4.46。此類 Fd 的序列比對結果顯示與腎臟細胞之 adrenodoxin (Adx) 類似，Adx 是一群常見於脊髓動物的粒腺體或者細菌體中的 Fd 。 該 類 Fd 具 有 在 粒 線 體 或 細 胞 質 中 傳 遞 電 子 或 移 除 ROS 的 功 能 (Wickramasinghe et al., 1974a, 1974b；Hanukoglu, 2006)。另外，在阿拉伯芥葉片 及根部中，還被發現有一種含量較少的 Fd，AtFd4 (At5g10000) 具有 148 個胺 基酸序列，16.26 kDa，等電等為 4.64，雖然其序列與 NT-Fd 相似，但其還原電 位為 -152 mV，推測此較低的還原電位可能是為了防止它傳遞電子給 Fd：NADP
＋oxidoreductase (FNR) 或 sulfite reductase (SiR)。AtFd4 在葉片與根部的含量都 很少，與其他 Fd 相比，提供電子時有較多的限制，推測 AtFd4 可能有些訊號 傳遞的功能 (Hanke et al., 2004)。
參、硫鐵蛋白在植物體內之功能
目前已知 Fd 參與許多電子傳遞路徑，調控基礎生理代謝反應包含光合作 用 (photosynthesis)、胺基酸合成 (amino acid synthesis)、脂質合成 (lipid synthesis)、
澱 粉 生 合 成 (starch synthesis) 及 過 氧 化 物 代 謝 (reactive oxygen species metabolism)、植物生長代謝 (plant-growing metabolism) 等 (Hanke et al., 2004；
Zurbriggen et al., 2008)。
國際上幾個研究團體也開始注意到硫鐵蛋白 (ferredoxin, Fd) 的含量是否 會影響到作物對於逆境的耐受能力。目前，報告指出：轉基因作物增量表現 Fd 後，
可以提高對於許多細菌性病菌的抵抗能力。以甜椒 (Capsicum annuum) 選殖出 Fd 基因 (pflp) 舉例，將此基因分別利用 CaMV 35S 啟動子增量表現在幾種不 同的基因轉殖作物，並證明這些基因轉殖作物對於病原菌的抗性可以有效的被提 升。例如提高基因轉殖菸草對菸草野火病菌 Pseudomonas syringae pv. tabaci 及
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引起軟腐病菌 Erwinia carotovora subsp. carotovora 的抗病能力 (Huang et al., 2004、2006、2007b)。提升基因轉殖蘭花 (Liau et al., 2003)、番茄、彩色海竽等 作 物 ， 對 於 軟 腐 病 菌 E. carotovora subsp. carotovora 及 由 Ralstonia
solanacearum 所引起青枯病的抗病能力，提高基因轉殖水稻對水稻白葉枯病菌 Xanthomonas oryzae pv. oryzae 的抗病能力 (Tang et al., 2001)。
另外，Fd 在植物對於非生物性逆境的能力扮演了一個重要的角色。在 Tognetti 等人的研究結果指出：植物體內 Fd 含量面對逆境時會出現下降的情形，
如果利用基因轉殖技術增量表現自藻類分離的 fld 基因 (flavodoxin) 做為 Fd 的替代物，增量表現 fld 基因在基因轉殖菸草的葉綠體中，能夠提升植物面對各 種逆境之耐受性，包含了殺草劑 (巴拉刈)、極端溫度、強光照、乾旱及紫外光 的輻射。另一方面，在缺鐵環境下該 fld 基因轉殖菸草，也出現較高的耐受能力，
而植物面對逆境時，會使氧化物增加導致依賴著 Trx 的酵素氧化並失去活性。
但是，Fld 表現在葉綠體之轉基因植株，能夠提升這些酵素之耐受性不受到逆境 影響 (Tognetti et al., 2007)。若將此 fld 基因增量表現於紫花苜蓿 (Medicago