依此結果可以推測，TNG67 高溫下穎果內 H2O2之含量雖只在 6、20DAF 提升，但其高溫下之脂肪過氧化程度、細胞死亡及 ATP 匱乏之現象均較嚴 重，可能是由於穎果內部的抗氧化系統在早期無法將具較強毒性之過氧化 物，如 superoxide radical (O2-．)、single oxygen (O2．)、hygroxyl radical (OH．)，
轉為毒性較弱之 H2O2，而使其高溫下遭受較嚴重之傷害。
(六)乙烯與多元胺合成相關基因表現
影響穎果發育、細胞死亡及米質形成的因子還包含植物荷爾蒙之調控，
其中乙烯、ABA 與多元胺可影響水稻上下穗位之米質之差異(Yang et al., 2006; Yang et al., 2008)。乙烯與多元胺之合成途徑有共同之前區物 SAM (S -Adenosylmethionine) ， SAMS (S-Adenosylmethionine synthetase) 是 將 methionine 轉為 SAM，過程需要消耗 ATP。SAM 若是走向乙烯合成途徑，
將被 ASC (ACC synthase)利用合成 ACC，再經由 ACO (ACC oxidase)消耗氧 氣合成乙烯。SAM 若是由 SAMDC (S-Adenosylmethionine decarboxylase)轉 為 Decaoboxylated SAM 則有利走向多元胺之合成。
由圖 22 得知 SAMS 在兩試驗材料常溫下之表現量隨發育而提升，以
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SA1739 在發育中後期表現量較高。高溫下兩品系試驗材料之 SAMS 在 6~9 DAF 表現量與常溫相似但自 15 DAF 起表現皆受抑制。TNG67 常溫下 ACS1 在 6~9 DAF 表現上升，隨後下降，但高溫下在 6~9 DAF 表現受到抑制，15~20 DAF 則提升。ACO1 常溫下則是 6~15 DAF 表現提升，隨後下降；高溫下則 促進其表現提前至 6~9DAF 發生。而在 ACO2 的表現上，高溫之表現較常溫 低。
SA1739 常溫下 ACS1 則是在 15 DAF 有較高之表現，高溫下 6、15、20
DAF 表現提升。ACO1 表現趨勢與 TNG67 相同，常溫下 6~15 DAF 表現提 升，隨後下降；高溫下則促進其表現提前至 6~9 DAF 發生，但其表現程度 皆較 TNG67 低。另 ACO2 在 SA1739 之表現與 ACO1 有同樣之趨勢。
由上述結果，僅能看出兩試驗材料在高溫下皆會誘導 ACO 之表現產生 乙烯，並且提早發生，但在 ACC 之前的乙烯之合成途徑還需再釐清其走向。
在多元胺合成方面，SAMDC (S-Adenosylmethionine decarboxylase)將 SAM 轉為 Decaoboxylated SAM，再與 putrescine 經由 SPDSY (spermidine synthase)產生 spermidine，再經由 SMS (spermine synthase)轉為 spermine。
Putrecine 為雙元胺，亦是合成多元胺之重要物質，可由 arginine 及 orinthine 經 ADC (Arginine decarboxylase)與 ODC (Ornithine decarboxylase)轉化而來。
TNG67 穎果內之 OsSAMDCⅠ常溫下表現隨發育而上升，高溫下表現 趨勢與常溫相同但其表現量皆高於常溫。OsSAMDCⅡ的表現常溫下亦是隨 發育上升，但高溫之表現量與常溫類似。ADC 在發育過程與高溫下皆無太 大變動 。SPDSYⅠ常溫下則隨發提升，高溫下表現量提升且趨勢與常溫相 同。SMS 常溫下 6~15 DAF 表現量下降，至 20 DAF 略升；高溫下隨發育階 段而上升，但 6~9 DAF 表現量較常溫低(圖 23)。
SA1739 穎果內 OsSAMDCⅠ常溫下表現隨發育而上升，高溫下表現趨 勢與常溫相同且表現量皆高於常溫。OsSAMDCⅡ的表現常溫下亦是隨發育
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上升，高溫下提升 9 DAF 的表現但在 20 DAF 則受到抑制。ADC 常溫下表 現隨發育而上升，高溫下表現趨勢與常溫相同，為表現量在 9 DAF 提升、
15 DAF 表現量比常溫低。SPDSYⅠ常溫下則隨發提升，高溫下表現量提升 且趨勢與常溫相同。SMS 常溫下 6~15 DAF 表現量逐漸上升，至 20 DAF 下 降；高溫下的表現量皆受到抑制。且 SA1739 在多元胺表現量之程度皆較 TNG67 高(圖 23)。由上述結果推論，SA1739 穎果在高溫下可以提升多元胺 之表現以減緩高溫逆境之傷害。
(七)其他與逆境反應相關之基因表現
MG (Methylglyoxal)是碳水化合物和脂肪代謝之副產物，為有力之突變 劑，且會和 DNA 與蛋白質反應，抑制細胞生長和抗氧化系統。Glyoxylase enzymes 與 GSH (glutathione)負責清除 MG，其中包含了 GLO1 (Glyoxylase
Ⅰ) 和 GLO2 (Glyoxylase Ⅱ)，該系統被視為細胞生長與分化指標。前人研 究發現在鹽害與滲透壓逆境下會提升 GLO1 之表現，並且認為 GLO1 可做 為耐鹽逆境之後選基因(Singla-Pareek et al., 2003; Yadav et al., 2005)。本研究 中，TNG67 與 SA1739 在常溫下 GLO1 在 6~15 DAF 隨發育而上升，隨後下 降。高溫下 TNG67 之 GLO1 的表現受抑制且隨發育而下降；SA1739 之 GLO1 則在 6 DAF 表現略較常溫高，9 DAF 與常溫類似，隨後則受到抑制(圖 24)。由此可見高溫下皆會降低去除 MG 之能力，影響細胞之生長，但 SA1739
早期相較於 TNG67 可能有較好之解毒能力。
RAB24 屬抗氧化系統裡 peroxiredoxin 的一類，可以保護脂肪、酵素與 DAN 避免氧化逆境傷害(Lee et al., 2000; Haslekas et al., 2003)。在本實驗室先 前之研究已知高溫會使 RAB24 基因提前表現及使其蛋白質累積(Lin et al., 2010)。在本試驗材料 TNG67 與 SA1739 之 RAB24 在常溫下皆隨發育階段而 提高表現量。高溫下在 TNG67 亦是隨發育而提升表現，但在 6~15 DAF 階
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段表現量較常溫高，雖然 SA1739 高溫下 RAB24 亦是隨發育而提升，但僅 在 9 DAF 較常溫高。且 TNG67 的 RAB24 表現之幅度皆較 SA1739 高(圖 24)。
推測 TNG67 於高溫下其穎果內的氧化逆境氧化逆境較 SA1739 嚴重，使其 RAB24 高溫下依舊持續表現。
在本研究室前人研究發現 HSP(heat shock protein)與白堊質粒有正相關 (Lin et al., 2005)，且高溫下使穎果內提升 16.9 kD HSP 表現(Lin et al., 2010)。
兩試驗材料之 16.9kD HSP 在常溫下隨發育階段而提升表現量，高溫處理下 TNG67 此基因表現量大幅提升。SA1739 在高溫下 6~15DAF 亦是表現量較 常溫高，但提升之幅度較 TNG67 低，至 20DAF 表現受到抑制(圖 24)。依此 結果推測高溫下 TNG67 遭受之傷害較嚴重，希望藉由提升 HSP 之表現來維 持細胞正常之功能。
高溫下會使水稻穎果充實前期到中期之 alanine 濃度提升(楊,2010)，且 在低氧環境下亦會促進 alanine 之累積(Reggiani et al., 1988; Rolletschek et al., 2004)。AlaAt(Alanine aminotransferase)為合成 alanine 之酵素，其受質為 pyruvate。本試驗兩試驗材料之 AlaAt 在常溫下隨發育而提高其表現量，高 溫下更促使其表現量提升(圖 24)，表示兩試驗材料在高溫逆境下穎果內部有 缺氧之現象。
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肆、結論
經 由 本 試 驗 結 果 顯 示 ， 利 用 疊 氮 化 鈉 處 理 TNG67 產 生 之 突 變 品 系 SA1739，使粒型變為長粒型。常溫下 SA1739 米質外觀無 TNG67 容易有腹白之 現象，而高溫下白堊質程度較輕微，且粒重減少程度小，是個耐高溫之品系。從 能量代謝相關基因表現與穎果 ATP 濃度結果，可以發現常溫下短粒型之 TNG67 穎果發育之有氧呼吸隨發育之進行，呈現逐漸降低而趨向無氧呼吸途徑之現象，
但長粒型之 SA1739 穎果在常溫下之 6~15 DAF 其內部尚可處在有氧呼吸之狀 態，自 15 DAF 後才走向無氧呼吸。此現象使常溫下 SA1739 穎果內部擁有較高 之 ATP 濃度，顯示粒型之改變已對穎果內部能量合成造成影響。
依本研究之結果，可歸納高溫下 SA1739 之耐熱機制(圖 26)，如下所示：
1. 高溫下雖然抑制有氧呼吸途徑，但大量誘導 PPDKA 使 PEP 走向 pyruvate，過程產生 ATP，並使 pyruvate 得以進入無氧呼吸相關途徑並 透過 ADH 供應穎果所需之能量。
2. 常溫與高溫下 ATP 濃度高峰發生時間一致，且其高溫與常溫最高 ATP 濃度變化差異小。且在乾物重累積最大速率時期穎果內部保有高 ATP 含量，使能量可有效分配給物質合成進而減少白堊質粒比例發生。
3. 穀粒之粒長、粒寬減少程度較小，粒厚增加，使穀粒體積減少程度較小，
粒重之下降幅度相對較少。
4. 白堊質主要是由蛋白質粒與澱粉粒堆疊不整齊，中間的空隙由空氣折色 產生之現象。SA7139 穎果膨大速度與乾物質累積得以同步，減少穎果 成熟後期脫水後穎果內部空隙之形成，可有利降低白堊質之形成。
5. 澱粉合成酵素 SSⅡa、 GBSS 高溫下抑制程度少及參與蛋白質摺疊之 PDI 表現量提升，減少高溫下粒重之損失及白堊質形成。
6. 早期可以誘導 SOD、CAT 之表現，將 superoxide radical (O2-．)、single oxygen (O2．)、hygroxyl radical ( OH．)，轉為毒性較弱之 H2O2，減緩
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穎果內部脂肪過氧化反應，而有較低之 MDA 含量。
7. 穎果內部參與多元胺合成之基因表現被提升，參與多元胺降解之 PAO 提升幅度較少，推測 SA1739 高溫下可有較高之多元胺含量減緩高溫逆 境之傷害。
8. ACO1 提升幅度較小、MDH 受到抑制，減緩高溫下乙烯之合成及胚乳 酸化程度。GLOⅠ表現量提升將可有利減緩高溫傷害維持細胞正常功 能。
依本試驗 TNG67 與 SA1739 初步之結果推斷，外觀具細長粒型之 SA1739 具有較好之能量利用效率，可能減緩高溫對穀粒充實之傷害，但是否代表其穎 果內部具有較高之含氧含量還需待實測該穎果內部氧含量才能驗證。本試驗之 水稻長粒型與短粒型品系對高溫之品質與生理反應之差異性的研究成果，將可 提供因應氣候暖化之耐熱性育種的理論基礎。
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伍、參考文獻
Blokhina O, Virolainen E, Fagerstedt Kv (2003) Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivation stress: a review. Ann Bot 91: 179-194
Borrás L, Westgate ME, Otegui ME (2003) Control of kernel weight and kernel water relations by post‐flowering source–sink ratio in maize. Ann Bot 91:
857-867
Bouché N, Fait A, Bouchez D, Møller SG, Fromm H (2003) Mitochondrial succinic-semialdehyde dehydrogenase of the γ-aminobutyrate shunt is required to restrict levels of reactive oxygen intermediates in plants. PNAS100:
6843-6848
Chastain C, Heck J, Colquhoun T, Voge D, Gu X-Y (2006) Posttranslational regulation of pyruvate, orthophosphate dikinase in developing rice (Oryza sativa) seeds. Planta 224: 924-934
Chomczynski P, Sacchi N (1987) Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal Biochem 162:
156-159
Chowdhury S, Wardlaw I (1978) The effect of temperature on kernel development
39
in cereals. Aust J Agric Res 29: 205-223
Dhindsa RS, Matowe W (1981) Drought tolerance in two mosses: correlated with enzymatic defence against lipid peroxidation. J Exp Bot 32: 79-91
Glaszmann JC (1987) Isozymes and classification of Asian rice varieties. Theor Appl Genet 74: 21-30
Hakata M, Kuroda M, Miyashita T, Yamaguchi T, Kojima M, Sakakibara H, Mitsui T, Yamakawa H (2012) Suppression of α-amylase genes improves quality of rice grain ripened under high temperature. Plant Biotech J 10:
1110-1117
Haslekas C, Viken MK, Grini PE, Nygaard V, Nordgard SH, Meza TJ, Aalen RB (2003) Seed 1-Cysteine peroxiredoxin antioxidants are not involved in dormancy, but contribute to inhibition of germination during stress. Plant Physiol 133: 1148-1157
Heath RL, Packer L (1968) Photoperoxidation in isolated chloroplasts. I. Kinetics and stoichiometry of fatty acid peroxidation. Arch Biochem Biophys 128:
189-198
Ishimaru T, Horigane AK, Ida M, Iwasawa N, San-oh YA, Nakazono M, Nishizawa NK, Masumura T, Kondo M, Yoshida M (2009) Formation of grain chalkiness and changes in water distribution in developing rice caryopses grown under high-temperature stress. J Cereal Sci 50: 166-174
Ishimaru T, Matsuda T, Ohsugi R, Yamagishi T (2003) Morphological development of rice caryopses located at the different positions in a panicle from early to middle stage of grain filling. Funct Plant Biol 30: 1139-1149 Jana S, Choudhuri MA (1982) Glycolate metabolism of three submersed aquatic
angiosperms during ageing. Aquatic Botany 12: 345-354
Kang H-G, Park S, Matsuoka M, An G (2005) White-core endosperm floury endosperm-4 in rice is generated by knockout mutations in the C4-type pyruvate orthophosphate dikinase gene (OsPPDKB). Plant J 42: 901-911 Kim S, Kim S, Wang Y, Yu S, Choi I, Kim Y, Kim W, Agrawal G, Rakwal R,
Kang K (2011) The RNase activity of rice probenazole-induced protein1 (PBZ1) plays a key role in cell death in plants. Mol Cells 31: 25-31
Kim ST, Kim SG, Kang YH, Wang Y, Kim J-Y, Yi N, Kim J-K, Rakwal R, Koh H-J, Kang KY (2008) Proteomics analysis of rice lesion mimic mutant (spl1) reveals tightly localized probenazole-induced protein (PBZ1) in cells undergoing programmed cell death. J Proteome Res 7: 1750-1760
Kim YJ, Yeu SY, Park BS, Koh H-J, Song JT, Seo HS (2012) Protein disulfide isomerase-like protein 1-1 controls endosperm development through regulation of the amount and composition of seed proteins in rice. PLoS One 7:
40
e44493
Krochko JE, Winner WE, Bewley JD (1979) Respiration in relation to adenosine triphosphate content during desiccation and rehydration of a desiccation-tolerant and a desiccation-intolerant moss. Plant Physiol 64: 13-17 Lee K-O, Jang H-H, Jung B-G, Chi Y-H, Lee J-Y, Choi Y-O, Lee J-R, Lim C-O,
Cho M-J, Lee S-Y (2000) Rice 1Cys-peroxiredoxin over-expressed in transgenic tobacco does not maintain dormancy but enhances antioxidant activity. FEBS Lett 486: 103-106
Liang Y-L, Lur H-S (2002) Conjugated and free polyamine levels in normal and aborting maize kernels. Crop Sci 42: 1217-1224
Liao J-L, Zhang H-Y, Liu J-B, Zhong P-A, Huang Y-J (2012) Identification of candidate genes related to rice grain weight under high-temperature stress.
Plant Science 196: 32-43
Lin C-J, Li C-Y, Lin S-K, Yang F-H, Huang J-J, Liu Y-H, Lur H-S (2010) Influence of High Temperature during Grain Filling on the Accumulation of Storage Proteins and Grain Quality in Rice (Oryza sativa L.). J Agric Food
Lin C-J, Li C-Y, Lin S-K, Yang F-H, Huang J-J, Liu Y-H, Lur H-S (2010) Influence of High Temperature during Grain Filling on the Accumulation of Storage Proteins and Grain Quality in Rice (Oryza sativa L.). J Agric Food