在常溫下 6~9 DAF 有最大 ATP 濃度,之後隨發育階段而下降;高溫下則在 6 DAF 有最高 ATP 濃度,9 DAF 時還可以維持與常溫的水平,至 15 DAF 濃度急速下降。兩試驗材料比較下,SA1739 較 TNG67 有較高之 ATP 濃度。
She 等人 (2010) 研究發現耐高溫之品種 Kinmaze,高溫下粒重減少程度 低,且穀粒大小及粒型變化小,其發育階段穎果內部 ATP 含量常溫下 10 DAF 達最高峰,而在高溫 10 DAF 亦可維持常溫下之表現量,反觀在 flo2 mutant EM37 在高溫下粒重減少嚴重,其高溫下雖 ATP 下降緩慢,但於高溫下 7DAF 的 ATP 含量無法維持常溫下之狀態,可見 ATP 含量之維持與耐高溫有關。
而在本試驗材料的 SA1739 粒重變化與 ATP 表現模式,可符合 She 等人 (2010)的結果。
另在 She 等人 (2012)的試驗材料其大部分發育中水稻穎果 ATP 濃度有 2 個高峰期,而高溫下會使第 2 個高峰提前表現像皆較常溫低,且高溫與常 溫第 2 高峰之 ATP 濃度比與高溫下完整米粒有正相關。在本試驗材料中,
皆只有一個高峰期,且高溫下亦有提前表現之現象。比較高溫下與常溫高峰
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期 ATP 濃度之比例,TNG67 僅 79 %而 SA1739 則為 107 %,對應高溫下完 整米粒比率,TNG67 高溫下無完整米粒,而 SA1739 尚有 2.6 %之完整米粒。
若以完整米粒加 Chalky < 25 %之比例,高溫下 TNG67 為 0 %,而 SA1739 有 80%。
另由圖 2C 已得知 TNG67 高溫下 6~9 DAF 為乾物重累積速率最快時 期,但此時其穎果內 ATP 濃度已下降,至 20 DAF 有最大乾物重,此時 ATP 已達最低濃度。SA1739 高溫下 6~9 DAF 為乾重累積最快時期,穎果內部有 最高之 ATP 濃度,至 15DAF 有最大乾物重,ATP 濃度也已迅速下降。
由以上結果顯示,SA1739 不僅在高溫下可以維持 ATP 濃度高峰期之時 間點亦可減少與常溫 ATP 高峰之濃度差異,並且能在穎果有最大 ATP 濃度 時大量累積乾物質,顯示 SA1739 可以有效地利用能量,避免能量之浪費。
穀粒內大分子物質之合成皆需消耗能量,澱粉合成相關基因 SSⅡa 及 GBSS,在 TNG67 及 SA1739 兩個試驗材料中,常溫下隨發育階段表現量逐
漸增加,於 15 DAF 大量表現,但 SA1739 表現量在 15 DAF 達高峰後下降(圖 12)。由先前兩試驗材料之 ATP 含量(圖 9)及乾物重累積(圖 2A)可發現,澱
粉合成大量表現與乾物重持續累積,但此時穎果內部 ATP 濃度皆處於較低 之狀態,表示常溫下此生育時期之澱粉合成所需之能量消耗較低。
觀察兩試驗材料高溫下澱粉合成與儲藏性蛋白質基因表現(圖 13),在高 溫下皆受到抑制,由其以 TNG67 抑制較嚴重。TNG67 及 SA1739 在高溫下 Porlamine 7、Glutaline、19kD Globulin 在穀粒充實早期表現量提升,但在 15 DAF 之後表現量下降,其中以 SA1739 高溫下抑制量較多。水稻穎果有 80%以上組成分為澱粉,故澱粉為影響粒重主要之因素,對照基因表現與成 熟穀粒重(圖 2C)之結果,推測 TNG67 高溫下粒重下降之主要原因來自於澱 粉合成基因抑制所導致。
在 Micorarray 的結果裡(圖 25),針對澱粉合成途徑中,高溫下誘導
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SA1739 的 sucrose synthase(Os04g0309600 及 Os030g401300)、ADP-glucose transporter(Os05g0171300)、ADPase(Os05g0580000 及 Os07g0243200)、starch branching enzyme(Os06g0726400)、soluble starch synthase(Os06g0160700)。
在澱粉降解層面,前人研究裡發現高溫逆境誘導水稻穎果內 Amy1A, Amy1C, Amy3A, Amy3D 及 Amy3E 的表現(Hakata et al., 2012)。而在本試驗結果裡高
溫下也誘導了兩試驗材料的 Amy3D 及 Amy3E,但 TNG67 在 9 DAF 誘導 Amy3D;SA1739 則到 12 DAF 才誘導 Amy3D 表現。兩試驗材料的 Amy3E
在高溫下 6、9 DAF 皆被誘導,但 SA1739 到 12 DAF 其表現量受到抑制。
綜觀澱粉之合成代謝表現,SA1739 在高溫下較 TNG67 有利於進行澱粉合 成。
生物的能量代可由(1)有氧呼吸:糖解作用進入檸檬酸循環再由粒線體 之 oxidative phosporylation 產生 ATP;(2)無氧呼吸:由糖解作用最後之產物 pyruvate 走向酒精發酵途徑產生較少量之 ATP。
TNG67 常溫下參與糖解作用之 PFK 在 6~15 DAF 表現量上升隨後下 降,而 G3PDH 則是隨發育天數持續上升,PK 在 6~9 DAF 下降隨後又上升 (圖 14)。但在檸檬酸循環之 IDH 在 6~9 DAF 下降隨後上升,而 SUSB 與 MDH 則隨發育天數表現量下降(圖 15),參與 oxidative phosphorylation 之 ATPSB 在 15 DAF 有些微上升,但整體趨勢是隨發育天數下降,而參與無氧呼吸之 ADH 則是自 9 DAF~15 DAF 表現量上升(圖 16)。由以上現象可發現,雖然
糖解作用在發育中後期還持續表現,但由 PK 所產生之 pyruvate 在穎果發育 中並無法走進檸檬循環進而走向 oxidative phosphorylation,取而代之是走入 無氧呼吸之途徑,表示 TNG67 常溫下穎果發育過程是走向低氧之過程,與 前人研究結果是相同(Xu et al., 2008)。
SA1739 常溫下參與糖解作用之 PFK 在 6~9 DAF 表現量些微下降,自 15DAF 表現量達最高峰,隨後下降,而 G3PDH 與 PK 則是 6~15 DAF 持續
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上升隨後下降(圖 14)。在檸檬酸循環之 IDH 隨發育天數持續上升,而 SUSB 與 MDH 則在 15DAF 表現量下降(圖 15),參與 oxidative phosphorylation 之 ATPSB 在 15 DAF 後下降,而參與無氧呼吸之 ADH 則是自 9 DAF~15 DAF
表現量上升(圖 16)。由以上現象可知 SA1739 常溫下自 15 DAF 以前可藉由 糖解作用、檸檬酸循環與 oxidative phosphorylayion 產生能量,15 DAF 以後 則是藉由無氧呼吸維持後續之能量。
由於在大麥、玉米種子內發現氧濃度越靠近種子內部,氧濃度逐漸下降 (Rolletschek et al., 2004; Rolletschek et al., 2005)。常溫下兩試驗材料能量之走 向可推測,SA1739 比起 TNG67 可維持穎果內發育前 15 天有較多之氧含量,
可能因 SA1739 有較細長之粒型以利氧氣之擴散有關,但還需進一步的驗證 使得知。另對照先前澱粉合成基因表現、ATP 濃度與乾物重累積結果,澱粉 合成除可需較少之能量也能適應低氧之環境。
TNG67 高溫下參與糖解作用之 PFK 趨勢與常溫同,但在發育早期表現 量較常溫提升,到 15、20 DAF 表現量受抑制。而高溫下 G3PDH 表現量都 受到抑制,PK 則只在 9 DAF 表現量較常溫高,但趨勢是 6~15 DAF 隨發育 而提升,到 20 DAF 開始下降。而參與檸檬酸循環之 IDH、SUSB 及 MDH 高溫下的表現量接受到抑制,而 ATPSB 亦是受到抑制,反觀在參與無氧呼 吸的 ADH 高溫下表現量提升,且隨發育階段上昇,這表示糖解作用最後的 產物 pyruvate 在高溫下趨向走入無氧呼吸,表示 TNG67 高溫下穎果內部有 缺氧之現象。
SA1739 高溫下參與糖解作用之 PFK、G3PDH 及 PK 接受受到抑制,而 檸檬酸循環中的 IDH、SUSB 及 MDH 亦受到抑制,而 ATPSB 亦受到抑制,
但 ADH 卻大量表現,表示高溫下 SA1739 穎果內部亦是缺氧之現象,且依 靠無氧呼吸維持穎果內部所需之能量。
值得注意的是,PK 是將 PEP 轉為 pyruvate,pyruvate 經由 pyruvate
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decarboxylase 轉為 acetoaldehyde 再經由 ADH 轉為 ethenol。但 SA1739 高溫 下的 PK 相較常溫下之表現受到抑制,進入無氧呼吸所需 pyruvate 由此推定 應不是透過 PK 所提供。PPDK (pyruvate phosphate dikinase)是可以扮演 PK 之功能將 PEP 轉為 pyruvate,產生 ATP;亦可將 pyruvate 轉為 PEP,消耗 ATP 和 Pi 產生 AMP 及 PPi。隨著水稻穎果發育,PPDK 表現量下降(Chastain et al., 2006; Xu et al., 2008),在穎果發育早期的調控是傾向將 PEP 轉為 PK(Chastain et al., 2006)。水稻有 3 種類型之 PPDK 基因,分別為在細胞質 內(cytosolic type)的 OsPPDKA 和 cyOsPPDKB,在葉綠體內之 chOsPPDKB。
在 T-DNA 插入造成 OsPPDKB 缺陷之水稻突變株,穀粒外觀呈現心白之現 象(Kang et al., 2005),表示 PPDK 扮演著胚乳內物質累積之調控角色。細胞 質內之 PPDK 調控代謝合成途徑:(1)將 pyruvate 轉為 PEP,在細胞質中產 生之 PPi 為誘導澱粉合成中之 sucrose sythase 之訊號,有利澱粉之合成;(2) 由於 pyruvate 為碳、氮代謝與脂肪合成之轉折點,PPDK 若將 PEP 轉為 pyruvate 增加細胞質內之 pyruvte 含量,有利於使之轉為有機酸之合成,如 Ala 及 Glu,或是走向於脂肪酸之合成。(3)PPDK 會由低氧所誘導(Moons et al., 1998),種子發育過程中是低氧之環境(Rolletschek et al., 2004),PPDK 若走 向將 PEP 轉為 pyruvate 之途徑可以產生 ATP,將使缺氧之組織有利產生能 量。
在 DNA microarray 的結果發現,高溫下誘導 SA1739 在 6 DAF 的 OsPPDKB 表現(圖 25)。在水稻 OsPPDKB 突變體裡,沒有 OsPPDKB 轉譯
及 OsPPDKB 蛋白質,但伴隨有外觀呈現心白、粒重下降、蛋白質及脂肪含 量提高之現象,表示 OsPPDKB 的缺失使 pruvate 走向脂肪的合成(Kang et al., 2005)。在不耐熱的水稻品種裡,高溫下抑制 OsPPDKB 的表現,外觀有白 堊質 現象(Yamakawa et al., 2007)。而本試驗中高溫下誘導 SA1739 的 OsPPDKB 表現,推測此現象將有利於 pruvate 走向 PEP,產生 PPi 做為誘導
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sucorse synthase 之訊號進而促高溫早期的進澱粉合成。
TNG67 和 SA1739 常溫下 PPDKA 之表現隨穎果發育而提升,符合 PPDK 由低氧所誘導之現象(圖 16)。而高溫下 PPDKA 之表現被提昇,尤其以 SA1739 在 9DAF 大量表現,推測在高溫下有氧呼吸被抑制之情況下,PPDKA 將 PEP 轉為 pyruvate,產生 ATP 並使 pyruvate 得以進入無氧呼吸產生能量。
此外,生物體內之糖解作用、檸檬酸循環及 oxidative phosphorylation 皆 會受到 ATP、NADH、ADP 及 AMP 之調控。當 ATP、NADH 足夠時時會抑 制有氧呼吸途徑;而高 ADP 及 AMP 則會促進有氧呼吸之途徑產生能量。
依本研究上述結果推論,高溫下穎果內之糖解作用在 SA1739 受到抑制較嚴 重,對照穎果 ATP 濃度結果,可能對於 SA1739 而言細胞內所含之能量已足 夠,而對於 TNG67 而言是有能量不足之現象。SA1739 在高溫 6 DAF 能量 尚處最高值時藉由 OsPPDKB 的表現促進早期之澱粉合成,到 9 DAF 之後仍 可透過提升 PPDKA 和 ADH 供應高溫下穎果發育所需之能量。
(四)TNG67 與 SA1739 穎果 MDA 含量與濃度差異及脂肪過氧化相關基因表 現
MDA(malondialdehyde)是不飽和脂肪酸氧化之二次產物,被做為脂肪過 氧化之指標。TNG67 常溫下之 MDA 含量 6~15 DAF 持續上升,隨後下降;
高溫下 6~9 DAF 含量提升,隨後下降。SA1739 常溫下 6~9 DAF 含量上升,
隨後下降;高溫下 6DAF 含量最高,9DAF 含量下降,隨後又略上升。就濃 度(n mole/FW)而言,TNG67 常溫下 6~9 DAF 濃度高,隨後下降;高溫下 MDA 濃度隨發育而下降,且濃度皆較常溫低。SA1739 亦有相同之趨勢,
但其 MDA 濃度皆較 TNG67 低(圖 17)。以上顯示高溫下會加速 TNG67 脂肪 過氧化現象,使穎果早期 MDA 含量提高,進而導致穎果內部氧化逆境之產 生,使 TNG67 在高溫下細胞死亡現象較為嚴重。
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在苔鮮的抗旱研究裡,具耐旱性的苔鮮其 SOD 與 catalase 的活性較 高,且 superoxide dismutase (SOD)與 catalase (CAT)的提升有助於 MDA 含量 之下降(Dhindsa and Matowe, 1981)。脂質過氧化反應表示細胞需要更多之氧
在苔鮮的抗旱研究裡,具耐旱性的苔鮮其 SOD 與 catalase 的活性較 高,且 superoxide dismutase (SOD)與 catalase (CAT)的提升有助於 MDA 含量 之下降(Dhindsa and Matowe, 1981)。脂質過氧化反應表示細胞需要更多之氧