*相對細胞生長速率(%)=(實驗組吸光值/控制組 (vehicle control，
DMSO) 吸光值)×100。
(A)
(B)
(C)
(D)
(E)
Fig 1. 比較化學小分子對 A549 肺癌細胞株反應之生長速率*。
圖(A)為 DB-001、002、003、004、006、012 及 013。
圖(B)為 MZ-01-056、057、061、062、067、069 及 075。
圖(C)為 SAC-01-16B、27A、27B、28A、32A、32B 及 42B。
圖(D)為 DJR-1-71、73、74、76、79、88 及 89S。
圖(E)為 SAC-01-49B、53B、DKB-112、113 及 114。
以 A549 作為篩選平台，分別以 5、10 及 20 μM 將待篩選藥物處 理 48 小時後，再以 MTT assay 檢測細胞的生長速率。圖(A)及(B)的 Bar 代表二次獨立實驗的結果，並計算標準誤差 (standard errors)。圖 (C)至(E)為一次獨立實驗的結果。
*相對細胞生長速率(%)= (實驗組吸光值/控制組 (vehicle control，
DMSO) 吸光值)×100。
Fig 2. 以 MTT assay 測試不同的化合物對 A549 肺癌細胞株的反應生 長速率。
以 A549 作為篩選平台，分別以 5、10 及 20 μM 將待篩選藥物處 理 48 小時後，再以 MTT assay 檢測細胞的生長速率。實驗分別以 A-007 及 DB-002 作為正控制組及負控制組。篩選出可以顯著降低細 胞生長速率的各項藥物。包括 MZ-01-059、DJR-1-77、SAC-01-46A、
MZ-01-078 及 MZ-01-081，於 20 μM 分別降低細胞生長速率約至 60%。Bar 代表三次獨立實驗的結果，並計算標準誤差。
Fig 3. 利用 MTT assay 檢測不同濃度 MZ-01-059 對 A549、H1299 及 H460 非小細胞肺癌的反應生長速率的變化。
MZ-01-059 分別以 5、10 及 20 μM 處理 A549、H1299 及 H460 細 胞株 48 小時後，再以 MTT assay 檢測細胞的生長速率。MZ-01-05922 對三種細胞株都會抑制細胞生長速率。A549 的 Bar 代表六次獨立實 驗的結果﹔H1299 及 H460 代表四次獨立實驗的結果，並計算標準誤 差。以 Paired t-test 計算 P 值，**P<0.01，***P<0.001。
(A)
(B)
Fig 4. 由群落形成試驗檢測 MZ-01-059 對非小細胞肺癌增生的影 響。圖(A) 細胞群落試驗結果，圖(B) 群落細胞面積統計圖
在 12 孔培養盤中，分別種入 200 個 A549、H1299 細胞及 1,000 個 H460 細胞 24 小時後，再以 5、10 及 20 μM 的 MZ-01-059 處理 48 小時後，移除培養基，再加入 5%的 FBS 培養六天之後，以 0.2% crystal violet 染色細胞群落。實驗結果顯示對三種細胞株的增生都受到影 響，且隨著濃度增加效果會益於明顯。Bar 代表二次獨立實驗的結果，
並計算標準誤差。圖(B)為相對細胞增生速率(%)= (實驗組群落面積/
控制組 (vehicle control，DMSO) 群落面積)×100。實驗以 Image-Pro Plus v4.5 (Media Cybernetics Inc.) 軟體分析群落面積，以 DMSO 做控 制組，換算成百分比。
(A) MZ-01-81 (n=2)
(B) SAC-01-46A
(C) DJR-1-77 (n=1)
(D) Ramesh-B008 (n=1)
Fig 5. 化合物不具有使非小細胞肺癌 sub G1細胞週期增加之效應。
圖(A)至(D)分別為 MZ-01-81、SAC-01-46A、DJR-1-77 及 Ramesh-B008。
圖(A)以 5、10 及 20 μM 對 A549 及 H460 細胞；圖(B)、(C)及(D) 以 2、5 及 10 μM 對 A549、H1299 及 H460 三種細胞反應 48 小時後，
收集細胞加入 PI 染色後，以流式細胞儀測試各細胞週期。MZ-01-81、
SAC-01-46A、DJR-1-77 及 Ramesh-B008 皆不會對非小細胞肺癌產生 細胞凋亡。圖(A)及(B)的 Bar 代表二次獨立實驗的結果，並計算標準 誤差。圖(C)及(D)為一次獨立實驗的結果。
A549
(A) 24 h (n=2)
(B) 36 h (n=2)
(C) 48 h (n=5)
Fig 6. MZ-01-059 會增加 A549 的 sub G1細胞數目，G0/G1細胞週期 降低。圖(A)至(C)分為 24、36 及 48 小時處理後的結果。
實驗以 2、5 及 10 μM，對 A549 細胞分別處理 24、36 及 48 小 時後，收集細胞加入 PI 染色後，以流式細胞儀測試各細胞週期的變 化，實驗以 DMSO 為控制組。實驗結果顯示 24 小時可使 G0/G1細胞 週期降低，而在 48 小時後 sub G1細胞週期開始增加。圖(A)及(B)的 Bar 代表二次獨立實驗的結果﹔圖(C)代表五次獨立實驗的結果，並計 算標準誤差。以 Paired t-test 計算 P 值，* P<0.05。
H1299
(A) 24 h (n=2)
(B) 36 h (n=2)
(C) 48 h (n=5)
Fig 7. MZ-01-059 使 H1299 的 S 及 G2/M 週期分佈比例增加。圖(A) 至(C)分為 24、36 及 48 小時處理後的結果。
實驗以 2、5 及 10 μM，對 H1299 細胞分別處理 24、36 及 48 小 時後，收集細胞加入 PI 染色後，以流式細胞儀測試各細胞週期的變 化，實驗以 DMSO 為控制組。實驗結果顯示 24 小時可使 S 期細胞數 目增加；48 小時則停滯於 G2/M 週期，但仍無法使 sub G1細胞數目增 加。圖(A)及(B)的 Bar 代表二次獨立實驗的結果﹔圖(C)代表五次獨立 實驗的結果，並計算標準誤差。以 Paired t-test 計算 P 值，** P<0.01。
H460
(A) 24 h (n=2)
(B) 36 h (n=2)
(C) 48 h (n=2)
Fig 8. MZ-01-059 增加 H460 的 sub G1細胞數目，G0/G1細胞週期降 低。圖(A)至(C)分別為 24、36 及 48 小時處理後的結果。
實驗以 2、5 及 10 μM，對 H460 細胞分別處理 24、36 及 48 小 時後，收集細胞加入 PI 染色後，以流式細胞儀測試各細胞週期的變 化，實驗以 DMSO 為控制組。實驗結果顯示在 24 小時，以 10 μM 處 理時 S 期增加；在 48 小時後 sub G1細胞數目上升，同時 G0/G1細胞 週期下降。圖(A)及(B)代表二次獨立實驗的結果﹔圖(C)代表五次獨立 實驗的結果，並計算標準誤差。以 Paired t-test 計算 P 值，* P<0.05。
Fig 9. MZ-01-059 對細胞凋亡的分析。
以 5 及 10 μM 的 MZ-01-059 對 H460 及 H1299 細胞反應 48 小時 後，再以 PI 及 Annexin V 進行雙染色後，以流式細胞儀測試細胞凋 亡及壞死。MZ-01-059 可使 H460 細胞株主要產生細胞凋亡 (包括第 二及第三象限)，以晚期細胞凋亡為主 (第三象限)，伴隨部分壞死細 胞 (第四象限)；H1299 細胞株沒有產生細胞凋亡。數據為一次獨立實 驗的結果。
(A)
(B) (C)
(D) (E)
(F)
Fig 10. MZ-01-059 在不同濃度對於非小型肺癌細胞的細胞凋亡相關 因子的影響。圖(A)為西方轉漬法分析圖；圖(B)至(F)分別為 p53、
PARP- cleaved、LC3 I、LC3 II 及 LC3-II/ LC3-I 比值量化圖。
以 5、10 及 20 μM 的 MZ-01-059 對 A549、H1299 及 H460 三株 細胞反應 48 小時後，萃取細胞蛋白質並取 20 μg 全蛋白進行西方轉 漬法，以 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 作為 loading control。一級抗體反應 18 至 40 小時後，加入二級抗體 goat-anti-rabbit 於室溫下反應 1 小時後，以 ECL 顯色。圖(B)至(F)為 圖(A)之蛋白質表現量作量化分析圖，其中 Y 軸為待測蛋白質量分別 與 GAPDH 蛋白量之比值﹔圖(F)為 LC3-II 和 LC3-I 的比值，表示 LC3-I 轉換成 LC3-II 的程度。
(A)
(B) (C)
(D) (E)
(F) (G)
Fig 11. MZ-01-059 在不同時間點對於非小型肺癌細胞的細胞凋亡相 關因子影響。圖(A)為西方轉漬法分析圖；圖(B)至(G)分別為 p53、
PARP- cleaved、caspase 3-cleaved、LC3 I、LC3 II 及 LC3-II/ LC3-I 比值的量化圖。
以 10 μM 的 MZ-01-059 對 A549、H1299 及 H460 三株細胞反應 48 及 72 小時後，萃取細胞蛋白質，並取 20 μg 全蛋白進行西方轉漬 法，實驗以 GAPDH 作為 loading control。一級抗體反應 18 至 40 小 時後，加入二級抗體 goat-anti-rabbit 於室溫下反應 1 小時後，以 ECL 顯色。圖(B)至(F)為圖(A)之蛋白質表現量作量化分析圖，Y 軸為待測 蛋白質量分別與 GAPDH 蛋白量之比值。其中圖(B)及(C)的 Bar 代表 三次獨立實驗的結果，並計算標準誤差。圖(G)為 LC3-II 和 LC3-I 的 比值，表示 LC3-I 轉換成 LC3-II 的程度。
目錄
玫瑰樹鹼對肺癌細胞誘導 Akt 及 p53 核移動及生長抑制
The induced p53 and Akt nuclear translocation and growth inhibition by ellipticine in human lung cancer cells
中文摘要
拓樸異構酶 II 抑制劑玫瑰樹鹼 (ellipticine) 為具有抑制癌細胞生 長的抗癌藥物，本實驗室過去研究指出藥物可經由活化 p53，使人類 非小細胞肺癌 A549 細胞株凋亡。本論文持續探討細胞生長因子 Akt 對於 p53 進入細胞核的影響，研究使用轉殖 p53 質體至 H1299 的穩 定細胞株 (HW16)。但當加入外源 Akt 會增加 ellipticine 對細胞生長 的抑制效應，並讓 sub G1週期細胞數目上升，而 Akt 及 p53 會被共同 誘導移入細胞核內，DNA 修補酶 PARP 也受到剪切。但將 AktS473位 點突變後，誘導產生的細胞凋亡會被抑制；而 AktT308位點突變後抑 制能力則較不明顯。Ellipticine 所引發的細胞凋亡也與細胞自噬的形 成有關，加入 Akt 後細胞內 LC3-I 轉換成 LC3-II 的比例增加，但當 AktS473位點突變後，所誘導的細胞自噬也會降低。因此本研究顯示 ellipticine 所誘導產生的細胞凋亡是與 Akt 及 p53 移動至細胞核及細 胞自噬形成有關，且 AktS473位點的磷酸化對於藥物引發的細胞凋亡 具有重要性。
關鍵字：玫瑰樹鹼, Akt, p53, 細胞凋亡, 細胞自噬
英文摘要
Topoisomerase II inhibitors, ellipticine and its analogues, were reported promising anticancer drugs due to its antineoplastic effects. Tumor suppressor p53 plays an important role in DNA damage-induced
apoptosis. The phosphatidylinositol 3-OH-kinase-Akt pathway inhibits p53-mediated transcription and apoptosis, while the Akt substrate MDM2, an ubiquitin ligase for p53, plays a pivotal role in regulation of the
stability of p53. Previously, we showed that ellipticine-induced cytotoxicity in non-small-cell-lung-cancer (NSCLC) was achieved through autophagy and apoptotic death as a result of Akt-modulation.
Nucleus translocation of p53 and Akt and recruitment of autophagosome were found in A549 cells. In this study, we further demonstrated that Akt-related cell death also occurred in p53-deficient cells with stable expression of exogenous p53 ( HW16). The cell death phenotype was ameliorated when transfected with dominant-negative AKTS473A construct.
On the other hand, the apoptotic phenotype was also be reverted by AktT308A with less dominant effect. Akt and p53 were both translocated into nucleus during apoptosis in ellipticine -treated HW16 cells. Our work demonstrated that Akt and p53 nuclear translocation are essential in elliptpcine- induced apoptosis in HW16 cells.
Keyword：Ellipticine, Akt, p53, apoptosis, autophagy
圖目錄
Fig 1. 轉殖 Akt 及位點突變 Akt 對 ellipticine 處理後 HW16 細胞生 長速率所生成的影響。... 90 Fig 2. 轉殖 Akt 及位點突變 Akt 對 ellipticine 處理後 HW16 細胞週
期所生成的影響。 ... 91 Fig 3. 以西方轉漬法檢測細胞凋亡相關蛋白質的變化。 ... 92 Fig 4. 以西方轉漬法檢測細胞自噬分子 LC3 蛋白質的變化。 ... 94
一. 緒論
1. 文獻評述
(1) 抗癌藥物 Topoisomerase II 抑制劑-玫瑰樹鹼 (ellipticine)
DNA 拓撲異構酶Ⅱ (DNA topoisomerase II) 能夠協助解開雙股 螺旋 DNA，完成細胞複製。由於它在癌細胞內的活性較一般正常細 胞為高 (Riou et al., 1986)，因此抑制癌細胞內的 topoisomerase II 活性 也是發展癌症化學藥物治療中的開發目標之一。於 1959 年時，法國 科學家首次從大洋洲一種常見的夾竹科玫瑰樹屬植物 Apocyanaceae 的葉子中，分離出一種具有簡單構造的生物鹼，並命名為玫瑰樹鹼 (5,11-dimethyl-6H-pyrido[4,3-b]carbazole, ellipticine) (Goodwin et al., 1959)。玫瑰樹鹼及其衍生物在臨床研究中發現皆有顯著的抗腫瘤功 能，在低濃度時即可以有效的使乳癌、大腸癌及肺癌等細胞停止生長 和死亡 (Stiborova et al., 2006)。
它可以做為 DNA 拓撲異構酶Ⅱ的抑制劑，藉由嵌入到 DNA 以
達到抑制腫瘤細胞增生的目的。由於分子體積及形狀與嘌呤-嘧啶互 補鹼基 (purine-pyrimidine complementary base pair) 相似，因此具有 與雙股 DNA 強力的嵌合能力，讓核酸斷裂 (Monnot et al., 1991)。
Ellipticine 可以經由調節 cyclin B1 和 Cdc2，使細胞週期停滯於 G2週 期，也可以誘導 Fas/Fas ligand 細胞凋亡機制，活化 Bcl-2 相關蛋白使 癌細胞凋亡 (Kuo et al., 2006)。此外，它也可以活化 p53，並進入到 細胞核內，轉錄出下游分子 p21 (Xu et al., 2008)。即使癌細胞內 p53 突變後，ellipticine 還是能夠活化野生型的 p53，執行細胞毒殺作用 (Peng et al., 2003)。然而現今 ellipticine 對於治療肺癌的功效瞭解不多。
(2) Akt 訊息傳遞路徑
Akt 是 serine/threonine protein kinase，它廣泛分佈於細胞質中，
而且具有 Akt1、Akt2 及 Akt3 三種異構型 (isoform)，它是由 N 端的 PH 結構區域 (pleckstrin homology domain)、中間的激酶活性區 (catalytic domain) 及 C 端的尾部 (regulatory domain) 三部分所構 成，為調節細胞存活的重要路徑之一(Brodbeck et al., 1999)。
當細胞於生長因子 (growth factor) 或胰島素 (insulin) 的刺激 下，會活化 RTK (receptor tyrosine kinases)，進而活化 PI3K
(phosphoinositide 3‑kinases) 的 p110 catalytic subunit，激活細胞質內 的 PIP2 (phosphatidylinositol‑4,5‑bis-phosphate) 轉換成 PIP3
(phosphatidylinositol‑3,4,5‑trisphosphate)。PIP3 再吸引 Akt 至細胞內 膜上，使其結構改變後露出兩個重要的磷酸化胺基酸位點。它們分別 是 Akt 的第 308 胺基酸蘇胺酸(Thr308)，它是由 PDPK1
(phosphoinositide-dependent kinase-1)磷酸化；而第 473 的位點絲胺酸 (Ser473)，則被 PDPK2 磷酸化，完全活化的 Akt 可進一步將訊息傳遞 至下游 (Alessi et al., 1996)。
當 Akt 活化後，會磷酸化 GSK3β (glycogen synthase kinase 3β) 上 的第 9 第九個位置絲胺酸後，可以抑制其活性，讓 cyclin D 穩定使細 胞週期持續 (Diehl et al., 1998)。它也可以活化 mTOR (mammalian target of rapamycin) 以調節蛋白質的合成、細胞生長與增殖等
(Vander Haar et al., 2007)。細胞內也具有負調控機制防止 Akt 繼續被 磷酸化，達成抑癌的目的。如 PTEN (phosphatase and tensin homolog)，
可以將 PIP3 去磷酸化形成 PIP2，抑制 Akt 再活化 (Tonks and Myers, 1999)。
在許多癌症中 Akt 是持續被活化，它包括活化下游 MDM2，以 抑制 p53 的活性；Akt 亦可抑制細胞凋亡相關的分子，如 Bad、Bax
在許多癌症中 Akt 是持續被活化，它包括活化下游 MDM2，以 抑制 p53 的活性；Akt 亦可抑制細胞凋亡相關的分子，如 Bad、Bax