(1) 藥物篩選模式
藥物篩選 (Drug screening) 是自大量化合物中選擇藥物對某一 特定作用標的 (target) 具有活性的調控。傳統上，大多數的藥物篩選 皆是經投藥後，透過觀察細胞或是動物的表現型態 (phenotype) 為主 要觀察目標。現今對藥物篩選要求實驗的設計，必須包括標準化和定 量化的步驟，目的希望在短時間內可以篩選大量藥物。另一則是藥物 標的 (drug target) 的選取，通常選擇具有特定與疾病相關的蛋白質，
如酶或受體等。此外一些特定 DNA 也成為藥物作用的標的。亦有些 是針對調控與疾病相關之基因表現的能力，所造成治療的效果，也可 以作為篩選藥物之標的 (Duin et al., 2003)。
目前篩藥模式主要是以人類致病基因的細胞株為主要方式。它是 藉由活細胞篩選藥物，可以瞭解化合物的活性以及反應機制。實驗是 將欲觀察之的藥物標的，細胞模式下進行藥物篩選，更能夠接近實際 之生理狀態。
篩選出之新藥的發展須通過三個階段才能夠供治療之用：它包括
臨床前試驗 (preclinical)、人體臨床試驗 (clinical trials) 及售後調 研。臨床前試驗完成後，須先提出研發新藥申請 (Investigational New Drug，IND)，才能開始進行人體臨床試驗。上市後則進入臨床實驗 第四階段，廠商仍需持續追蹤藥品於服用後的人體反應，瞭解長期使 用後出現的不良反應和遠期療效，才能對藥物提出確實療效評價數據 (Dickson and Gagnon, 2004)。
(2) 肺癌種類
世界各國因為肺癌的發病所造成死亡率急劇上升，台灣地區的發 病度較他國偏高，尤以女性及年輕男性患者增加最為顯著 (台灣癌症 防治網 http://cisc.twbbs.org/)。肺癌依其組織型態可分為小細胞肺癌 (small-cell lung cancer, SCLC) 以及非小細胞肺癌 (non-small-cell lung cancer, NSCLC) 兩大類。而肺癌約有 85%是屬於非小細胞肺癌，它 又可以分為三種亞型：鱗狀上皮細胞癌 (squamous cell carcinoma )：
肺癌約有 25%至 30%屬於這種類型。這種肺癌與吸煙有關，通常在
undifferentiated carcinoma)：肺癌約有 10%至 15%屬於這種類型，它 agents)、抗代謝藥物 (antimetabolites)、抗生素類 (antibiotics)、植物 生物鹼 (alkaloids)、固醇激素類藥物 (steroid hormones) 及其他抗癌 藥物。早期肺癌化療藥物有 methotrexate 及 cyclophosphamide 等 (Veronesi et al., 1988)，它們具有劇烈副作用，造成腎功能受損及嘔吐 等，對非小細胞肺癌的療效有限。1980 年代末期時，開始使用藥物
如 cisplatin、ifosfamide、mitomycin、vindesine 及 etoposide 等，這些 藥物在臨床上已被視為有效的化療藥物。其中 etoposide 是植物生物 鹼屬別之抗癌藥物，為一種半合成 podophyllotoxin 衍生物的是一種抗 腫瘤藥，它可以抑制攝護腺癌、淋巴癌及乳癌等 (Braybrooke et al., 2003) 的增生，此外 doxorubicin 對於抑制腦癌 (Acton et al., 1994) 及乳癌 (Kuo et al., 2005) 的轉移也有治療效果。
它的主要作用是與 DNA 及 topoisomerase II 形成三重之複合體，
造成 DNA 雙股斷裂，腫瘤細胞遺傳物質嚴重損壞，停滯於 G2 週期 或造成死亡 (Sengupta et al., 2000)。研究指出，etoposide 可以抑制 topoisomerase II α達到治療的效果，但同時也會抑制 topoisomerase II β，而有劇烈副作用，如掉髮、抑制骨隨細胞和急性骨髓性白血病等。
若能研發藥物傾向和 topoisomerase II α結合，就可以研發出降低 etoposide 的毒性，達到高療效、低副作用化療藥 (Wu et al., 2011)。
而 cisplatin (cis-diamminedichloridoplatinum(II), cis-DDP) 是一種含鉑 (Pt) 的烴基化劑類。
它是一個中性的方形平面分子；其中鉑-氯鍵結較鉑-氮鍵結來得 弱，反應時氯被其他官能基取代。cisplatin 進入體內後，一個氯緩慢 被水分子取代，形成[PtCl(H2O)(NH3)2]+，其中的水分子很容易脫 離，而鉑與 DNA 鹼基位點發生配位。然後另一個氯脫離， 鉑與 DNA 單鏈內兩點或雙鏈發生交叉聯結，抑制癌細胞的 DNA 複製，使細胞 凋亡 (Alderden et al., 2006)。基本上，cis -DDP 與 trans-DDP 具有相 似的生物性質；二者均可與細胞核染色體 DNA 分子發生共價結合，
可是 trans-DDP 卻沒有抗癌的功效，其副作用是嚴重的嘔吐、腎毒性 以及神經毒性。這些藥物在非小細胞肺癌雖然有很好的療效，但它們 對病人的高毒性，以致其使用劑量需要降低，但同時也會降低療效 (Hsieh et al., 2012)。目前經常使用之肺癌化療藥物如 gemcitabine、
paclitaxel、docetaxel 或 vinorelbine，搭配 cisplatin 的雙效療法
(doublets)，已經成為晚期或遠端轉移的非小細胞肺癌病人的主要療法 (Bunn, 2002)。而 paclitaxel (Taxol® ) 是屬於 taxans 類抗癌藥物，由十 分稀少且生長緩慢的太平洋紫杉醇 (Taxus brevifolia) 樹皮中提煉出 來。
它的之化學結構是為一複雜之 taxane 環，其第十三位碳原子位置 上連接著的酯化支鏈。最常見的副作用為急性過敏性休克，因為藥物 的水溶性極差，配置時須溶於稀釋於 cremophor EL 中，此溶劑容易 引起嚴重的過敏反應，而非藥物本身所導致，目前可用類固醇或抗組 織胺藥物做預防 (Entwistle et al., 2008)。paclitaxel 會和微管蛋白 (tublin) 作用抑制微管系統分解的有絲分裂的抑制劑，使細胞被固定 在分裂的過程中而死亡。此外還可以活化細胞凋亡的相關基因 p53、
p21，使細胞週期停滯在 G1/G2 期 (Giannakakou et al., 2001)。現在使 用藥物的雖然毒性較低，但多具有抗藥性降低療效，因此積極發展新 穎治療肺癌的藥物是有必要的。
(4) 腫瘤抑制基因 p53
腫瘤抑制基因 (tumor suppressor gene) 與抑制腫瘤細胞生成有 關。其中 p53 對於細胞遭受致命損傷時具有重要調節功能，故又稱為 保衛基因 (guardian of the genome) (Lane, 1992)。p53 在細胞中的表現 量都很低，也有很短的半衰期。它是一個 DNA 結合轉錄因子
(sequence-specific DNA binding transcription factor)。p53 主要分布在細 胞核內，每四個蛋白之間會結合位於碳端的聚合區基團成為具有活性 四聚體 (tetramer) (Tidow et al., 2007)。當細胞受到壓力時，p53 蛋白 的表現量會快速上升，並活化一系列下游基因的轉錄功能
(transcription)，如粒線體細胞凋亡路徑，以協助抑制癌細胞生長。p53 分別藉由細胞週期停滯 (cell cycle arrest)、細胞凋亡 (apoptosis)、細 胞衰老 (senescence)或是以 DNA 修補 (DNA repair) 等方式達到抑癌 目的 (Vogelstein et al., 2000)。
癌細胞之共同特性為細胞週期檢查點 (cell cycle check point) 失 去控制。當細胞受到損傷時，p53 會引發細胞週期的阻滯，而修復的 關鍵取決於所誘發下游基因 p21WAF1，它會讓細胞週期停滯在 G1期 (Harper et al. 1993)。p21 蛋白除了會抑制 cyclin-CDK 複合體外，也可 能抑制 Rb 蛋白的磷酸化，使得 E2F 蛋白的功能無法被活化，致使細 胞週期停滯在 G0/G1週期 (Slebos et al., 1994)。此外，當細胞遇到了 無法彌補的損害，p53 也可活化 Bax，影響粒線體外膜通透性，讓粒 線體釋放 cytochrome c，促使細胞凋亡。p53 也可以活化 Fas 及 CD95，
再進一步活化 caspase-8 等，執行與粒線體無關的細胞凋亡 (Sheikh and Fornace, 2000)。
(5) 細胞凋亡
細胞凋亡又稱第一型的細胞計畫性死亡 (type I program cell death)，其路徑主要有兩條：第一條是膜受體路徑 (death receptor pathway)，第二條是粒線體路徑 (mitochondrial pathway)。膜受體路徑 是讓 Fas ligand 會與細胞膜上的 Fas receptor 結合，活化細胞膜下 death domain，再結合 FADD (Fas associated death domain) 結合，FADD 又 會繼續結合 pro-caspase-8，切割 pro-caspase-8 成活化的 caspase-8，
caspase-8 則會再切割活化 pro-caspase-3 為 caspase-3，這種放大效應 的 caspase cascade 會讓細胞促進凋亡 (Liu et al., 1997)。PARP (poly ADP-ribose polymerase) 是細胞核內修復 DNA 的酵素，它的主要功能 為偵測單股 DNA 斷裂 (single-strand DNA breaks, SSB)，當它接上斷 裂位置後會引發修復機制。PARP 也是 caspase-3 的主要剪切目標，當 其被剪切後，羧基端的催化結構域 (85 kD) 和胺基端的 DNA 結合結 構域分離，使其失去活性，加速細胞的不穩定(Andrabi et al, 2006)。
因此 PARP 的剪切被認為是細胞凋亡分子 caspase-3 啟動的指標。
粒線體的路徑是經由刺激促凋亡蛋白因子 (pro-apoptotic protein) 傳遞凋亡訊息。Bad 及 Bax 為促凋亡蛋白因子的一部分。在未受刺激 的情況下，14-3-3 蛋白質可以與 Bad 的絲胺酸磷酸化位置結合，抑制 細胞凋亡 (Masters et al., 2001)；而 Bcl-2 在沒有被活化的粒線體膜
上，會結合成 dimer (Giam M et al., 2008)。接收到凋亡訊號時，14-3-3 釋放出 Bad 後，再讓 Bad 以 dimer 型式結合活化，讓粒線體膜上形成 孔洞。膜上的 cytochrome c 從孔洞釋出，持續傳遞凋亡訊息。
cytochrome c 會和 apaf-1 及 ATP 結合，開始形成凋亡體 (apoptosome) (Purring-Koch and McLendon, 2000)，並吸引 pro-caspase-9，活化切割 出 caspase-9，再進一步活化 caspase-3，進而切割 PARP 後，使細胞 凋亡(Li et al., 1997)。
(macroautophagy)。它會藉合成具有雙層膜 (isolation membrane or phagophore) 構造之小體，將蛋白質或胞器包覆住，形成自噬體 (autophagosome)。而自噬體的外層膜會與溶體的膜融合形成自噬溶小 體 (autolysosome)，藉由溶體內水解酵素功能完成自噬 (Lee, 2009)。
其餘兩種分別是微小細胞自噬 (microautophagy)，藉由溶體的膜內凹 陷，將細胞質內的物質直接併入溶體中；以及伴侶蛋白媒介的自噬 (chaperone-mediated autophagy)，chaperone 先與細胞內的物質結合，
再進一步被溶體識別及吞入 ( Mizushima et al., 2008)。
細胞自噬的演化機制具有保守性的，所有生物都是以相同基因進 行細胞自噬，在酵母菌細胞及哺乳動物中稱為 Atg (AuTophaGy) (Klionsky et al., 2003)。當細胞營養不足時，細胞內 Akt/PKB 會先被 活化進而抑制 mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1) 的活性，使 Atg13 去磷酸化後與 Vps34、Beclin-1 (Atg6)、UVRAG (UV radiation resistance-associated gene protein) 及 Vps15 形成複合物，促 成細胞自噬合成雙層膜 (Maiuri et al., 2007)。形成自噬體的雙層磷脂 膜分成兩部分，它們分別為 ubiquitin-like conjugation 系統，它包括藉 由 Atg7 (E1 ubiquitin-activating enzyme) 以及 Atg10 (E2
ubiquitin-conjugating enzyme) 協助下，使 Atg12 與 Atg5 結合。另一 則為 LC3 (microtubule-associated protein light chain 3, MAP1-LC3)，它 是透過 Atg4、Atg7 (E1-like) 和 Atg3 (E2-like) 的協助，於碳基端接 合極性的磷脂酰乙醇胺 (phosphatidylethanolamine, PE)，讓 LC3-I 結 合形成脂性 LC3-II，LC3-II 會將雙層膜補齊形成自噬體
(autophagosome)，因此 LC3-II 的出現可做為自噬體主要的標記。
細胞自噬路徑圖 (Maiuri et al., 2007)
(7) 細胞自噬與細胞凋亡
由細胞自噬所誘發的細胞凋亡稱為細胞自噬性凋亡 (autophagic cell death) 或第二型的細胞計畫性死亡 (type-II program cell death) (Gozuacik and Kimchi, 2007)。相較於細胞凋亡，細胞自噬所造成的細 胞凋亡，其染色體沒有收縮與細胞核片段化的特徵，但在細胞質中卻 有大量的細胞自噬小體，並含有細胞的胞器(Edinger and Thompson, 2004)。
當細胞凋亡分子 Bcl-2 家族中的兩個分子，包括 Bax 和 Bak 基因 被剔除 (double-knockout) 後，拓樸異構酶 II (topoisomerase II) 抑制 劑 etoposide 便無法逕使癌細胞產生細胞凋亡，但卻會引發細胞自噬，
再引起細胞凋亡。如再將細胞自噬分子 Beclin 1 及 Atg5 剔除後，則 會降低藥物引起的凋亡。實驗結果顯示，細胞自噬性凋亡不會活化細 胞凋亡分子 (Shimizu et al., 2004)。同樣癌細胞於缺乏營養的情況 下，會很快的引發細胞自噬，以回收胺基酸及脂質等。當其細胞自噬 分子被抑制，則會加速細胞活化 caspase，造成細胞凋亡
(Gonzalez-Polo et al., 2005)。細胞受到外來刺激時，細胞會選擇走向 細胞凋亡或是細胞自噬，細胞自噬使細胞在壓力下存活，但過度細胞 自噬卻會促進細胞凋亡。然而細胞也會同時發現細胞凋亡及細胞自噬
(Gonzalez-Polo et al., 2005)。細胞受到外來刺激時，細胞會選擇走向 細胞凋亡或是細胞自噬，細胞自噬使細胞在壓力下存活，但過度細胞 自噬卻會促進細胞凋亡。然而細胞也會同時發現細胞凋亡及細胞自噬