1. 抑制肺癌腫瘤細胞增生的新穎小分子藥物篩選及其反應機制2. 玫瑰樹鹼對肺癌細胞誘導Akt及p53核移動及生長抑制

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(1)國立臺灣師範大學生命科學系碩士論文. 一、抑制肺癌腫瘤細胞增生的新穎小分子藥物篩選及其反應機制 Identification of A Novel Small Molecule Compound That Induced Apoptotic Cell Death in Human Lung Cancer Adenocarcinoma Cells. 二.、玫瑰樹鹼對肺癌細胞誘導 Akt 及 p53 核移動及生長抑制 The induced p53 and Akt nuclear translocation and growth inhibition by ellipticine in human lung cancer cells. 研究生：游雅竹 Ya-Chu Yu. 指導教授：方剛博士 Kang Fang. 中華民國 102 年 2 月.

(2) 目錄英文摘要............................................................................................................................. 5 一.. 緒論 ........................................................................................................................ 7. 1.. 2. 二.. 文獻評述 ................................................................................................................ 7 (1). 藥物篩選模式.................................................................................................... 7. (2). 肺癌種類 ............................................................................................................ 8. (3). 臨床上治療肺癌藥物的發展........................................................................... 9. (4). 腫瘤抑制基因 p53 ............................................................................................. 9. (5). 細胞凋亡 .......................................................................................................... 14. (6). 細胞自噬 .......................................................................................................... 15. (7). 細胞自噬與細胞凋亡 ..................................................................................... 17. (8). 細胞自噬與癌症的發生 ................................................................................. 18 研究目標 .............................................................................................................. 20 材料與方法 .......................................................................................................... 21. 1.. 細胞培養 .............................................................................................................. 21. 2.. 小分子化學藥物.................................................................................................. 21. 3.. 細胞生長率分析.................................................................................................. 22. 4.. 群落形成測定 (colony forming assay) ............................................................... 23. 5.. 以 PI (propidium iodide)染色觀察細胞週期分布.............................................. 23. 6.. 以 PI 和 Annexin V 雙染色觀察細胞凋亡 ........................................................ 24. 7.. 蛋白質之萃取 ...................................................................................................... 25. 8.. 蛋白質定量 .......................................................................................................... 26. 9.. 西方轉漬法 .......................................................................................................... 26. 10. 統計 ...................................................................................................................... 28 三. 1.. 結果 ...................................................................................................................... 29 以 A549 肺癌細胞株進行細胞生長率試驗之篩檢 ......................................... 29 1.

(3) 2.. 由群落形成鑑定 MZ-01-059 可以抑制非小細胞肺癌的生長速率 ............... 30. 3.. MZ-01-059 使具有內生性 p53 非小細胞肺癌產生細胞凋亡 ........................ 30. 4.. 以西方轉漬法檢測 MZ-01-059 所引發細胞凋亡的路徑分子機轉 ............... 32. 四.. 討論 ...................................................................................................................... 34. 五.. 參考文獻 .............................................................................................................. 37. 六.. 圖........................................................................................................................... 44. 2.

(4) 抑制肺癌腫瘤細胞增生的新穎小分子藥物篩選及其反應機制. Identification of A Novel Small Molecule Compound That Induced Apoptotic Cell Death in Human Lung Cancer Adenocarcinoma Cells. 3.

(5) 中文摘要本論文使用肺癌細胞株為模式，自 42 個化學合成有機小分子，利用細胞生長速率測試 (MTT assay)，篩選出在低濃度下可以降低細胞生長速率之藥物。其中 oxazoline 衍生物 MZ-01-059 能夠有效在 5 μM 下降低 A549 細胞的生長速率。次由細胞群落分析證實 MZ-01-059 可以抑制癌細胞的增生。為了確認非小細胞肺癌的生長率下降是否與細胞凋亡相關，實驗再利用 propidium iodide 染色後 DNA，進行後流式細胞分析，觀察細胞週期變化。實驗結果顯示 MZ-01-059 會讓具有野生型 p53 之細胞株 A549 及 H460 產生細胞凋亡。其中以 H460 細胞株較為顯著；但對不具有 p53 之 H1299 細胞，則會停滯在 S 及 G2/M 週期。另由二維流式細胞儀分析結果，確立 H460 肺癌細胞主要是以晚期細胞凋亡 (late apoptosis) 方式降低細胞存活率。由西方轉漬法鑑定與細胞凋亡相關的蛋白，發現 MZ-01-059 處理後細胞，會活化腫瘤抑制基因 p53，此外也會使 pro-caspase-3 以及 poly ADP ribose polymerase 切割；而 LC3-II (microtubule-associated protein 1 light chain 3) 在 A549 及 H1299 細胞株會增加，因此推斷這兩種細胞是先以細胞自噬保護細胞，再產生細胞凋亡，證實這個藥物所引發細胞凋亡與細胞自噬相關。本論文結果也顯示 MZ-01-059 能夠在低濃度下誘導活化在非小細胞肺癌引發不同程度的細胞凋亡，且與 p53 活化有關。關鍵字：藥物篩選、細胞凋亡、p53. 4.

(6) 英文摘要 The most common form of non-small-cell-lung-cancer (NSCLC) occurs among non-smokers in women. Because of the drug resistance, there is always a need to identify new therapeutic agents against this disease. Based on screening assay from the stock chemicals, we are identifying whether the oxazoline derivatives are potential cytotoxic drugs in human lung cancer epithelial cells through mononuclear cell direct cytotoxicity assay (MTT assay). After screening a total of more than 42 compounds, one of the synthetic chemicals (MZ-01-059), effectively suppressed growth in human adenocarcinoma in three lung cancer cell lines with different p53 genotypes, (A549 (p53+/+), H460 (p53+/+) and H1299 (p53-/-). The result was further confirmed by colony formation assay. However, the apoptotic death by (MZ-01-059) was detected only in A549 and H460 cells, but not in H1299 cells as measured by flow cytometry. The results indicated tumor suppressor p53 is essential for drug activity. In addition, MZ-01-059 activated caspase-3 and poly(ADP-ribose) polymerase cleavages in both A549 cells and H460 cells. The findings demonstrate that the candidate drug induces the anticancer effects through apoptotic cell death in A549 and H460 cells that is regulated by p53. Key words: Drug screen, apoptosis, p53. 5.

(7) 圖目錄 Table 1.篩選藥物在 A549 細胞的相對生長速率變化。 ........................... 41 Fig 1. 比較化學小分子對 A549 肺癌細胞株反應之生長速率。 ............. 42 Fig 2. 以 MTT assay 測試不同的化合物對 A549 肺癌細胞株的反應生長速率。 ........................................................................................................... 45 Fig 3. 利用 MTT assay 檢測不同濃度 MZ-01-059 對 A549、H1299 及 H460 非小細胞肺癌的反應生長速率的變化。 ..................................... 46 Fig 4. 由群落形成試驗檢測 MZ-01-059 對非小細胞肺癌增生的影響。 ....................................................................................................................... 47 Fig 5. 化合物不具有使非小細胞肺癌 sub G1 細胞週期增加之效應。 .. 48 Fig 6. MZ-01-059 會增加 A549 的 sub G1 細胞數目，G0/G1 細胞週期降低。 .......................................................................................................... 51 Fig 7. MZ-01-059 使 H1299 的 S 及 G2/M 週期分佈比例增加。 ........... 53 Fig 8. MZ-01-059 增加 H460 的 sub G1 細胞數目，G0/G1 細胞週期降低。 .......................................................................................................... 55 Fig 9. MZ-01-059 對細胞存活的鑑定。 .................................................... 57 Fig 10. MZ-01-059 在不同濃度對於非小型肺癌細胞的細胞凋亡相關因子的影響。 .......................................................................................... 58 Fig 11. MZ-01-059 在不同時間點對於非小型肺癌細胞的細胞凋亡相關因子的影響。 ...................................................................................... 60. 6.

(8) 一. 緒論. 1. 文獻評述. (1) 藥物篩選模式藥物篩選 (Drug screening) 是自大量化合物中選擇藥物對某一特定作用標的 (target) 具有活性的調控。傳統上，大多數的藥物篩選皆是經投藥後，透過觀察細胞或是動物的表現型態 (phenotype) 為主要觀察目標。現今對藥物篩選要求實驗的設計，必須包括標準化和定量化的步驟，目的希望在短時間內可以篩選大量藥物。另一則是藥物標的 (drug target) 的選取，通常選擇具有特定與疾病相關的蛋白質，如酶或受體等。此外一些特定 DNA 也成為藥物作用的標的。亦有些是針對調控與疾病相關之基因表現的能力，所造成治療的效果，也可以作為篩選藥物之標的 (Duin et al., 2003)。目前篩藥模式主要是以人類致病基因的細胞株為主要方式。它是藉由活細胞篩選藥物，可以瞭解化合物的活性以及反應機制。實驗是將欲觀察之的藥物標的，細胞模式下進行藥物篩選，更能夠接近實際之生理狀態。篩選出之新藥的發展須通過三個階段才能夠供治療之用：它包括 7.

(9) 臨床前試驗 (preclinical)、人體臨床試驗 (clinical trials) 及售後調研。臨床前試驗完成後，須先提出研發新藥申請 (Investigational New Drug，IND)，才能開始進行人體臨床試驗。上市後則進入臨床實驗第四階段，廠商仍需持續追蹤藥品於服用後的人體反應，瞭解長期使用後出現的不良反應和遠期療效，才能對藥物提出確實療效評價數據 (Dickson and Gagnon, 2004)。. (2) 肺癌種類世界各國因為肺癌的發病所造成死亡率急劇上升，台灣地區的發病度較他國偏高，尤以女性及年輕男性患者增加最為顯著 (台灣癌症防治網 http://cisc.twbbs.org/)。肺癌依其組織型態可分為小細胞肺癌 (small-cell lung cancer, SCLC) 以及非小細胞肺癌 (non-small-cell lung cancer, NSCLC) 兩大類。而肺癌約有 85%是屬於非小細胞肺癌，它又可以分為三種亞型：鱗狀上皮細胞癌 (squamous cell carcinoma )：肺癌約有 25%至 30%屬於這種類型。這種肺癌與吸煙有關，通常在肺部中央接近支氣管處發現。其二是腺癌 (adenocarcinoma)：這種類型約佔肺癌的 40%，通常在肺的外層部分發現，本研究採用的 A549 細胞株即歸屬於此類型肺癌，主要發生女性及沒有抽菸習慣者身上，且華人女性肺腺癌比西方國家多，可能與烹飪食物過程所產生之油煙污染、空氣污染及汽機車所排放廢氣有關。未分化大細胞癌 (large-cell 8.

(10) undifferentiated carcinoma)：肺癌約有 10%至 15%屬於這種類型，它可能發生在肺部的任何部位，此類型之癌症發展通常較快速及具高轉移力，因此治療也比較困難 (Baldi et al., 2011)。. (3) 臨床上治療肺癌藥物的發展通常早期肺癌沒有明顯症狀，僅有約 5 至 15%的病患可在早期發生時被檢驗出。大多數可以察覺到時，是因為肺癌細胞因為擴散所出現徵狀，而造成身體不適，或於胸部 X 光片檢查才意外發現已罹患癌症。肺癌細胞初期未擴散的患者，可以外科手術切除腫瘤，手術如切除不徹底或手術前未發現細胞已微小的移轉，容易引起癌症的復發。癌細胞擴散的病患，多以放射線治療合併化學治療以控制病情。放射線治療則著重於局部症狀控制，化學治療可控制全身性癌細胞。最單純的化學療法即是服用或以靜脈注射化學藥物，藉以摧毀目標細胞，阻止癌細胞進一步轉移。抗腫瘤藥物大致可分成六大類，包括烴基化劑 (alkylating agents)、抗代謝藥物 (antimetabolites)、抗生素類 (antibiotics)、植物生物鹼 (alkaloids)、固醇激素類藥物 (steroid hormones) 及其他抗癌藥物。早期肺癌化療藥物有 methotrexate 及 cyclophosphamide 等 (Veronesi et al., 1988)，它們具有劇烈副作用，造成腎功能受損及嘔吐等，對非小細胞肺癌的療效有限。1980 年代末期時，開始使用藥物 9.

(11) 如 cisplatin、ifosfamide、mitomycin、vindesine 及 etoposide 等，這些藥物在臨床上已被視為有效的化療藥物。其中 etoposide 是植物生物鹼屬別之抗癌藥物，為一種半合成 podophyllotoxin 衍生物的是一種抗腫瘤藥，它可以抑制攝護腺癌、淋巴癌及乳癌等 (Braybrooke et al., 2003) 的增生，此外 doxorubicin 對於抑制腦癌 (Acton et al., 1994) 及乳癌 (Kuo et al., 2005) 的轉移也有治療效果。. 它的主要作用是與 DNA 及 topoisomerase II 形成三重之複合體，造成 DNA 雙股斷裂，腫瘤細胞遺傳物質嚴重損壞，停滯於 G2 週期或造成死亡 (Sengupta et al., 2000)。研究指出，etoposide 可以抑制 topoisomerase II α達到治療的效果，但同時也會抑制 topoisomerase II β，而有劇烈副作用，如掉髮、抑制骨隨細胞和急性骨髓性白血病等。若能研發藥物傾向和 topoisomerase II α結合，就可以研發出降低 etoposide 的毒性，達到高療效、低副作用化療藥 (Wu et al., 2011)。而 cisplatin (cis-diamminedichloridoplatinum(II), cis-DDP) 是一種含鉑 (Pt) 的烴基化劑類。. 10.

(12) 它是一個中性的方形平面分子；其中鉑-氯鍵結較鉑-氮鍵結來得弱，反應時氯被其他官能基取代。cisplatin 進入體內後，一個氯緩慢被水分子取代，形成[PtCl(H2O)(NH3)2]+，其中的水分子很容易脫離，而鉑與 DNA 鹼基位點發生配位。然後另一個氯脫離，鉑與 DNA 單鏈內兩點或雙鏈發生交叉聯結，抑制癌細胞的 DNA 複製，使細胞凋亡 (Alderden et al., 2006)。基本上，cis -DDP 與 trans-DDP 具有相似的生物性質；二者均可與細胞核染色體 DNA 分子發生共價結合，可是 trans-DDP 卻沒有抗癌的功效，其副作用是嚴重的嘔吐、腎毒性以及神經毒性。這些藥物在非小細胞肺癌雖然有很好的療效，但它們對病人的高毒性，以致其使用劑量需要降低，但同時也會降低療效 (Hsieh et al., 2012)。目前經常使用之肺癌化療藥物如 gemcitabine、 paclitaxel、docetaxel 或 vinorelbine，搭配 cisplatin 的雙效療法 (doublets)，已經成為晚期或遠端轉移的非小細胞肺癌病人的主要療法 (Bunn, 2002)。而 paclitaxel (Taxol® ) 是屬於 taxans 類抗癌藥物，由十分稀少且生長緩慢的太平洋紫杉醇 (Taxus brevifolia) 樹皮中提煉出來。. 11.

(13) 它的之化學結構是為一複雜之 taxane 環，其第十三位碳原子位置上連接著的酯化支鏈。最常見的副作用為急性過敏性休克，因為藥物的水溶性極差，配置時須溶於稀釋於 cremophor EL 中，此溶劑容易引起嚴重的過敏反應，而非藥物本身所導致，目前可用類固醇或抗組織胺藥物做預防 (Entwistle et al., 2008)。paclitaxel 會和微管蛋白 (tublin) 作用抑制微管系統分解的有絲分裂的抑制劑，使細胞被固定在分裂的過程中而死亡。此外還可以活化細胞凋亡的相關基因 p53、 p21，使細胞週期停滯在 G1/G2 期 (Giannakakou et al., 2001)。現在使用藥物的雖然毒性較低，但多具有抗藥性降低療效，因此積極發展新穎治療肺癌的藥物是有必要的。 (4) 腫瘤抑制基因 p53 腫瘤抑制基因 (tumor suppressor gene) 與抑制腫瘤細胞生成有關。其中 p53 對於細胞遭受致命損傷時具有重要調節功能，故又稱為保衛基因 (guardian of the genome) (Lane, 1992)。p53 在細胞中的表現量都很低，也有很短的半衰期。它是一個 DNA 結合轉錄因子 12.

(14) (sequence-specific DNA binding transcription factor)。p53 主要分布在細胞核內，每四個蛋白之間會結合位於碳端的聚合區基團成為具有活性四聚體 (tetramer) (Tidow et al., 2007)。當細胞受到壓力時，p53 蛋白的表現量會快速上升，並活化一系列下游基因的轉錄功能 (transcription)，如粒線體細胞凋亡路徑，以協助抑制癌細胞生長。p53 分別藉由細胞週期停滯 (cell cycle arrest)、細胞凋亡 (apoptosis)、細胞衰老 (senescence)或是以 DNA 修補 (DNA repair) 等方式達到抑癌目的 (Vogelstein et al., 2000)。癌細胞之共同特性為細胞週期檢查點 (cell cycle check point) 失去控制。當細胞受到損傷時，p53 會引發細胞週期的阻滯，而修復的關鍵取決於所誘發下游基因 p21WAF1，它會讓細胞週期停滯在 G1 期 (Harper et al. 1993)。p21 蛋白除了會抑制 cyclin-CDK 複合體外，也可能抑制 Rb 蛋白的磷酸化，使得 E2F 蛋白的功能無法被活化，致使細胞週期停滯在 G0/G1 週期 (Slebos et al., 1994)。此外，當細胞遇到了無法彌補的損害，p53 也可活化 Bax，影響粒線體外膜通透性，讓粒線體釋放 cytochrome c，促使細胞凋亡。p53 也可以活化 Fas 及 CD95，再進一步活化 caspase-8 等，執行與粒線體無關的細胞凋亡 (Sheikh and Fornace, 2000)。. 13.

(15) (5) 細胞凋亡細胞凋亡又稱第一型的細胞計畫性死亡 (type I program cell death)，其路徑主要有兩條：第一條是膜受體路徑 (death receptor pathway)，第二條是粒線體路徑 (mitochondrial pathway)。膜受體路徑是讓 Fas ligand 會與細胞膜上的 Fas receptor 結合，活化細胞膜下 death domain，再結合 FADD (Fas associated death domain) 結合，FADD 又會繼續結合 pro-caspase-8，切割 pro-caspase-8 成活化的 caspase-8， caspase-8 則會再切割活化 pro-caspase-3 為 caspase-3，這種放大效應的 caspase cascade 會讓細胞促進凋亡 (Liu et al., 1997)。PARP (poly ADP-ribose polymerase) 是細胞核內修復 DNA 的酵素，它的主要功能為偵測單股 DNA 斷裂 (single-strand DNA breaks, SSB)，當它接上斷裂位置後會引發修復機制。PARP 也是 caspase-3 的主要剪切目標，當其被剪切後，羧基端的催化結構域 (85 kD) 和胺基端的 DNA 結合結構域分離，使其失去活性，加速細胞的不穩定(Andrabi et al, 2006)。因此 PARP 的剪切被認為是細胞凋亡分子 caspase-3 啟動的指標。粒線體的路徑是經由刺激促凋亡蛋白因子 (pro-apoptotic protein) 傳遞凋亡訊息。Bad 及 Bax 為促凋亡蛋白因子的一部分。在未受刺激的情況下，14-3-3 蛋白質可以與 Bad 的絲胺酸磷酸化位置結合，抑制細胞凋亡 (Masters et al., 2001)；而 Bcl-2 在沒有被活化的粒線體膜 14.

(16) 上，會結合成 dimer (Giam M et al., 2008)。接收到凋亡訊號時，14-3-3 釋放出 Bad 後，再讓 Bad 以 dimer 型式結合活化，讓粒線體膜上形成孔洞。膜上的 cytochrome c 從孔洞釋出，持續傳遞凋亡訊息。 cytochrome c 會和 apaf-1 及 ATP 結合，開始形成凋亡體 (apoptosome) (Purring-Koch and McLendon, 2000)，並吸引 pro-caspase-9，活化切割出 caspase-9，再進一步活化 caspase-3，進而切割 PARP 後，使細胞凋亡(Li et al., 1997)。. (6) 細胞自噬細胞自噬 (autophagy) 是細胞在逆境狀態下，物質再利用的過程。它是藉由溶體 (lysosome) 內水解酵素，將胞器或大分子蛋白質分解成小分子物質如胺基酸等，做為再回收的材料。目前細胞自噬已經被確認的有三種形式：第一種形式是巨大細胞自噬 (macroautophagy)。它會藉合成具有雙層膜 (isolation membrane or phagophore) 構造之小體，將蛋白質或胞器包覆住，形成自噬體 (autophagosome)。而自噬體的外層膜會與溶體的膜融合形成自噬溶小體 (autolysosome)，藉由溶體內水解酵素功能完成自噬 (Lee, 2009)。其餘兩種分別是微小細胞自噬 (microautophagy)，藉由溶體的膜內凹陷，將細胞質內的物質直接併入溶體中；以及伴侶蛋白媒介的自噬 (chaperone-mediated autophagy)，chaperone 先與細胞內的物質結合， 15.

(17) 再進一步被溶體識別及吞入 ( Mizushima et al., 2008)。細胞自噬的演化機制具有保守性的，所有生物都是以相同基因進行細胞自噬，在酵母菌細胞及哺乳動物中稱為 Atg (AuTophaGy) (Klionsky et al., 2003)。當細胞營養不足時，細胞內 Akt/PKB 會先被活化進而抑制 mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1) 的活性，使 Atg13 去磷酸化後與 Vps34、Beclin-1 (Atg6)、UVRAG (UV radiation resistance-associated gene protein) 及 Vps15 形成複合物，促成細胞自噬合成雙層膜 (Maiuri et al., 2007)。形成自噬體的雙層磷脂膜分成兩部分，它們分別為 ubiquitin-like conjugation 系統，它包括藉由 Atg7 (E1 ubiquitin-activating enzyme) 以及 Atg10 (E2 ubiquitin-conjugating enzyme) 協助下，使 Atg12 與 Atg5 結合。另一則為 LC3 (microtubule-associated protein light chain 3, MAP1-LC3)，它是透過 Atg4、Atg7 (E1-like) 和 Atg3 (E2-like) 的協助，於碳基端接合極性的磷脂酰乙醇胺 (phosphatidylethanolamine, PE)，讓 LC3-I 結合形成脂性 LC3-II，LC3-II 會將雙層膜補齊形成自噬體 (autophagosome)，因此 LC3-II 的出現可做為自噬體主要的標記。. 16.

(18) 細胞自噬路徑圖 (Maiuri et al., 2007). (7) 細胞自噬與細胞凋亡由細胞自噬所誘發的細胞凋亡稱為細胞自噬性凋亡 (autophagic cell death) 或第二型的細胞計畫性死亡 (type-II program cell death) (Gozuacik and Kimchi, 2007)。相較於細胞凋亡，細胞自噬所造成的細胞凋亡，其染色體沒有收縮與細胞核片段化的特徵，但在細胞質中卻有大量的細胞自噬小體，並含有細胞的胞器(Edinger and Thompson, 2004)。當細胞凋亡分子 Bcl-2 家族中的兩個分子，包括 Bax 和 Bak 基因被剔除 (double-knockout) 後，拓樸異構酶 II (topoisomerase II) 抑制劑 etoposide 便無法逕使癌細胞產生細胞凋亡，但卻會引發細胞自噬， 17.

(19) 再引起細胞凋亡。如再將細胞自噬分子 Beclin 1 及 Atg5 剔除後，則會降低藥物引起的凋亡。實驗結果顯示，細胞自噬性凋亡不會活化細胞凋亡分子 (Shimizu et al., 2004)。同樣癌細胞於缺乏營養的情況下，會很快的引發細胞自噬，以回收胺基酸及脂質等。當其細胞自噬分子被抑制，則會加速細胞活化 caspase，造成細胞凋亡 (Gonzalez-Polo et al., 2005)。細胞受到外來刺激時，細胞會選擇走向細胞凋亡或是細胞自噬，細胞自噬使細胞在壓力下存活，但過度細胞自噬卻會促進細胞凋亡。然而細胞也會同時發現細胞凋亡及細胞自噬 (Maiuri et al., 2007)。例如當致癌基因被活化時，會使 MDM2 受到抑制，而讓 p53 持續存在，同時活化下游 DRAM (damage-regulated autophagy modulator)，如此可以同時促進細胞自噬生成以及細胞凋亡，像這樣子的交互作用，也會降低細胞存活率(Crighton et al., 2006)。此外 Atg5 基因過量表現不僅促進細胞自噬，也加速了細胞凋亡。但是當這個基因被剔除後，同時也降低了細胞自噬及凋亡 (Yousefi et al., 2006)，因此細胞自噬基因 Atg5 被認為與膜受體路徑分子 FADD 結合之後，再活化 caspase，引發細胞凋亡 (Pyo et al., 2005)。. (8) 細胞自噬與癌症的發生癌細胞的快速增長會造成營養不足，腫瘤細胞可以藉由細胞自噬，降解大分子或胞器，讓細胞獲得營養，增加細胞存活率，降低細 18.

(20) 胞壞死 (necrosis) (Degenhardt et al., 2006)。前人研究顯示將人類癌細胞以 rapamycin 或 arsenic trioxide 處理後，會促進癌細胞自噬，以拮抗化學藥物的效應 (Fan et al., 2010; Smith et al., 2010)。因此抑制細胞自噬，可以增加癌細胞對化學藥物治療的敏感性，協助腫瘤生長的抑制 (Abedin et al., 2007)。有些藥物如 PI3K III 的抑制劑 3-methyladenine (3-MA) 及 H+ ATPase 抑制劑 chloroquine (CQ) 等能夠抑制細胞自噬。這類藥物可以抑制化學藥物治療時引發的細胞自噬，也會增進癌症治療的效果(Chen et al., 2010 )。持續活化細胞自噬，會降解細胞內的蛋白及胞器，也可以活化細胞凋亡訊號而加速凋亡，達到治療的效果 (Yang et al., 2011)。也有研究指出缺乏細胞凋亡分子的癌細胞與抗癌藥物 fenretinide 反應後，會造成癌細胞產生細胞自噬型的凋亡 (Fazi et al., 2008)。另活化細胞自噬的藥物，如 mTOR 抑制劑及活化 AMPK 藥物的 metformin，都可以抑制惡性腫瘤的轉移 (Evans et al., 2005)。因此暸解細胞自噬抑制或促進與癌症的效應，都可以有助於發展出對抗癌症的治療方式。由目前結果看來，細胞自噬可以維持癌細胞生存，也可以讓細胞凋亡，因此細胞自噬是否與細胞凋亡直接有關係，迄今沒有定論。. 19.

(21) 2. 研究目標儘管現今用於治療肺癌藥物很多，但多數藥物具有抗藥性以及強烈副作用，因此仍有必要研發新穎性抗癌藥物。本論文目的就是篩選於低濃度下，讓肺癌細胞產生凋亡的小分子化合物。期望從更多的化學合成物中，篩選出能夠發展可以在低劑量下可以治療非小細胞肺癌 (NSCLC) 的藥物。其最大目的即是不需使用高劑量，就可以達到治療的目的，減輕病人負擔，也可以降低治療成本。論文也初步探討藥物如何影響細胞內訊息傳遞之相關機轉。. 20.

(22) 二. 材料與方法. 1. 細胞培養非小細胞肺癌細胞株 A549 (p53+/+)、H1299 (p53-/-) 及 H460 (p53+/+) 來自於 American Type Tissue Collection (Rockville, MD)，其中 H460 和 H1299 是歸屬非小細胞肺癌中的未分化大細胞癌，而 A549 則是腺癌。三種細胞皆培養於添加 10%胎牛血清 (fetal bovine serum, FBS) 的 DMEM (Dulbecco’s modified Eagle medium) (GIBCO BRL, Grand Island, NY)培養液中，細胞平均每星期換兩次培養液，分別置於 37℃及 5%二氧化碳及飽和濕度的培養箱培養。細胞分盤則是先將培養液移除，以 PBS (phosphate-buffered saline) 清洗後使用 1mL 胰蛋白酶 (0.2% trypsin/EDTA) (Sigma, St.Louis, MO) 反應 5 分鐘後將細胞與培養盤分離，再利用細胞計數器算出所需數量後，再將細胞放置於新培養盤中。. 2. 小分子化學藥物將取自本校化學系實驗室製作的新合成化學分子溶於 DMSO (dimethyl sulfoxide) (Sigma, St.Louis, MO) 中，總濃度配置為 10 mM， 21.

(23) 每個藥物分裝成 100 μL，避光保存於-20℃冰箱中。以下為測試藥物之列表：. 3.. 細胞生長率分析取 1.5×103 個細胞，置於 96 孔盤中，以含有 5%的 FBS 培養約 24. 小時之後，移除培養液，將不同劑量之待測藥物溶於培養液中，控制組是以 DMSO 做為對照。實驗完成後將培養液移除，同時加入 80 µL 培養液以及 10 µL 的 5 mg/mL 的 MTT 試劑 (3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)，並置於培養箱。經過 3 小時之後再將 MTT 試劑移除，加入 100 µL 的 DMSO，放置 10 分鐘讓深藍色結晶溶解，以光電比色計 (microplate spectrophotometer) (BioTex, µQuant, Houston, TX) 於 540 nm 波長下讀取其吸光度。定義細胞生長速率(%)=(實驗組吸光值/控制組吸光值)× 22.

(24) 100。. 4. 群落形成測定 (colony forming assay) 分別種入 200 個 A549、H1299 細胞株及 1,000 個 H460 細胞於含 5%培養液的 12 孔培養盤，經 24 小時培養後，將移除培養液，加入含有不同濃度之藥物的培養液中，經過 48 小時之後，移除培養液，換成不含藥物之完整 5%的 FBS 培養液，期間約 2~3 天換一次培養液。經過 6 天後將培養液吸出，再以 50 µL 的 0.2% crystal violet 染色 5 至 10 分鐘後，以 PBS 將多餘染劑洗去後，拍照存檔。實驗以 Image-Pro Plus v4.5 (Media Cybernetics Inc.) 軟體分析群落面積，以 DMSO 作控制組，換算成百分比。. 5. 以 propidium iodide (PI)染色觀察細胞週期分布將 12 孔培養盤植入 2×105 細胞，以含有 5%的 FBS 培養約 24 小時之後，移除培養液，將不同劑量之待測藥物溶於培養液中，控制組是以 DMSO 做為對照。經 48 小時之後，取出細胞培養液至 15 mL 離心管，再以 PBS 清洗細胞兩次，沖洗過後的 PBS 亦回收至離心管。而其餘貼附細胞則加入 200 μL 胰蛋白酶，於室溫下輕輕搖晃 5 分鐘，用 1 mL 的 PBS 將貼附細胞全部取下後，以 1,300 rpm 離心 5 分鐘。傾倒上清液，再以 1 mL 的 PBS 打散細胞後，以 1,300 rpm 離心 5 分 23.

(25) 鐘沖洗細胞兩次後，再清除上清液，加入 0.5 mL 溶於 PBS 的 70%酒精固定細胞，混合均勻放置於-20℃約 18 小時。將細胞取出離心 1,300 rpm 後倒掉上清液，再以 1 mL PBS 清洗兩次，將上清液清除後，加入含有 5 μg/mL 碘化丙啶 (propidium iodide, PI) (Sigma, St.Louis, MO) 及 20 mg/mL RNase A (ICN Pharmaceutical, Costa Mesa, CA) 的 1 mL PBS 於室溫下避光 30 分鐘，使用 150 目的篩網過篩細胞。以流式細胞分析儀 ( FACScan flow cytometry ) (Becton-Dickson, Mansfield, MA) 偵測細胞中 PI 的螢光強度 (激發光源波長：488 nm) 。實驗結果利用 Modfit LT Ver 2.0 分析軟體 (Becton-Dickson, Mansfield, MA)，計算各週期所佔細胞的比例分析作圖。估算各個細胞內 DNA 的含量，以判別細胞週期的各個階段：實驗定義小於 2N 為 sub G1 期，2N 為 G0/G1 期，4N 為 G2/M 期，2N 到 4N 為 S 期。 6. 以 PI 和 Annexin V 雙染色觀察細胞凋亡將 12 孔培養盤分別植入 2×105 細胞，培養於含有 5%的 FBS 的 DMEM 培養 24 小時後，以 5 及 10 μM 之藥物處理 48 小時後，取出細胞培養液至 15 mL 離心管，並以 PBS 清洗細胞兩次。沖洗過後的 PBS 亦回收至離心管。而其餘貼附細胞則加入 200 μL 胰蛋白酶，於室溫下輕輕搖晃 5 分鐘，用 1 mL 的 PBS 將貼附細胞全部取下，以 1,000 rpm 離心 5 分鐘後，傾倒上清液，再以 1 mL 的 PBS 打散細胞 24.

(26) 後，以 1,000 rpm 離心 5 分鐘來沖洗細胞，將上清液倒掉。最後加入含有 0.5 μL PI (50 μg/mL) 及 0.5 μL Annexin V FITC (20 μg/mL) 的 100 μL 1×Annexin V binding buffer，於室溫下避光靜置 30 分鐘。再加入 400 μL binding buffer 後，以流式細胞分析儀偵測細胞凋亡分布，並利用 WinMDI 2.9 (Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry) (Becton-Dickson, Mansfield, MA) 分析軟體，計算細胞凋亡及壞死所佔細胞的比例。定義左下角為第一象限代表存活的細胞 (viable cells)；右下角第二象限代表早期細胞凋亡 (early apoptosis)；右上角第三象限代表晚期細胞凋亡 (late apoptosis) ; 左上角第四象限代表細胞壞死。. 7. 蛋白質之萃取將 12 孔培養盤植入 2×105 細胞培養於 5% FBS 中，經藥物處理 48 小時時間後，先移除培養液，細胞以 PBS 清洗二次後，加入 40 μL 含有蛋白酶抑制劑 (protease inhibitor) 的 RIPA 緩衝液 (1% Triton x-100, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% NP-40, 20 mM sodium phosphate, 1% protease inhibitor)，置於 4℃溶解細胞 5 至 10 分鐘之後，使用細胞刮取器 (scraper) 取下所有的細胞溶解液，以 13,000 rpm 的速度離心細胞溶液 20 分鐘兩次，離心後吸取出上清液另置於新的微量離心管內，從中取出 2 μL 進行蛋白質定量，其餘蛋白質則分裝 25.

(27) 後保存置於-20℃。. 8. 蛋白質定量利用考馬斯蘭法 (Bradford method) 原理。實驗於 96 孔培養盤中各孔加入 296 μL 考馬斯蘭 (Bio-Rad protein assay, Coomassie® Brilliant Blue G-250 dye, CBB)。將原始濃度 2,000 μg/mL 的 BSA 血清蛋白 (bovine serum albumin) (Albumin Standard)，依序以 PBS 等倍稀釋成 1000、500、250、125 及 62.5 μg/mL，作為蛋白質定量之標準曲線。接著將標準曲線與實驗萃取蛋白質各取出 4 μL，充分與 296 μL CBB 反應。每個樣品做二重複，避光靜置 10 分鐘後以光電比色計測量，測定於 OD 595 nm 下的吸光值。將等倍稀釋之 BSA 製作成標準曲線，換算出實驗萃取蛋白質之濃度。. 9. 西方轉漬法取 20 μg 蛋白質加入總體積一半的 3SDS sample buffer (350 mM Tris-HCl (pH 6.8), 12% SDS, 0.02% bromophenol bule, 35% glycerol, 30% β-mercaptoethanol)，均勻混合後置於 95℃乾浴槽 5 分鐘。將電泳裝置組合完畢後，加入蛋白質及分子量的標記蛋白 (prestained molecular weight markers) (Infinigen EZColor IITM)，再放入 1×SDS PAGE 的 running buffer。SDS-PAGE (5% SDS polyacrylamide stacking 26.

(28) gel 與 12% separating gel) 以電壓 60 伏特進行 30 分鐘後，再將電壓調至 120 伏特進行電泳 60 分鐘。電泳結束後，將凝膠與硝化纖維膜 (nitrocellulose membrane, NC membrane) (Pall Corporation, East Hills, NY) 以轉漬版夾夾緊，放入轉漬槽 (HOEFER, Amersham Pharmacia) 後裝填轉漬緩衝液 (blotting buffer)，於電壓 80 伏特下進行轉漬 50 分鐘。轉印結束後，將轉印膜泡在溶於 PBS-T (含 0.05% Tween-20 的 PBS ) 的 5 %脫脂奶粉，用以遮蓋掉膜上沒有蛋白質的空白區域。於室溫下反應 1 小時後，以 PBS-T 搖晃清洗 4 次，每次 5 分鐘。將一級抗體 (primary antinbody) 稀釋於 PBS-T 中，與轉印膜一同放置於 4℃冰箱約 18 至 40 個小時後，將轉印膜以 PBS-T 清洗 4 次，每次 5 分鐘。再加入以 PBS-T 稀釋 1:5000 的二級抗體(HRP-conjugated secondary antibody)，於室溫下反應 1 小時後，以 PBS-T 緩衝液搖晃清洗 4 次，每次 5 分鐘。最後加入 ImmobilonTM chemiluminescent HRP substrate (Millipore) (luminal reagent : peroxide solution = 1 : 1)，以冷光儀 (LAS 3000, Fuji Film) 冷光影像呈現影相。實驗使用之一級抗體包括：rabbit anti-p53 (稀釋倍率 1:5,000， Santa Cruz Biotechnology, Inc.)、rabbit anti-PARP (稀釋倍率 1:6,000， Santa Cruz Biotechnology, Inc.)、rabbit anti-caspase-3 (稀釋倍率 1:1,000，Santa Cruz Biotechnology, Inc.)、rabbit anti-LC3(稀釋倍率 27.

(29) 1:500，Novus Biologicals)及 rabbit anti-GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) (稀釋倍率 1:20,000，GeneTex Inc.)、rabbit anti-Histone-1 (稀釋倍率 1:1,000，Santa Cruz Biotechnology, Inc.)及 rabbit anti-MDM2 (稀釋倍率 1:3,000，GeneTex Inc.)等。經過冷光影像的轉印膜可以使用 stripping buffer (0.1 M β-mercaptoethanol, 10% SDS, 0.5 M Tris-HCl) 於 57℃下清除抗體與 ECL 試劑。經過 40 至 50 分鐘之後，再以 5 %脫脂奶粉遮蓋沒有蛋白質的空白區域後，依序加入一級和二級抗體，以冷光儀呈現影相。實驗以 Multi Gauge v2.1 (Fujifilm Holdings Corp.) 軟體做定量分析，將待測蛋白質量分別與 GAPDH 蛋白量換算成比值。 10.統計挑選兩次以上的獨立實驗的結果，以 Paired t-test 分析 (Sigma plot 10.0, Systat software) 相關數據，並計算 P 值 (P value)，用以評估實驗結果是否有統計上顯著性的差異。 *表示 P<0.05 (significant)，**表示 P<0.01 (highly significant)，***表示 P<0.001 (extremely significant)。. 28.

(30) 三. 結果 1. 以 A549 肺癌細胞株進行細胞生長率試驗之篩檢本論文首先規劃的有效藥物篩檢，實驗是以 MTT 試驗為主要測試方法。先將各種小分子化學合成藥物溶於 DMSO 後，分別以 5、10 及 20 μM 反應 48 小時之後，再測定肺腺癌 A549 細胞株活性是否會下降。細胞活性是以鑑定留存在於活細胞粒線體內膜中的琥珀酸去氫酶 (succinate dehydrogenase) 為參考。實驗以存活細胞後還原的 MTT，所形成的紫色結晶顆粒，再溶於 DMSO 之後，讀取在波長 595nm 下之吸光值。它代表粒線體的活性，也與活細胞數目成正比。實驗共計測試了 42 個的小分子化學藥物，並且分別以具有細胞毒殺作用的三環氧化物 teroxirone 及本實驗室先前所篩選出的 A-007 為正控制組，另以沒有任何活性的 DB-002 作為負控制組。實驗結果顯示其中 35 個藥物不論濃度之高低，均無法有效降低 A549 細胞株的吸光值 (Fig 1)。其它的 7 個藥物，包括：DB-005、DB-011、MZ-01-059、 MZ-01-078、MZ-01-081、SAC-46A 以及 DJR-1-77，它們都會隨著測試濃度的增加，使得肺癌細胞的生長速率會明顯下降 (Fig 2)。其中 20 μM 的 DJR-1-77、SAC-01-46A 及 MZ-01-0811 都會讓癌細胞的生 29.

(31) 長速率降低至 50%。. 2. 由群落形成鑑定 MZ-01-059 可以抑制非小細胞肺癌的生長速率進一步以細胞流式儀分析細胞週期分佈，經處理三種細胞株 48 小時後，隨著藥物濃度增加，細胞的生長率也會逐漸下降，而且三種細胞都有類似抑制效應。A549、H1299 及 H460 細胞生長速率分別於 20 μM 降低至 55%、56%以及 58% (Fig 3)。另一方面以群落形成分析測試癌細胞經藥物處理後，是否能夠增生形成群落的能力。結果顯示 MZ-01-059 對 A549、H1299 及 H460 都能抑制三種細胞株群落的增生 (Fig 4A)。實驗分別以 5、10 及 20 μM 處理 48 小時後，再以完全培養液持續培養 6 天後，以 5 μM 的 MZ-01-059 就可以有效降低三種細胞增生的速率至 35%、43%及 43% (P<0.01)﹔當使用 20 μM 處理之後，幾乎可以完全抑制細胞的增生，這三種細胞的生長速率分別降低至 9%、18%及 4% (Fig 4B)。因此根據細胞生長率與群落形成之實驗結果，可以看出 MZ-01-059 對非小細胞肺癌的生長速率的抑制具濃度效應。. 3. MZ-01-059 使具有內生性 p53 非小細胞肺癌產生細胞凋亡為了要瞭解 MTT 試驗中測得數種藥物如何降低 A549 細胞生長速率，實驗進一步採用流式細胞儀分析藥物對細胞週期的影響。其中可以降低細胞生長速率之藥物包括： Sac-01-46A、MZ-01-81、 30.

(32) DJR-1-77 及 Ramesh-B008。這些藥物於非小細胞肺癌反應 48 小時後，沒有檢測到任何 sub G1 週期細胞的增加，顯示細胞不是以細胞凋亡降低生長速率 (Fig 5)。實驗也分別以 2、5 及 10 μM 的 MZ-01-059 處理各個細胞株 24、 36 及 48 小時後，再分析細胞週期分佈的變化。其中 A549 細胞株以 10 μM 反應 24 小時後，G0/G1 週期開始降低，細胞主要是停滯於 S 期﹔ 但以 5 及 10 μM 處理 48 小時之後，sub G1 細胞數目會分別增至 8% 及 14% (Fig 6)。而 H1299 細胞株於 2 μM 反應 24 小時之後，S 期的細胞數目增加，而 G0/G1 細胞週期降低；但自 48 小時開始則 G2/M 期細胞數目增至 35% (P<0.01)。隨著反應時間的增加及濃度上升，其 sub G1 細胞數目並沒有顯著改變 (Fig 7)。 H460 細胞株以 5 μM 反應 24 小時之後，S 期的細胞數目開始增加，而 G0/G1 週期細胞，於 48 小時才逐漸降低。當以 5 及 10 μM 處理 48 小時之後，而 sub G1 細胞數目會分別增至 13%及 31% (Fig 8)。另以二維流式細胞儀檢視細胞凋亡的過程顯示，以 5 及 10 μM 的 MZ-01-059 處理 H460 及 H1299 細胞株 48 小時後，會讓 H460 細胞凋亡，主要以晚期細胞凋亡 (第三象限) 為主。當以 5 及 10 μM 處理之後，其晚期凋亡細胞數目從 7.0%增至 27%；而細胞壞死 (第四象限) 則由 2%增至 11%。因此判斷 MZ-01-059 使細胞存活率降低的原因主 31.

(33) 要是細胞凋亡所致，且有部分壞死細胞﹔而藥物對 H1299 細胞株則不會受到 MZ-01-059 的影響，也沒有任何細胞凋亡 (Fig 9)。. 4. 以西方轉漬法檢測 MZ-01-059 所引發細胞凋亡的路徑分子機轉以西方轉漬法分析與細胞凋亡相關基因 PARP、p53 與細胞自噬基因 LC3 的變化，實驗以 DMSO 為控制組 (Fig 10A)。以 MZ-01-059 處理 A549 細胞 48 小時後，p53 會隨濃度增加 (Fig 10B)，同時 PARP 可以被切出的部分也有增加 (Fig 10C)﹔而細胞自噬分子 LC3-I、 LC3-II 以及兩者的比值則沒有顯著改變 (Fig 10D、E 及 F)。H1299 細胞株以 DMSO 處理時，PARP 即出現小部分被切割，但其密度並沒有因為加入 MZ-01-059 而有上升。細胞內的 LC3-I 及 LC3-II 隨藥物濃度增加，且 LC3-I 轉換成 LC3-II 的比例也增加，因此藥物可以引發 H1299 細胞自噬，卻不會產生細胞凋亡。而 5 μM 的 MZ-01-059 可使 H460 誘發 p53 上升；濃度增至 20 μM 時，PARP 的切割片段愈見明顯，而細胞內 LC3-II 密度則下降，LC3-I 轉換成 LC3-II 的比例同時也降低。同樣以西方轉漬法分析 10 μM 的 MZ-01-059，於不同時間點對非小型肺癌細胞的凋亡相關因子影響 (Fig 11A)。MZ-01-059 經 48 小時處理之後，A549 細胞內 p53 上升，至 72 小時後則會降低 (Fig 11B)。 PARP 及 pro-caspase-3 則是隨著反應時間的增加，被切割出的片段逐 32.

(34) 漸也增加 (Fig 11C 及 D)。而且 LC3-I 及 LC3-II 表現量皆上升 (Fig 11E 及 F)，於 72 小時後，LC3-I 轉換成 LC3-II 的比例也相對提高 (Fig 11G)。而 10 μM 的 MZ-01-059 於 H1299 細胞株反應至 72 小時後，切割的 PARP 及 caspase-3 才會出現。雖然 LC3-I 及 LC3-II 密度皆增加，但 LC3-I 轉換成 LC3-II 的比值降低。因此可以推斷 H460 細胞誘導 p53 的增加較 A549 細胞明顯，兩個細胞的 p53 於 72 小時後都會降低。但是 PARP 及 pro-caspase-3 切割出的片段隨著時間增至 72 小時而加強，而 LC3-I 及 LC3-II 於 48 小時後降低。. 33.

(35) 四. 討論肺腺癌在亞洲人發生的比例高，大多發病於女性及不抽煙者，它也一直是多年國人癌症死因之一。肺腺癌細胞的生長較緩慢，轉移也較慢，早期沒有特別的症狀，通常診斷出來時已經是晚期。因此對於已經移轉的病患，多以化學治療為主。但現今臨床使用的藥物，對於肺腺癌化療的療效仍有限，因此本研究採用具有野生型 p53 的肺腺癌 A549 細胞株為篩選藥物的模式，欲篩選出能夠活化 p53 使癌細胞產生凋亡的新穎化學小分子。首先利用 MTT assay 進行篩選有機小分子合成藥物時，僅有 6 個藥物被檢測出可以抑制 A549 細胞的生長速率 (Table 1)，它們包括：DB-005、DB-011、MZ-01-059、MZ-01-081、 SAC-01-16B 及 DJR-1-77，和先前實驗室研究篩選出之 Ramesh-B008 (Fig 2)。將 MTT 測試篩選出具有降低 A549 肺癌細胞生長速率之藥物，進一步深入分析細胞各週期分佈時，初步研究結果顯示 MZ-01-081、 SAC-01-46A、DJR-1-77 及 Ramesh-B008 可讓部分肺癌細胞 G2/M 週期細胞比例上升約 10%，而同時 S 期細胞比例下降，但都不會於 48 小時造成細胞凋亡 (Fig 5)。初步結果顯示這些藥物可能需要更高的濃度或增加處理時間，才會使細胞走向凋亡，未來仍需要更多的實驗 34.

(36) 證實。分析篩選的結果挑選出 MZ-01-059 為本論文主要討論之藥物，為一種含有酯基的雜環有機小分子化合物，和目前所知已用於臨床治療的藥物相比，它的結構簡單，實驗製作的流程也較為簡略。經過 MTT 與群落形成測定的實驗結果顯示，當使用 5 μM 時，這些藥物會有效抑制三種非小細胞肺癌的生長速率。但是進一步分析細胞週期時，只要 5 至 10 μM 濃度下可以讓有 p53 的 A549 及 H460 細胞株凋亡 (Fig 6 及 8)。相較於 A549，肺癌細胞 H460 對藥物敏銳性較高。隨著處理時間增加至 48 小時，G0/G1 週期細胞分佈開始下降，而 sub G1 細胞數目會增加。這項結果顯示 MZ-01-059 會誘導 A549 及 H460 細胞進入細胞凋亡，其中 p53 對 H460 細胞株所誘導的死亡主要以晚期的細胞凋亡為主，少部分走向細胞壞死 (Fig 9)。對不具有 p53 的 H1299 細胞， MZ-01-059 處理 48 小時的影響則較不明顯，然而細胞增生速率的降低程度與 A549 及 H460 細胞相近。 MZ-01-059 會讓 H1299 細胞週期停滯於 G2/M 期，相較於 A549 及 H460 細胞，其生長速率也沒有明顯差異，但不會產生細胞凋亡。本研究也顯示 MZ-01-059 是藉由細胞凋亡抑制肺癌細胞的增生與 p53 相關，而讓細胞生長速率降低。實驗數據顯示 MZ-01-059 是藉由 p53 活化誘導下游 caspase-3，而 PARP 會被 caspase-3 切割而失去功能。實驗看出 PARP 被 caspase-3 35.

(37) 活化只有在含有 p53 的細胞發生，如此可以確立細胞凋亡是經由 p53 所主導。癌細胞也可以首先引發細胞自噬，讓細胞在藥物存在的逆境下存活，而長時間的細胞自噬，會誘導凋亡。這個可以由 LC3-I 結合脂質成為 LC3-II 是自噬體的看出來，而 LC3-II/LC3-I 比值的增加可視為細胞自噬的指標。本研究結果顯示藥物引發三種細胞對藥物反應方式不盡相同。A549 細胞在 48 小時所誘發 p53 最高，至 72 小時活化的 p53 開始消失，而細胞自噬卻會增加，導致它的凋亡效應不如 H460 明顯 (Fig 11)。H1299 在 48 小時即誘發細胞自噬保護細胞，其發生凋亡時間可能較晚。但在沒有 p53 的細胞下，藥物反應需達到 72 小時才可以開始誘發細胞凋亡的跡象 (Fig 11)。因此可以看出， MZ-01-059 對 H460 細胞株較為敏感，在 48 小時就會誘發細胞凋亡，而刺激下游蛋白活化 caspase-3 增加及 PARP 的裂解。期間沒有看到細胞自噬的機制，因此凋亡發生時間早於 A549 細胞。這個藥物也證實藥物引發細胞自噬與細胞凋亡有關。未來仍應增加更多的實驗，如加入細胞自噬抑制劑，續觀察若細胞自噬受到抑制時，是否會降低細胞凋亡。此外 A549 細胞雖然會被誘導較多的 p53，但卻不會立刻產生凋亡，反而是增加細胞自噬，為什麼都具有 p53 的 A549 與 H460 細胞對藥物的反應不盡相同。這次研究的初步結果仍需要更多實驗證明細胞是如何引發自噬進入凋亡。 36.

(38) 五. 參考文獻 Abedin MJ, Wang D, McDonnell MA, Lehmann U, Kelekar A. Autophagy delays apoptotic death in breast cancer cells following DNA damage. Cell Death & Differentiation. 2007; 14: 500-10. Alderden RA, Hall MD, Hamble TW. The Discovery and Development of Cisplatin. Journal of Chemical Education. 2006; 83: 728-34 Alessi DR, Andjelkovic M, Caudwell B, Cron P, Morrice N, Cohen P, Hemmings BA. Mechanism of activation of protein kinase B by insulin and IGF-1. The EMBO Journal. 1996; 15: 6541-51. Alfonso B, Antonio DL, Vincenzo E, Mara C, Enrico P. S, and Gennaro Citro. Tumor suppressors and cell-cycle proteins in lung cancer. Pathology Research International. 2011; 2011: 605042 Andrabi SA, Kim NS, Yu SW, Wang H, Koh DW, Sasaki M, Klaus JA, Otsuka T, Zhang Z, Koehler RC, Hurn PD, Poirier GG, Dawson VL, Dawson TM. Poly(ADP-ribose) (PAR) polymer is a death signal. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2006; 103: 18308-13. Arico, S, A. Petiot, C. Bauvy, P.F. Dubbelhuis, A.J. Meijer, P. Codogno, and E. Ogier-Denis. The tumor suppressor PTEN positively regulates macroautophagy by inhibiting the phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B pathway. The Journal of Biological Chemistry. 2001; 276: 35243–35246. Bertwistle D, Sugimoto M, Sherr CJ. Physical and functional interactions of the Arf tumor suppressor protein with nucleophosmin/B23. Molecular and Cellular Biology. 2004; 24: 985-96. Bunn PA Jr. Chemotherapy for advanced non-small cell lung cancer: Who, what, when, why? Journal of Clinical Oncology. 2002; 20: 23-33 37.

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(45) 六. 圖 20 μM 相對生長速率變化. 實驗次數. 20 μM 相對生長速率變化. 實驗次數. (%)*. (n). (%). (n). DKB-112. 93. 2. SAC-01-49B. 103. 1. DKB-113. 96. 3. SAC-01-53B. 106. 1. DKB-114. 98. 3. DB-001. 80. 2. Ramesh-B008. 65. 4. DB-002. 95. 5. Ramesh-B012. 78. 1. DB-003. 85. 2. DJR-1-71. 100. 2. DB-004. 69. 2. DJR-1-73. 99. 2. DB-005. 70. 4. DJR-1-74. 101. 2. DB-006. 90. 2. DJR-1-76. 93. 2. DB-011. 63. 5. DJR-1-77. 49. 5. DB-012. 83. 2. DJR-1-79. 74. 3. DB-013. 89. 2. DJR-1-88. 101. 2. MZ-01-056. 90. 2. DJR-1-89s. 101. 2. MZ-01-057. 74. 2. SAC-01-16B. 96. 1. MZ-01-059. 60. 4. SAC-01-27A. 100. 1. MZ-01-061. 95. 2. SAC-01-27B. 102. 1. MZ-01-062. 77. 2. SAC-01-28A. 100. 1. MZ-01-067. 90. 2. SAC-01-32A. 109. 1. MZ-01-069. 75. 2. SAC-01-32B. 101. 1. MZ-01-075. 98. 2. SAC-01-42B. 110. 1. MZ-01-078. 60. 5. SAC-01-46A. 53. 5. MZ-01-081. 53. 4. 藥物名稱. 藥物名稱. Table 1. 篩選藥物在 A549 細胞的相對生長速率變化。 A549 細胞株分別以 5、10 及 20 μM 藥物處理 48 小時後，以 MTT assay 檢測細胞相對的生長速率，依標示實驗次數計算出平均值。 *相對細胞生長速率(%)=(實驗組吸光值/控制組 (vehicle control， DMSO) 吸光值)×100。 44.

(46) (A). (B). (C). 45.

(47) (D). (E). 46.

(48) Fig 1. 比較化學小分子對 A549 肺癌細胞株反應之生長速率*。圖(A)為 DB-001、002、003、004、006、012 及 013。圖(B)為 MZ-01-056、057、061、062、067、069 及 075。圖(C)為 SAC-01-16B、27A、27B、28A、32A、32B 及 42B。圖(D)為 DJR-1-71、73、74、76、79、88 及 89S。圖(E)為 SAC-01-49B、53B、DKB-112、113 及 114。以 A549 作為篩選平台，分別以 5、10 及 20 μM 將待篩選藥物處理 48 小時後，再以 MTT assay 檢測細胞的生長速率。圖(A)及(B)的 Bar 代表二次獨立實驗的結果，並計算標準誤差 (standard errors)。圖 (C)至(E)為一次獨立實驗的結果。. *相對細胞生長速率(%)= (實驗組吸光值/控制組 (vehicle control， DMSO) 吸光值)×100。. 47.

(49) Fig 2. 以 MTT assay 測試不同的化合物對 A549 肺癌細胞株的反應生長速率。以 A549 作為篩選平台，分別以 5、10 及 20 μM 將待篩選藥物處理 48 小時後，再以 MTT assay 檢測細胞的生長速率。實驗分別以 A-007 及 DB-002 作為正控制組及負控制組。篩選出可以顯著降低細胞生長速率的各項藥物。包括 MZ-01-059、DJR-1-77、SAC-01-46A、 MZ-01-078 及 MZ-01-081，於 20 μM 分別降低細胞生長速率約至 60%。Bar 代表三次獨立實驗的結果，並計算標準誤差。. 48.

(50) Fig 3. 利用 MTT assay 檢測不同濃度 MZ-01-059 對 A549、H1299 及 H460 非小細胞肺癌的反應生長速率的變化。 MZ-01-059 分別以 5、10 及 20 μM 處理 A549、H1299 及 H460 細胞株 48 小時後，再以 MTT assay 檢測細胞的生長速率。MZ-01-05922 對三種細胞株都會抑制細胞生長速率。A549 的 Bar 代表六次獨立實驗的結果﹔H1299 及 H460 代表四次獨立實驗的結果，並計算標準誤差。以 Paired t-test 計算 P 值，**P<0.01，***P<0.001。. 49.

(51) (A). (B). Fig 4. 由群落形成試驗檢測 MZ-01-059 對非小細胞肺癌增生的影響。圖(A) 細胞群落試驗結果，圖(B) 群落細胞面積統計圖在 12 孔培養盤中，分別種入 200 個 A549、H1299 細胞及 1,000 個 H460 細胞 24 小時後，再以 5、10 及 20 μM 的 MZ-01-059 處理 48 小時後，移除培養基，再加入 5%的 FBS 培養六天之後，以 0.2% crystal violet 染色細胞群落。實驗結果顯示對三種細胞株的增生都受到影響，且隨著濃度增加效果會益於明顯。Bar 代表二次獨立實驗的結果，並計算標準誤差。圖(B)為相對細胞增生速率(%)= (實驗組群落面積/ 控制組 (vehicle control，DMSO) 群落面積)×100。實驗以 Image-Pro Plus v4.5 (Media Cybernetics Inc.) 軟體分析群落面積，以 DMSO 做控制組，換算成百分比。. 50.

(52) (A) MZ-01-81 (n=2). (B) SAC-01-46A. 51.

(53) (C) DJR-1-77 (n=1). (D) Ramesh-B008 (n=1). 52.

(54) Fig 5. 化合物不具有使非小細胞肺癌 sub G1 細胞週期增加之效應。圖(A)至(D)分別為 MZ-01-81、SAC-01-46A、DJR-1-77 及 Ramesh-B008。圖(A)以 5、10 及 20 μM 對 A549 及 H460 細胞；圖(B)、(C)及(D) 以 2、5 及 10 μM 對 A549、H1299 及 H460 三種細胞反應 48 小時後，收集細胞加入 PI 染色後，以流式細胞儀測試各細胞週期。MZ-01-81、 SAC-01-46A、DJR-1-77 及 Ramesh-B008 皆不會對非小細胞肺癌產生細胞凋亡。圖(A)及(B)的 Bar 代表二次獨立實驗的結果，並計算標準誤差。圖(C)及(D)為一次獨立實驗的結果。. 53.

(55) A549 (A) 24 h (n=2). (B) 36 h (n=2). (C) 48 h (n=5). 54.

(56) Fig 6. MZ-01-059 會增加 A549 的 sub G1 細胞數目，G0/G1 細胞週期降低。圖(A)至(C)分為 24、36 及 48 小時處理後的結果。實驗以 2、5 及 10 μM，對 A549 細胞分別處理 24、36 及 48 小時後，收集細胞加入 PI 染色後，以流式細胞儀測試各細胞週期的變化，實驗以 DMSO 為控制組。實驗結果顯示 24 小時可使 G0/G1 細胞週期降低，而在 48 小時後 sub G1 細胞週期開始增加。圖(A)及(B)的 Bar 代表二次獨立實驗的結果﹔圖(C)代表五次獨立實驗的結果，並計算標準誤差。以 Paired t-test 計算 P 值，* P<0.05。. 55.

(57) H1299 (A) 24 h (n=2). (B) 36 h (n=2). (C) 48 h (n=5). 56.

(58) Fig 7. MZ-01-059 使 H1299 的 S 及 G2/M 週期分佈比例增加。圖(A) 至(C)分為 24、36 及 48 小時處理後的結果。實驗以 2、5 及 10 μM，對 H1299 細胞分別處理 24、36 及 48 小時後，收集細胞加入 PI 染色後，以流式細胞儀測試各細胞週期的變化，實驗以 DMSO 為控制組。實驗結果顯示 24 小時可使 S 期細胞數目增加；48 小時則停滯於 G2/M 週期，但仍無法使 sub G1 細胞數目增加。圖(A)及(B)的 Bar 代表二次獨立實驗的結果﹔圖(C)代表五次獨立實驗的結果，並計算標準誤差。以 Paired t-test 計算 P 值，** P<0.01。. 57.

(59) H460 (A) 24 h (n=2). (B) 36 h (n=2). (C) 48 h (n=2). 58.

(60) Fig 8. MZ-01-059 增加 H460 的 sub G1 細胞數目，G0/G1 細胞週期降低。圖(A)至(C)分別為 24、36 及 48 小時處理後的結果。實驗以 2、5 及 10 μM，對 H460 細胞分別處理 24、36 及 48 小時後，收集細胞加入 PI 染色後，以流式細胞儀測試各細胞週期的變化，實驗以 DMSO 為控制組。實驗結果顯示在 24 小時，以 10 μM 處理時 S 期增加；在 48 小時後 sub G1 細胞數目上升，同時 G0/G1 細胞週期下降。圖(A)及(B)代表二次獨立實驗的結果﹔圖(C)代表五次獨立實驗的結果，並計算標準誤差。以 Paired t-test 計算 P 值，* P<0.05。. 59.

(61) Fig 9. MZ-01-059 對細胞凋亡的分析。以 5 及 10 μM 的 MZ-01-059 對 H460 及 H1299 細胞反應 48 小時後，再以 PI 及 Annexin V 進行雙染色後，以流式細胞儀測試細胞凋亡及壞死。MZ-01-059 可使 H460 細胞株主要產生細胞凋亡 (包括第二及第三象限)，以晚期細胞凋亡為主 (第三象限)，伴隨部分壞死細胞 (第四象限)；H1299 細胞株沒有產生細胞凋亡。數據為一次獨立實驗的結果。. 60.

(62) (A). (B). (C). (D). (E). 61.

(63) (F). Fig 10. MZ-01-059 在不同濃度對於非小型肺癌細胞的細胞凋亡相關因子的影響。圖(A)為西方轉漬法分析圖；圖(B)至(F)分別為 p53、 PARP- cleaved、LC3 I、LC3 II 及 LC3-II/ LC3-I 比值量化圖。以 5、10 及 20 μM 的 MZ-01-059 對 A549、H1299 及 H460 三株細胞反應 48 小時後，萃取細胞蛋白質並取 20 μg 全蛋白進行西方轉漬法，以 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 作為 loading control。一級抗體反應 18 至 40 小時後，加入二級抗體 goat-anti-rabbit 於室溫下反應 1 小時後，以 ECL 顯色。圖(B)至(F)為圖(A)之蛋白質表現量作量化分析圖，其中 Y 軸為待測蛋白質量分別與 GAPDH 蛋白量之比值﹔圖(F)為 LC3-II 和 LC3-I 的比值，表示 LC3-I 轉換成 LC3-II 的程度。. 62.

(64) (A). (B). (C). (D). (E). 63.

(65) (F). (G). Fig 11. MZ-01-059 在不同時間點對於非小型肺癌細胞的細胞凋亡相關因子影響。圖(A)為西方轉漬法分析圖；圖(B)至(G)分別為 p53、 PARP- cleaved、caspase 3-cleaved、LC3 I、LC3 II 及 LC3-II/ LC3-I 比值的量化圖。以 10 μM 的 MZ-01-059 對 A549、H1299 及 H460 三株細胞反應 48 及 72 小時後，萃取細胞蛋白質，並取 20 μg 全蛋白進行西方轉漬法，實驗以 GAPDH 作為 loading control。一級抗體反應 18 至 40 小時後，加入二級抗體 goat-anti-rabbit 於室溫下反應 1 小時後，以 ECL 顯色。圖(B)至(F)為圖(A)之蛋白質表現量作量化分析圖，Y 軸為待測蛋白質量分別與 GAPDH 蛋白量之比值。其中圖(B)及(C)的 Bar 代表三次獨立實驗的結果，並計算標準誤差。圖(G)為 LC3-II 和 LC3-I 的比值，表示 LC3-I 轉換成 LC3-II 的程度。. 64.

(66) 目錄英文摘要...................................................................................................................... 68 圖目錄.......................................................................................................................... 69 一.. 緒論.................................................................................................................. 70 文獻評述.......................................................................................................... 70. 1.. 2. 二.. (1). 抗癌藥物 Topoisomerase II 抑制劑 ........................................................... 70. (2). Akt 訊息傳遞路徑....................................................................................... 71. (3). p53 與 MDM2 的拮抗效應......................................................................... 73. (4). 過去研究結果.............................................................................................. 74 研究目標.......................................................................................................... 75 材料與方法...................................................................................................... 76. 1.. 細胞培養.......................................................................................................... 76. 2.. 轉殖重組基因載體.......................................................................................... 76. 3.. 細胞計數.......................................................................................................... 77. 4.. 核蛋白質的萃取.............................................................................................. 77. 三.. 結果.................................................................................................................. 79. 1.. 玫瑰樹鹼 (ellipticine) 對 HW16 生長速率及細胞週期分佈的變化。 ...... 79. 2.. 外源 Akt 影響 ellipticine 引發 p53 核移動。................................................ 80. 3.. Ellipticine 對 HW16 細胞自噬分子 LC3 的變化 .......................................... 81. 四.. 討論.................................................................................................................. 83. 五.. 參考文獻.......................................................................................................... 86. 65.

(67) 玫瑰樹鹼對肺癌細胞誘導 Akt 及 p53 核移動及生長抑制. The induced p53 and Akt nuclear translocation and growth inhibition by ellipticine in human lung cancer cells. 66.

(68) 中文摘要拓樸異構酶 II 抑制劑玫瑰樹鹼 (ellipticine) 為具有抑制癌細胞生長的抗癌藥物，本實驗室過去研究指出藥物可經由活化 p53，使人類非小細胞肺癌 A549 細胞株凋亡。本論文持續探討細胞生長因子 Akt 對於 p53 進入細胞核的影響，研究使用轉殖 p53 質體至 H1299 的穩定細胞株 (HW16)。但當加入外源 Akt 會增加 ellipticine 對細胞生長的抑制效應，並讓 sub G1 週期細胞數目上升，而 Akt 及 p53 會被共同誘導移入細胞核內，DNA 修補酶 PARP 也受到剪切。但將 AktS473 位點突變後，誘導產生的細胞凋亡會被抑制；而 AktT308 位點突變後抑制能力則較不明顯。Ellipticine 所引發的細胞凋亡也與細胞自噬的形成有關，加入 Akt 後細胞內 LC3-I 轉換成 LC3-II 的比例增加，但當 AktS473 位點突變後，所誘導的細胞自噬也會降低。因此本研究顯示 ellipticine 所誘導產生的細胞凋亡是與 Akt 及 p53 移動至細胞核及細胞自噬形成有關，且 AktS473 位點的磷酸化對於藥物引發的細胞凋亡具有重要性。. 關鍵字：玫瑰樹鹼, Akt, p53, 細胞凋亡, 細胞自噬. 67.

(69) 英文摘要 Topoisomerase II inhibitors, ellipticine and its analogues, were reported promising anticancer drugs due to its antineoplastic effects. Tumor suppressor p53 plays an important role in DNA damage-induced apoptosis. The phosphatidylinositol 3-OH-kinase-Akt pathway inhibits p53-mediated transcription and apoptosis, while the Akt substrate MDM2, an ubiquitin ligase for p53, plays a pivotal role in regulation of the stability of p53. Previously, we showed that ellipticine-induced cytotoxicity in non-small-cell-lung-cancer (NSCLC) was achieved through autophagy and apoptotic death as a result of Akt-modulation. Nucleus translocation of p53 and Akt and recruitment of autophagosome were found in A549 cells. In this study, we further demonstrated that Akt-related cell death also occurred in p53-deficient cells with stable expression of exogenous p53 ( HW16). The cell death phenotype was ameliorated when transfected with dominant-negative AKTS473A construct. On the other hand, the apoptotic phenotype was also be reverted by AktT308A with less dominant effect. Akt and p53 were both translocated into nucleus during apoptosis in ellipticine -treated HW16 cells. Our work demonstrated that Akt and p53 nuclear translocation are essential in elliptpcine- induced apoptosis in HW16 cells. Keyword：Ellipticine, Akt, p53, apoptosis, autophagy. 68.

(70) 圖目錄 Fig 1. 轉殖 Akt 及位點突變 Akt 對 ellipticine 處理後 HW16 細胞生長速率所生成的影響。.....................................................................90 Fig 2. 轉殖 Akt 及位點突變 Akt 對 ellipticine 處理後 HW16 細胞週期所生成的影響。.............................................................................91 Fig 3. 以西方轉漬法檢測細胞凋亡相關蛋白質的變化。 ...............92 Fig 4. 以西方轉漬法檢測細胞自噬分子 LC3 蛋白質的變化。 .....94. 69.

(71) 一. 緒論. 1. 文獻評述. (1) 抗癌藥物 Topoisomerase II 抑制劑-玫瑰樹鹼 (ellipticine) DNA 拓撲異構酶Ⅱ (DNA topoisomerase II) 能夠協助解開雙股螺旋 DNA，完成細胞複製。由於它在癌細胞內的活性較一般正常細胞為高 (Riou et al., 1986)，因此抑制癌細胞內的 topoisomerase II 活性也是發展癌症化學藥物治療中的開發目標之一。於 1959 年時，法國科學家首次從大洋洲一種常見的夾竹科玫瑰樹屬植物 Apocyanaceae 的葉子中，分離出一種具有簡單構造的生物鹼，並命名為玫瑰樹鹼 (5,11-dimethyl-6H-pyrido[4,3-b]carbazole, ellipticine) (Goodwin et al., 1959)。玫瑰樹鹼及其衍生物在臨床研究中發現皆有顯著的抗腫瘤功能，在低濃度時即可以有效的使乳癌、大腸癌及肺癌等細胞停止生長和死亡 (Stiborova et al., 2006)。. 它可以做為 DNA 拓撲異構酶Ⅱ的抑制劑，藉由嵌入到 DNA 以 70.