抗體

Anti-ERα(F10, sc-8002, Santa Cruz) Anti-Foxa1(gtx100308,Genetex)

Anti-Foxa2( M-20, sc-6554,Santa Cruz) Anti-HNF4Α(H171, sc-8987 Santa Cruz) Anti-HNF4Α N’(NB100-1783, Novus) Anti-β-Actin(C4, sc-47778, Santa Cruz) 1.5 引子

a. ERα:

 gDNA 放大及定序：

Sequence Amplicon length

EXON1-F1 CCGTCCTCCAGCACCTTTGTAATG 1151 bp 24 EXON1-R1 CCAAGAGCGGACCTTCCCAAGTG 24 EX1-F CGGTTTCTGAGCCTTCTGCCC 771 bp 21 EXON1-R2 TGCCTCTCGCACGGACGGTAAG 22 EXON2-F GGATAAAGTGGATCTGCTGCATCTCC 351 bp 26 EXON2-R CCTTCCTCAGTCGCTTTGGCTCTTAG 26 EXON3-F2 CAACATAGTAAGGCTGAGGAAGTGATAGG 445 bp 29 EXON3-R2 GCCATGTTAGAATTTCCAGTTCCAGAC 27 EXON4-F2 TCACCTGTGCTTGAAAGTATTTCTTC 534 bp 26 EXON4-R2 CACTATTTCTCCCATGACATCACAAC 26 EXON5-F GACCTTGTCAGTTCAAATCCCTGTTGC 373 bp 27 EXON5-R CACCCCCAATGCACTCTTTTGTTAAG 26 EXON6-F ATGAACCCTTTCATGTCTTGTGGAAG 305 bp 28

11

EXON6-R GCCTTTGGAGTGGGTAGATCGTATCTG 27 EXON7-F TGGCTCATTGTTACATCCCATGAACAC 378 bp 27 EXON7-R ACTCTCCATATGCAGGCACCAGTCC 25 EXON8-F GTGTCTTTGGAGTTCCTCTTCCTTCCC 417 bp 27 EXON8-R GACAGAATTTGGCTAAAGTGGTGCATG 27

 cDNA 放大及定序(nested)

134F CCTCTAACCTCGGGCTGTGCTC EX1F CGGTTTCTGAGCCTTCTGCCC

1350R GAGGGTCAAATCCACAAAGCC 1275R GGTCAGTAAGCCCATCATCGAAGC

 競爭 PCR(competitive PCR)：

6F CTAACTTGCTCTTGGACAGGAACC ER Total-R TCAGACCGTGGCAGGGAAACCC

b. PBGD

PBGD-1070-F CATGAAGATGGCCCTGAGGAT PBGD-1266-R GGCATCTGTGCCCCACAAACCAG

c. Lifr

hLifr-2753F CCACCTGGTCTTGCGAGCCTA hLifr-2870R CACTGCCACTGGGATGAGAATG

d. Foxa1

hFoxa1-327F GAAGATGGAAGGGCATGAAACCA hFoxa1-520R TGGCATAGGACATGTTGAAGGACG

e. Foxa2

hFoxa2-F GAGCAGCTACTATGCAGAGC

12

hFoxa2-R ACGACGACATGTTCATGGAG

f. Luciferase

Luc-DNA-F GCACTCTGATTGACAAATACG Luc-DNA-R ATGGAACAACTTTACCGACC

1.6 藥劑

Lipofectamin^TM2000(Invitrogen, CA)

Genopure plasmid Maxi kit (Roche, Germany) gDNA extraction kit (Geneaid, TW)

SuperScript^TM First Strand Synthesis system(Invitrogen, CA) Estrogen (SIGMA)

2.方法 2.1 細胞培養

以含10% fetal bovine serum (FBS)、1% non-essential amino acids (NEAA)、

1% L-Gultamin- PEN-STREP-AMPHO SOL.的 Dulbecco’s 改良培養基(DMEM) 培養細胞於 37℃、5% CO2的恆溫細胞培養箱中。繼代培養時，以1× PBS 清

13

時。取20 μL 菌液塗於含質體帶有的抗生素的洋菜培養基上，於 37℃培養 14-16 小時，挑選單一菌落至含有特定抗生素的LB 培養液 3 mL 培養 12-14 小時後，

轉移至同樣含有抗生素的LB 培養液 200 mL，培養 14-16 個小時後，將菌液 裝入高速離心瓶，用高速離心機(7500 rpm, 20 分鐘)離心後，倒掉上清液，留 下沉澱菌體，以Genome plasmid maxi kit(Roche)抽取質體 DNA，以水或 TE buffer 在 4℃回溶過夜，長期保存於-20℃。

若為si-clone 的質體，則一律改為使用 TB 培養液在 30℃培養。

2.3 轉染(Transfection)

實驗前一天將細胞分成約八分滿，隔天Lipofectamin^TM2000 以 2.5 μl/1 μg 質體DNA 的比例轉染，先將 Lipofectamin^TM2000 加入適量的 opti-mem (GIBOCO)中(以六公分盤為例，需 250 μl，按比例增減)，靜置 5 分鐘，另取 等量的opti-mem 加入所需的質體 DNA，後將兩管混合，靜置二十分鐘，混合 10 % FBS 未加抗生素的培養液加入細胞中，六小時後換盤，可換回加抗生素 的培養液，但與賀爾蒙相關實驗，從轉染開始，皆以5%活性碳去除生長因子 後的FBS，加上不具酚紅的 DMEM 培養，以避免干擾。

2.4 RNA 干擾技術之慢病毒製備及感染(RNA interference : lenti-virus package) 實驗前一天先將293T 細胞分為約五成滿，隔天以 Lipofectamin^TM2000 共 同轉染4μg shRNA、4 μg pCMVΔ8.91、0.4μg pMD.G(10 公分盤)，六小時後換 一般細胞培養液6 mL，24 小時後，取 4 mL 培養液離心 3000 rpm、10 分鐘，

收集於15 mL 離心管中，並將新的 4 mL 的細胞培養液補回盤中，依此收滿三 天，可依據培養液的顏色縮減收取的間隔時間，最後一天將6 mL 全部收取，

儲存於-80℃待用。

14

2.5 病毒感染

同細胞繼代，以1× PBS 清洗細胞兩次，後以 0.05% 胰蛋白酶(Trypsin) 處理細胞約一分半鐘於37℃使細胞懸浮，以十倍的培養液中和後，離心 1000 rpm、2 分鐘，取約三天滿量的細胞，加入 polybrene 及含病毒的培養液(8 μg/mL)，

培養隔夜(16 小時以上)，以 1× PBS 清洗細胞兩次，換回正常細胞培養液，72 isopropanol(J.T. Baker, NJ)混合均勻，靜置-80℃沉澱過夜(16 小時)，以 13000 rpm、4℃離心 20 分鐘後，去除上清液，加入 200 μL 70%酒精(MERCK, Germany)，

以13000 rpm、4℃離心 10 分鐘潤洗沉澱物。在抽汽櫃中去除酒精，並待 RNA 風乾後，以DEPC 水回溶於 55℃10 分鐘，以 Nanodrop^R○ 測定濃度，並以 0.8%

瓊膠電泳去確定品質後，儲存於-80℃待用。若要抽取組織 RNA，則加 1 mL Rezol 到 MagNA Lyzer Green Beads(Roche, Gemany)管中，以 6500 rpm、15 秒 重複打磨米粒大小組織4 次，後移至新管加 chloroform，與細胞相同。

2.7 抽取基因體 DNA(gDNA)

將細胞以胰蛋白酶取下，並以培養液中和，以1× PBS 清洗細胞後，以 Cell lysis buffer (Geneaid)加入細胞中(300 μL/10⁷ cells)，在 60℃水浴中反應 10 分鐘，

每三分鐘votex 一次直到透明。加入 RNase A 5μL (10 mg/mL) 靜置室溫 5 分 鐘。加入Protein removal buffer 100 μL，votex 後迅速置於冰上 5 分鐘。以 13000 rpm 離心 5 分鐘，取上清液至新管加入 300 μL 異丙醇(isopropanol)搖勻。再

15

離心13000 rpm 5 分鐘，倒掉上清液，後以 70%酒精清洗沉澱，離心 13000 rpm 3 分鐘，去掉上清液，在抽汽櫃中風乾。最後以適當量的水或 TE buffer 在 60

℃溶解DNA 10-20 分鐘，保存於-20℃。

2.8 RNA 反轉錄為 cDNA

使用SuperScript® First Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen, CA) 將0.5 μL oligo(dT)、0.5 μL random hexamer、0.5 μL、10mM dNTP 加入 1 μg RNA 補DEPC 水至 5μL，於 65℃反應 5 分鐘後，靜置冰上 2 分鐘，加入 1 μL 10× RT buffer、1 μL 0.1M DTT、2 μL 25mM MgCl2、0.5μLRNaseOUT^TM(40 U/μL)、0.5μL SuperScript®III Reverse transcriptase(200 U/μL)混合液(5 μL/rxn)，於 25℃反應 5 分鐘，45℃10 分鐘，50℃50 分鐘，85℃5 分鐘後置於冰上，加入 0.5 μL RNase H 於 37℃反應 20 分鐘後儲存於-20℃待用。

2.9 定量聚合酶連鎖反應 qPCR

使用Light Cycler 1.5(Roche, MO)，以 SYBR Green I 偵測，以 PBGD 作 為Internal control，各反應以 25mM MgCl2 0.8 μL、10 μM forward primer 0.5 μL、

10 μM reverse primer 0.5 μL、ddH2O 6.2 μL、1a+1b 1 μL、模板 DNA 1 μL 混合，

10 μL/rxn 為原則進行。

2.10 競爭性聚合酶連鎖反應(Competitive PCR)

以雌激素受體 α 外顯子 6 上的 forward 引子(6F)與外顯子 8 上的 reverse 引子(ER Total-R)，行使聚合酶連鎖反應，可得到野生型及外顯子(572 bp)－7 缺失型雌激素受體α 兩種產物(388 bp)，跑 1.5%瓊膠電泳，比較兩產物的強度 差異。

16

2.11 雌激素受體定序

從液態氮保存的臨床檢體肝組織塊中抽gDNA，在每個外顯子前後設計引 子，以聚合酶連鎖反應分別放大雌激素受體 α 的八個外顯子，跑瓊膠電泳確 定大小後，以 illustra^TM GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare, UK)純化，送至基隆米克斯定序。將結果比對 NCBI 的標準序列 NG_008493.1，確定序列是否正確，若發現不同序列，比對同病患的非腫瘤肝 組織，確定是否為體細胞突變。另外，也以cDNA 定序比對雌激素受體 α 標 準序列NM_000125.3，確認此突變是否會被表現。

2.12 蛋白質均質液的萃取 組織：

將米粒大小的組織塊加入250 mL 8M Urea(Sigma, MO)、protease

inhibitor(Roche, Germany)、phosphatase inhibitor(Calbiochem, Germany)混合液 中，用MagNA Lyzer Green Beads(Roche, Gemany)以 6500 rpm、15 秒重複打磨 組織4 次，將混合液移至新微量離心管後，離心 4℃、13000 rpm、30 分鐘，

將上清液再移至新微量離心管，儲存於-80℃。

細胞：

將細胞以冰的1× PBS 清洗兩次，加入 lysis buffer(8M urea 或 Passive lysis buffer) 、protease inhibitor(Roche, Germany)、phosphatase inhibitor(Calbiochem, Germany)，室溫反應 15 分鐘，拍擊培養盤或刮取細胞，將溶液移至新微量離 心管，離心4℃、13000 rpm、10 分鐘，取上清液至新微量離心管，儲存於-80

℃。

17

2.13 蛋白質定量

以Pierce BCA protein assay(Thermo scientific, IL)定量蛋白質，以牛血清白 蛋白(Bovine serum albumin, BSA)序列稀釋成標準液(2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 mg/mL)，於 96 孔盤中加 10 μL 待測液，在加入 200 μL 試劑 A 與試劑 B 的混 合物(50:1)，避光於 37℃反應 30 分鐘後，以 562 nm 光源偵測吸光值，對照標 準液換算出濃度。

2.14蛋白質膠體電泳

SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)

用Hofer 系統做膠，將收好的蛋白質均質液，加入適量 sample dye，使最 終濃度為一倍。於100℃加熱板上加熱 10 分鐘，4℃離心冷卻後注膠。以 60 伏特跑完上膠後，以80、100、125 依次增加伏特數，分開蛋白質。

2.15 西方墨點法

將跑完的 SDS-PAGE 膠體，以卡夾－海綿－濾紙－膠體－膜－濾紙－海 綿－卡夾的順序夾起，以 120 伏特、80 分鐘將蛋白轉印至膜(Amersham Hybond^TM-C Extra membrane)上。以 5％脫脂奶粉的 TBST 封閉(blocking)膜半 小時，後以5％脫脂奶粉的 TBST 溶液適當稀釋一級抗體，將膜與抗體一起封 入塑膠袋中，於4℃反應隔夜(>16 小時)後，取出膜於室溫中以 TBST 溶液清 洗三次，每次10-15 分鐘，再以 5％脫脂奶粉的 TBST 適當比例稀釋之二抗室 溫 下 搖 晃 1.5 小 時 ， 每 次 10 分 鐘 ， 後 以 Western Lightning^○R Plus-ECL substrate(PerkinElmer, MA)呈色，以壓片(FUJIFILM, JP)或是 UVP 偵測訊號。

18

2.16 雙螢光素酶報告基因檢測(Dual-Luciferase Reporter assay)

以Passive lysis buffer 收下細胞，取 15 μg 蛋白質均質液依次加入螢光素 酶檢測試劑II(Luciferase Assay Reagent II, LAR II)及 1× Stop&Glo® 基質，以 Dual-Luciferase®Reporter Assay System(Promega, UK)，分別測得 Luciferase 及 Renilla 兩種螢光值，前者作為基因表現的對照，後者作為均一化的對照。另 外再用定量聚合酶連鎖反應定量各處理組中gDNA 中的 luciferase 作為不同轉 染組別的常態化標準。

19 inhibitory factor receptor, Lifr)，當作一個雌激素受體 α 的目標基因，檢測其

expression pattern，用以反應雌激素受體 α 的在組織中的功能並以雌激素受體 α 剔

20

於50 歲的女性肝細胞癌病患組織抽取 gDNA，在每個外顯子前後設計引子，放大 各外顯子後送定序，比對NCBI 的雌激素受體 α 標準序列 NG_008493.1，發現在一 組臨床檢體中有在第667 個密碼子上有 GA 的單股單核苷酸變異(GGCAGC)，

及在第145 的胺基酸上，甘胺酸(Glycine)變為絲胺酸(Serine)(圖 2.)。而在 cDNA 定 序中也是一樣的情形，確認此變異會被表現，但是在此組檢體中的腫瘤區及非腫

我們認為Foxa1/2 有可能會是一個重要的 co-regulator，是造成在這組病人中造成雌

21

我們接著使用loss of function 的方法，在 HepG2 中 knockdown HNF4α，可以

22

看到顯著的Knockdown，但用雙螢光素酶報告系統無法偵測到雌激素受體 α 功能 有顯著的改變(圖九)。

7. Foxa1/2 能幫助雌激素受體 α 行使轉錄功能並回復 HNF4α 對雌激素受體 α 的

抑制

為了進一步探討Foxa1/2 是否會調控 HNF4α3 對雌激素受體 α 的抑制功能，選 定沒有表現雌激素受體α、HNF4α，及 Foxa1/2 的胚胎肝細胞株 CL-48，轉染雌激 素受體α、HNF4α、Foxa1/2 及具有雌激素反應元件的螢光素酶報告基因，發現增 加Foxa1/2 表現會增加 ERE-Luc 報告基因的表現，且能回復 HNF4α 對雌激素受體 α 的抑制(圖十)，此結果指出，Foxa1/2 可能在 HNF4α 對雌激素受體 α 的調控中扮 演了某個角色。為了更清楚機制，另外在HepG2 使用慢病毒系統 Knock-down Foxa1/2，可使螢光素酶報告基因在未轉染 HNF4α3 時表現量降低，而對轉染 HNF4α3 造成螢光素酶報告基因表現下降的影響不明顯(圖十一)。

23 少[37-39]，此外，Bonzo 等團隊發現剔除 HNF4α 會使肝細胞複製速率增加，且細 胞凋亡的能力降低，因此認為HNF4α 有可能是肝癌的腫瘤抑制基因之一[40]。另 外Santangelo 等團隊發現 HNF4α 可與 HNF1α 共同作用抑制上皮間質轉換

(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的主要基因 Snail 表現，且當抑制 HNF4α 在細胞中的表現量時，會促使EMT 發生，而使腫瘤繼續發展或轉移[41]。在 Hatziapostolo 等團隊的研究中，HNF4α 可透過 MicroRNAs (miR-124,

miR-24,miR-629)建立回饋的調控機制： HNF4α 降低表現，可調控 miR-124 也被 抑制，而使細胞可能透過(IL-6)-IL-6R，增加 STAT3 的表現，進而增加 miR-24 及 miR-629 表現，抑制 HNF4α，而使細胞傾向轉型癌化[39]，也支持 HNF4α 腫瘤抑 制基因的功能。但是，也有研究發現在一些肝癌病患中HNF4α 有上升的現象[42]，

24

HNF4α 在男性肝細胞癌病患中的表現跟分群也值得再探討，檢驗是否 HNF4α 在不同類群的病患中可能扮演相反的角色，看看對肝癌的性別差異是否會有更清 楚的機制的差別。

然而，在HepG2 中 si-HNF4α 並無法使 ERE-Luc 的活性增加。此結果與外送 HNF4α3 的結果並不一致，可能是因為送入的 isoform 為活化的 HNF4α3，而原先 在HepgG2 中，較多的是 HNF4α1/2。在實驗中使用的是經過活性碳萃取過的 FBS，

會去除油性的生長因子，而HNF4α 也是一種脂肪酸，有可能會被去除，而使

25

3.雌激素受體 α 與 HNF4α 的交互作用可能會促成癌症的發生

此研究中HNF4α3 對雌激素受體 α 的抑制作用，可進一步用 ChIP(chromatin immunoprecipitation)檢測 HNF4α3 存在會使雌激素受體 α 結合上 ERE 的數量減少，

確定HNF4α3 對雌激素受體 α 的作用方式。另結合實驗室先前研究，HNF4α3 的功 能及與目標序列(EnhI)結合能力都因加入雌激素受體 α 而降低。綜合兩者結果，推 測①雖然此群病患，兩種已知的腫瘤抑制因子雖都有表現，但因為互相抑制的結 果，卻不具備雌激素受體α 或 HNF4α 對肝癌的保護功能。HNF4α3 與雌激素受體

確定HNF4α3 對雌激素受體 α 的作用方式。另結合實驗室先前研究，HNF4α3 的功 能及與目標序列(EnhI)結合能力都因加入雌激素受體 α 而降低。綜合兩者結果，推 測①雖然此群病患，兩種已知的腫瘤抑制因子雖都有表現，但因為互相抑制的結 果，卻不具備雌激素受體α 或 HNF4α 對肝癌的保護功能。HNF4α3 與雌激素受體