第三章 研究結果
3. 雌激素受體 α 的顯性抑制變體之表現量在腫瘤處未顯著增加
雌 激 素 受 體 為 固 醇 類 受 體 ， 屬 核 受 體 超 家 族 第 三 型(nuclear receptor superfamily class 3)，分布於細胞核及細胞質中，當配體(ligand)與受體結合時，
可使受體形成同型二聚體(homodimer)入核，並結合於兩段直接重複序列，行使 轉錄因子的功能。
雌激素受體具有八個外顯子(exon)，A-F 六個功能性 domain，其中 A/B 及 E domain 分別含有轉活化區(Activation function domain)，AF-1 及 AF-2，分別 位於N 端及配體結合區(Ligand-binding domain)，AF-1 行使配體獨立性轉活化 (ligand-independent transcription activation)，不需與配體結合就可以與一些共同 活化因子(Co-activators)如：AP-1、SP-1 結合，刺激下游目標基因的轉錄；而 AF-2 則行使配體依賴性轉活化(ligand –dependent transcription activation)功能，
在與配體結合作用下，可以活化下游目標基因的轉錄。C domain 為 DNA 結合 區(DNA-binding domain)，具有兩個 Zinc finger motif，用於結合 DNA。樞紐區 (Hinge domain)即 D domain 帶有核定位訊號(nuclear localization signal)幫助雌激 素受體轉位於細胞核中。配體結合區(Ligand-binding domain, LBD)，即 E domain，
為雌激素及其他SERMs(Selective estrogen receptor modulators)的結合位置，可 使雌激素受體與配體結合後活化，行使配體依賴性的轉活化功能。[10, 11]。
目前已發現兩種雌激素受體，分別為雌激素受體α 及雌激素受體 β，此兩 種亞型來自不同基因，雌激素受體α 基因位於人類第六對染色體 q25.1 處，其 中開放讀碼區(open reading frame, ORF)為 1785 個核苷酸可以轉譯為 595 個胺基 酸組成的蛋白；而雌激素受體β 基因則位於人類第 14 對染色體 q23.2，開放讀 碼區含 1590 個核苷酸，可轉譯為 530 個胺基酸的蛋白質。此兩種類型的雌激 素受體在 DNA 結合區有高於九成的相似度，而配體結合區則有五成左右的相 似度[12]，但在各個組織間的分布不同，而扮演不同的角色。在肝臟中的表現 型以雌激素受體α 為主[13]，故本篇將著重於討論雌激素受體 α。
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4. 雌激素受體 α 與肝癌
在2007 年，Naugler 教授團隊在施加 DEN (diethyl nitrosamine)的小鼠肝 癌模式中發現，相對於雌性小鼠，介白質-6(interleukin-6, IL-6)在雄性小鼠中 對的，在樞紐區用arginine、glutamine 或 alanine 取代 302、303 的 lysine 則可 以增加轉活化的功能[18]。而在配體結合區的突變，除了沒有顯著功能的以外，
則是會降低雌激素或其相似物對雌激素受體的結合能力。
在乳癌病患中，雌激素受體α，目前已經發現如：K303R、Y537N/Y537S 的功 能性突變[17]，但乳癌檢體中發現的雌激素受體 α 的突變位置差異大，沒有集 中發生突變的位點。
6. 雌激素受體 α 之變體
雌激素受體α 可因選擇性剪接(alternative splicing)造成不同外顯子缺失的 變體，有些會因為密碼子移位而造成提早終止的截斷型變體(truncated variants)，
其中包含持續活化型(constitutively active form)的變體，如：外顯子－5 缺失；
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以及顯性抑制變體(dominant negative variants)－除了本身沒有辦法行使正常的 功能外，甚至會影響其於正常的雌激素受體的功能。包括：外顯子―3、7 缺失。
圖1、ERα 各種變體示意圖
●外顯子―5 缺失
外顯子―5 缺失喪失配體結合區的功能，且因密碼子移位造成提早終止的 截斷型變體，也沒有AF-2 domain，但有完好的 DNA 結合區，不需配體，可 保持活化狀態，轉活化目標基因[19]。
●外顯子―3 缺失
外顯子－3 可以轉譯成大部分的 DNA 結合區[17]，其缺失使雌激素受體 無法與目標基因的雌激素反應元件結合(estrogen response element, ERE)，但此 種變體與雌激素結合的能力不受影響，且AF-1 仍具有轉活化功能，且會與野 生型形成異雙元體，或與野生型競爭輔助活化因子。在Hela 細胞中，以不同 比例共轉染外顯子－3 缺失型與野生型，[20]可以證實外顯子－3 缺失型變體 對野生型雌激素受體的轉錄抑制作用。
●外顯子－7 缺失
為最常見的雌激素變體[21]，由於缺少 AF-2 及部分的配體結合區，可以 在沒有配體的情況下與野生型結合，干擾野生型結合上DNA，抑制野生型的
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表現，且可隨著外顯子－7 缺失的表現比例增加而加強抑制野生行的功能 [22]。
7. Foxa 家族
Foxa 家族為 Fox(forkhead box)蛋白的其中一群，命名來自，成員 Foxa1、
Foxa2、Foxa3，具有保留性極高的 wing helix DNA binding domain。其結構類 似linker protein H1 及 H5，可使 Foxa 蛋白結合於 DNA 上，但因為特定數個氨 基酸與H1 及 H5 不同，不能聚合 DNA，使其具有解開異染色質(heterochromatin) 的功能，為先驅轉錄因子，調控其他轉錄因子及目標基因的轉錄[23]。
Foxa1 和 Foxa2 又稱 HNF3α 和 HNF3β，兩者功能相似，可互相取代 (functionally redundant)，與胚胎肝臟發育及成體後的代謝平衡相關，入，而 Foxa3 在肝臟的功能則較不重要[24, 25]。
8. 先驅因子 Foxa1/2、雌激素受體 α 與肝癌
先前研究在乳癌細胞中發現在雌激素受體結合位置的附近常會伴隨 Foxa1 之結合[26, 27]，且會結合在雌激素受體的目標基因的啟動子或加強子上，
而 Foxa1 的結合與否雌激素受體結合及調控目標基因的的轉錄扮演重要角色 存在與否會對雌激素受體α 及雄激素受體(androgen receptor, AR)對目標基因的 表現模式(expression profile)產生顯著影響。此結果顯示，Foxa1/2 可能是女性 調控雌激素通路對腫瘤保護作用，以及雄激素通路對男性的致癌性。另外，女
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性肝癌病患中，Foxa2 在目標基因的的結合位置有 SNP 的出現，可能使 Foxa2 對DNA 的結合能力變差，而使雌激素受體 α 對目標基因的調控改變，影響雌 激素受體α 對肝癌的保護能力[25]。
9. 肝細胞核因子 4α(Hepatocyte nuclear factor 4α, HNF4α)與雌激素受體 α
HNF4α 又稱 NR2A1 為一種核受體，由位於 20q13.12 的 HNF4A gene 轉 錄轉譯出，屬於肝富集轉錄因子(Liver enriched transcription factors, LETF)之一，
linoleic acid 已被報導可能為 HNF4 支配體在哺乳類中有內生性配體 linoleic acid―為一種必須脂肪酸[29]，HNF4α 會以同型二聚體結合上 DNA[30]，是肝 中最多的DNA 結合蛋白[31]，可調控胚胎的肝臟發育及肝細胞分化及代謝平衡 [32]，基因剔除鼠。具有 P1 及 P2 兩個啟動子，隨著發育不同時期或在不同器 官表現，可以轉錄出至少六種不同的變體(HNF4α1-3, HNF4α6-9,…)，在成人肝 臟中由P1 轉錄，而在胎兒肝臟則主要使用 P2 啟動子[33]。其蛋白質從 N 端到 C 端一樣可以分為 A-F 六個功能性 domain 與雌激素受體相似，唯 HNF4α 的 F domain(C termainl)有抑制本身功能的作用，所以此 isoformHNF4α3，由於不具 備正常的F domain，HNF4α 可持續呈現活化態[34]。
圖2、HNF4α 各種變體示意圖[35]
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而在實驗室先前研究中以co-IP 發現 HNF4α 可以與雌激素受體 α 的樞紐 區結合，而被雌激素受體α 調控，以螢光素酶報告基因系統測定 HNF4α，其報 告基因也會因加入雌激素受體α 而表現量降低。而 ChIP 的結果發現，加入雌 激素受體α，會減少 HNF4α 結合下游基因的調控元件(regulating element)的數 量[36]，為降低報告基因表現的原因。 受體α 功能性的突變。(2) 顯性抑制變體(dominant negative variants)：在 HCC 中會 增加，主要來自於alternative splicing。(3)輔助調節因子(co-regulator)包括：先驅因 子Foxa1/2 (即肝細胞核因子 HNF3α/β)和肝細胞核因子 4α(HNF4α)，為了此二者對 此群病患雌激素受體功能性下降的關連性。
我們預期此研究可以找到除了雌激素受體α 被 miR-18a 調控減少蛋白質表現 外，其他新的使雌激素受體α 功能性下降的機制。
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第二章 材料與方法 1.材料
1.1 質體
pER, pHNF4Α3, pHNF3B,pcDNA, pERE-Luc, pRenilla si-HNF4α, si-Foxa1, si-Foxa2
1.2 細胞株
Human breast cancer cell line: MCF-7 Human hepatoma cell line :HepG2
Heman embryonic kidney cell line: HEK-293T Normal human embryonic liver cell line: CL-48 1.3 臨床檢體
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(mention the source of the tissues, from TLCN, approved by IRB)
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1.4 抗體
Anti-ERα(F10, sc-8002, Santa Cruz) Anti-Foxa1(gtx100308,Genetex)
Anti-Foxa2( M-20, sc-6554,Santa Cruz) Anti-HNF4Α(H171, sc-8987 Santa Cruz) Anti-HNF4Α N’(NB100-1783, Novus) Anti-β-Actin(C4, sc-47778, Santa Cruz) 1.5 引子
a. ERα:
gDNA 放大及定序：
Sequence Amplicon length
EXON1-F1 CCGTCCTCCAGCACCTTTGTAATG 1151 bp 24 EXON1-R1 CCAAGAGCGGACCTTCCCAAGTG 24 EX1-F CGGTTTCTGAGCCTTCTGCCC 771 bp 21 EXON1-R2 TGCCTCTCGCACGGACGGTAAG 22 EXON2-F GGATAAAGTGGATCTGCTGCATCTCC 351 bp 26 EXON2-R CCTTCCTCAGTCGCTTTGGCTCTTAG 26 EXON3-F2 CAACATAGTAAGGCTGAGGAAGTGATAGG 445 bp 29 EXON3-R2 GCCATGTTAGAATTTCCAGTTCCAGAC 27 EXON4-F2 TCACCTGTGCTTGAAAGTATTTCTTC 534 bp 26 EXON4-R2 CACTATTTCTCCCATGACATCACAAC 26 EXON5-F GACCTTGTCAGTTCAAATCCCTGTTGC 373 bp 27 EXON5-R CACCCCCAATGCACTCTTTTGTTAAG 26 EXON6-F ATGAACCCTTTCATGTCTTGTGGAAG 305 bp 28
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EXON6-R GCCTTTGGAGTGGGTAGATCGTATCTG 27 EXON7-F TGGCTCATTGTTACATCCCATGAACAC 378 bp 27 EXON7-R ACTCTCCATATGCAGGCACCAGTCC 25 EXON8-F GTGTCTTTGGAGTTCCTCTTCCTTCCC 417 bp 27 EXON8-R GACAGAATTTGGCTAAAGTGGTGCATG 27
cDNA 放大及定序(nested)
134F CCTCTAACCTCGGGCTGTGCTC EX1F CGGTTTCTGAGCCTTCTGCCC
1350R GAGGGTCAAATCCACAAAGCC 1275R GGTCAGTAAGCCCATCATCGAAGC
競爭 PCR(competitive PCR)：
6F CTAACTTGCTCTTGGACAGGAACC ER Total-R TCAGACCGTGGCAGGGAAACCC
b. PBGD
PBGD-1070-F CATGAAGATGGCCCTGAGGAT PBGD-1266-R GGCATCTGTGCCCCACAAACCAG
c. Lifr
hLifr-2753F CCACCTGGTCTTGCGAGCCTA hLifr-2870R CACTGCCACTGGGATGAGAATG
d. Foxa1
hFoxa1-327F GAAGATGGAAGGGCATGAAACCA hFoxa1-520R TGGCATAGGACATGTTGAAGGACG
e. Foxa2
hFoxa2-F GAGCAGCTACTATGCAGAGC
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hFoxa2-R ACGACGACATGTTCATGGAG
f. Luciferase
Luc-DNA-F GCACTCTGATTGACAAATACG Luc-DNA-R ATGGAACAACTTTACCGACC
1.6 藥劑
LipofectaminTM2000(Invitrogen, CA)
Genopure plasmid Maxi kit (Roche, Germany) gDNA extraction kit (Geneaid, TW)
SuperScriptTM First Strand Synthesis system(Invitrogen, CA) Estrogen (SIGMA)
2.方法 2.1 細胞培養
以含10% fetal bovine serum (FBS)、1% non-essential amino acids (NEAA)、
1% L-Gultamin- PEN-STREP-AMPHO SOL.的 Dulbecco’s 改良培養基(DMEM) 培養細胞於 37℃、5% CO2的恆溫細胞培養箱中。繼代培養時，以1× PBS 清
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時。取20 μL 菌液塗於含質體帶有的抗生素的洋菜培養基上，於 37℃培養 14-16 小時，挑選單一菌落至含有特定抗生素的LB 培養液 3 mL 培養 12-14 小時後，
轉移至同樣含有抗生素的LB 培養液 200 mL，培養 14-16 個小時後，將菌液 裝入高速離心瓶，用高速離心機(7500 rpm, 20 分鐘)離心後，倒掉上清液，留 下沉澱菌體，以Genome plasmid maxi kit(Roche)抽取質體 DNA，以水或 TE buffer 在 4℃回溶過夜，長期保存於-20℃。
若為si-clone 的質體，則一律改為使用 TB 培養液在 30℃培養。
2.3 轉染(Transfection)
實驗前一天將細胞分成約八分滿，隔天LipofectaminTM2000 以 2.5 μl/1 μg 質體DNA 的比例轉染，先將 LipofectaminTM2000 加入適量的 opti-mem (GIBOCO)中(以六公分盤為例，需 250 μl，按比例增減)，靜置 5 分鐘，另取 等量的opti-mem 加入所需的質體 DNA，後將兩管混合，靜置二十分鐘，混合 10 % FBS 未加抗生素的培養液加入細胞中，六小時後換盤，可換回加抗生素 的培養液，但與賀爾蒙相關實驗，從轉染開始，皆以5%活性碳去除生長因子 後的FBS，加上不具酚紅的 DMEM 培養，以避免干擾。
2.4 RNA 干擾技術之慢病毒製備及感染(RNA interference : lenti-virus package) 實驗前一天先將293T 細胞分為約五成滿，隔天以 LipofectaminTM2000 共 同轉染4μg shRNA、4 μg pCMVΔ8.91、0.4μg pMD.G(10 公分盤)，六小時後換 一般細胞培養液6 mL，24 小時後，取 4 mL 培養液離心 3000 rpm、10 分鐘，
收集於15 mL 離心管中，並將新的 4 mL 的細胞培養液補回盤中，依此收滿三 天，可依據培養液的顏色縮減收取的間隔時間，最後一天將6 mL 全部收取，
儲存於-80℃待用。
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2.5 病毒感染
同細胞繼代，以1× PBS 清洗細胞兩次，後以 0.05% 胰蛋白酶(Trypsin) 處理細胞約一分半鐘於37℃使細胞懸浮，以十倍的培養液中和後，離心 1000 rpm、2 分鐘，取約三天滿量的細胞，加入 polybrene 及含病毒的培養液(8 μg/mL)，
培養隔夜(16 小時以上)，以 1× PBS 清洗細胞兩次，換回正常細胞培養液，72 isopropanol(J.T. Baker, NJ)混合均勻，靜置-80℃沉澱過夜(16 小時)，以 13000 rpm、4℃離心 20 分鐘後，去除上清液，加入 200 μL 70%酒精(MERCK, Germany)，
以13000 rpm、4℃離心 10 分鐘潤洗沉澱物。在抽汽櫃中去除酒精，並待 RNA 風乾後，以DEPC 水回溶於 55℃10 分鐘，以 NanodropR○ 測定濃度，並以 0.8%
瓊膠電泳去確定品質後，儲存於-80℃待用。若要抽取組織 RNA，則加 1 mL Rezol 到 MagNA Lyzer Green Beads(Roche, Gemany)管中，以 6500 rpm、15 秒 重複打磨米粒大小組織4 次，後移至新管加 chloroform，與細胞相同。
2.7 抽取基因體 DNA(gDNA)
將細胞以胰蛋白酶取下，並以培養液中和，以1× PBS 清洗細胞後，以 Cell lysis buffer (Geneaid)加入細胞中(300 μL/107 cells)，在 60℃水浴中反應 10 分鐘，
每三分鐘votex 一次直到透明。加入 RNase A 5μL (10 mg/mL) 靜置室溫 5 分 鐘。加入Protein removal buffer 100 μL，votex 後迅速置於冰上 5 分鐘。以 13000 rpm 離心 5 分鐘，取上清液至新管加入 300 μL 異丙醇(isopropanol)搖勻。再
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離心13000 rpm 5 分鐘，倒掉上清液，後以 70%酒精清洗沉澱，離心 13000 rpm 3 分鐘，去掉上清液，在抽汽櫃中風乾。最後以適當量的水或 TE buffer 在 60
離心13000 rpm 5 分鐘，倒掉上清液，後以 70%酒精清洗沉澱，離心 13000 rpm 3 分鐘，去掉上清液，在抽汽櫃中風乾。最後以適當量的水或 TE buffer 在 60