第三章 研究結果
7. Foxa1/2 能幫助雌激素受體 α 行使轉錄功能並回復 HNF4α 對雌激素受體 α
抑制
為了進一步探討Foxa1/2 是否會調控 HNF4α3 對雌激素受體 α 的抑制功能，選 定沒有表現雌激素受體α、HNF4α，及 Foxa1/2 的胚胎肝細胞株 CL-48，轉染雌激 素受體α、HNF4α、Foxa1/2 及具有雌激素反應元件的螢光素酶報告基因，發現增 加Foxa1/2 表現會增加 ERE-Luc 報告基因的表現，且能回復 HNF4α 對雌激素受體 α 的抑制(圖十)，此結果指出，Foxa1/2 可能在 HNF4α 對雌激素受體 α 的調控中扮 演了某個角色。為了更清楚機制，另外在HepG2 使用慢病毒系統 Knock-down Foxa1/2，可使螢光素酶報告基因在未轉染 HNF4α3 時表現量降低，而對轉染 HNF4α3 造成螢光素酶報告基因表現下降的影響不明顯(圖十一)。
23 少[37-39]，此外，Bonzo 等團隊發現剔除 HNF4α 會使肝細胞複製速率增加，且細 胞凋亡的能力降低，因此認為HNF4α 有可能是肝癌的腫瘤抑制基因之一[40]。另 外Santangelo 等團隊發現 HNF4α 可與 HNF1α 共同作用抑制上皮間質轉換
(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的主要基因 Snail 表現，且當抑制 HNF4α 在細胞中的表現量時，會促使EMT 發生，而使腫瘤繼續發展或轉移[41]。在 Hatziapostolo 等團隊的研究中，HNF4α 可透過 MicroRNAs (miR-124,
miR-24,miR-629)建立回饋的調控機制： HNF4α 降低表現，可調控 miR-124 也被 抑制，而使細胞可能透過(IL-6)-IL-6R，增加 STAT3 的表現，進而增加 miR-24 及 miR-629 表現，抑制 HNF4α，而使細胞傾向轉型癌化[39]，也支持 HNF4α 腫瘤抑 制基因的功能。但是，也有研究發現在一些肝癌病患中HNF4α 有上升的現象[42]，
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HNF4α 在男性肝細胞癌病患中的表現跟分群也值得再探討，檢驗是否 HNF4α 在不同類群的病患中可能扮演相反的角色，看看對肝癌的性別差異是否會有更清 楚的機制的差別。
然而，在HepG2 中 si-HNF4α 並無法使 ERE-Luc 的活性增加。此結果與外送 HNF4α3 的結果並不一致，可能是因為送入的 isoform 為活化的 HNF4α3，而原先 在HepgG2 中，較多的是 HNF4α1/2。在實驗中使用的是經過活性碳萃取過的 FBS，
會去除油性的生長因子，而HNF4α 也是一種脂肪酸，有可能會被去除，而使
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3.雌激素受體 α 與 HNF4α 的交互作用可能會促成癌症的發生
此研究中HNF4α3 對雌激素受體 α 的抑制作用，可進一步用 ChIP(chromatin immunoprecipitation)檢測 HNF4α3 存在會使雌激素受體 α 結合上 ERE 的數量減少，
確定HNF4α3 對雌激素受體 α 的作用方式。另結合實驗室先前研究，HNF4α3 的功 能及與目標序列(EnhI)結合能力都因加入雌激素受體 α 而降低。綜合兩者結果，推 測①雖然此群病患，兩種已知的腫瘤抑制因子雖都有表現，但因為互相抑制的結 果，卻不具備雌激素受體α 或 HNF4α 對肝癌的保護功能。HNF4α3 與雌激素受體 α 結合後是否能夠結合特定的序列，行使轉錄因子的作用，可用 ChIP 探討。
欲進一步證明，此機制的致癌性，In vitro 可先將肝細胞株轉染不同劑量的雌 激素受體及HNF4α3，再用 cell proliferation assay 及 soft agar colony forming assay，
挑出生長速度有顯著增加或長出群落(colony)的組別。
4.其他能與雌激素受體 α 結合調控雌激素受體 α 的因子
除HNF4α 外，其他共同因子也有可能用一樣的方法，抑制雌激素受體 α 的下 游基因的能力與轉錄因子如AP-1(activator protein-1)及 SP1 (Specific Protein-1)等可 與雌激素受體α 形成異型二聚體(heterodimer)，與本身的 DNA 結合序列結合，調 控其下游基因[43]。而 NF-ΚB (Nuclear Factor-KappaB)則是與雌激素受體 α 結合後，
無法結合於IL-6 的啟動子，使 IL-6 無法表現[12]，與雌激素受體對 HNF4α 的影響 類似，皆會使轉錄因子在蛋白質存在的情況下，無法行使本身的轉錄功能，這些 因子跟雌激素受體轉錄因子能力下降的關係可留待日後研究。
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5.總結及建議
此研究找到在女性肝細胞癌中除了透過miR-18a 抑制雌激素受體 α 蛋白質表 現量以外，另一種減少雌激素受體α 保護作用的機制，也剔除了較為不可能的機 轉包括：雌激素受體α 的體突變及負向抑制變體的調控。
然而，為了確認在女性肝細胞癌中雌激素受體α 的功能正常與否，只用 Lifr 這個目標基因的表現量來判定，略顯不足，因在Okamura 等團隊在 2010 年發現在 部分的HCC 病患中(23/48, 47.9%) Lifr 的啟動子會增加甲基化，進而抑制 Lifr 的轉 錄，認為Lifr 為一個 HCC 可能的腫瘤抑制基因[44]，所以其表現量下降，可能並 非只來自雌激素受體的調控。另外，所增生的HNF4α 究竟是哪一型？不同的 HNF4α 變體是否在肝細胞癌的過程中扮演相反的角色？還需要更進一步的透過實驗釐 清。
6. 臨床上的應用與重要性
此研究所找到的減少雌激素路徑對女性肝細胞癌的不同的保護機制，可能可 以藉此分類出不同機轉間，不同進程及預後的估計，達到診斷分群的可能性，進 一步可能發展出可阻斷特定分群中腫瘤形成的標的。
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圖附錄：
圖一、Lifr 的表現量
(a)經抽取 RNA、RT 後；以定量聚合酶連鎖反應測定在正常小鼠(wt, n=4)及雌激素 受體α 剔除小鼠(ERKO,n=3)肝臟中 ERα 的目標基因 Lifr 的表現量。在雌激素受體 剔除小鼠中Lifr 的表現量約降低為正常小鼠的一半。
(b)在年輕女性肝細胞癌患者(年齡≤50)中以 ERα(T/N≥0.5,n=16 分為 ER unchanged 組及ERα decreased 組(T/N<0.5, n=10)，分別用定量聚合酶連鎖反應測定基因 Lifr 的表現情形，N2-N5 為女性 Hemangioma 非腫瘤區抽取的 RNA 當作正常控制組。
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圖二、定序17 個女性肝細胞癌檢體找到的一個單股單核苷酸變異。
將此 17 個檢體的腫瘤區按照外顯子順序，分別定序其 gDNA，在 1965 這個 檢體之中的667GA，再定序非腫瘤區做為對照。
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圖三、以競爭性聚合酶連鎖反應探測外顯子－7 之表現 (a) 競爭性聚合酶連鎖反應引子設計及放大片段長度
(b) 取 12 對年輕(年齡≤50)且 ERα 蛋白質沒有顯著下降的(T/N≥0.5)的女性肝細 胞癌肝組織取RNA，RT 後進行競爭性聚合酶連鎖反應，得到的野生型及外顯 子－7 缺失的雌激素受體 α，MCF-7 為正控制組。―為負控制組。N2-N5 為女 性Hemangioma 非腫瘤區抽取的 RNA 當作正常控制組。
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圖四、ERα 在臨床檢體中的表現情形
代表性西方點墨法偵測之雌激素受體α 表現量，以總蛋白 50 μg，10%跑膠。下方 數字為以MCF-7 50μg 為準，定量後的數值。
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(a)
(b)
圖五、Foxa1/2 在臨床檢體中的表現情形
(a)以西方墨點法偵測 Foxa1/2 表現量，以 MCF-7 為控制組定量。(b)分析 ER 有明 顯下降的(n=8)無明顯下降的組別(n=17)中的差異，上兩圖為 Foxa1，而下圖為 Foxa2 的分析。左以T/N 的倍數差異作圖；右以 log2 做點狀分布圖。
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(a)
圖六、 HNF4α 在臨床檢體中的表現情形
(a)以西方墨點法偵測臨床檢體 HNF4α 表現量之代表結果，以 HepG2 為控制組定 量。(b)分析 ER 有明顯下降的(n=8)無明顯下降的組別(n=17)中的差異。左以 T/N 的倍數差異作圖；右以log2 做點狀分布圖。
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圖七、在MCF-7 中加強 HNF4α3 表現對內生性雌激素受體 α 的影響
轉染HNF4α3 及雌激素受體 α 報告基因系統進 MCF-7 細胞，可以看到雌激素受體 α 的報告基因表現加強 HNF4α3 表現之組別有顯著的降低。下以西方點墨法當作轉 染效率的對照。
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圖八、Over-express HNF4α3 對雌激素受體 α 的抑制能力及劑量依賴性
(a)將固定量的雌激素受體 α 及 HNF4α3 送入 HepG2 細胞株中，以雙螢光素酶報告 基因系統測ERα 報告基因的表現量，並用西方墨點法當作轉染效率的對照。(b) 將 表現固定量的雌激素受體α 及等比增加的 HNF4α3 送入 HepG2 細胞株中，以雙螢 光素酶報告基因系統測ERα 報告基因的表現量，並用西方墨點法當作轉染效率的 對照等比增加。
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圖九、在HepG2 中，si-HNF4α 對抑制雌激素受體 α 的能力的影響
以慢病毒系統knockdown HepG2 裡 HNF4α 的表現，轉染 ERα 後用雙螢光素酶系 統，看ERE-Luc 的 RLV 值的變化，並以西方墨點法確定 knockdown 效率。
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圖十、在CL-48 中，Foxa2 對 HNF4α3 抑制雌激素受體 α 的影響
圖十、在CL-48 中，Foxa2 對 HNF4α3 抑制雌激素受體 α 的影響