第三章 研究結果
第二節 推論性統計分析
第二節第二節 推論性統計分析推論性統計分析推論性統計分析推論性統計分析
本實驗為一 in vitro 研究，利用已知的 6-OHDA PD 模型，探討 resistin 是否具有神經保護的作用，並推論在相同的條件下其它的 dopaminergic 細胞也會有一樣的變化。
圖 6-1
6-OHDA 引起細胞死亡及形態上的破壞。細胞先經過不同濃度的 6-OHDA 處理 24 小時，然後利用 MTT 分析法(A)，SRB 分析法(B) 及 LDH 分析法(C)來分析細胞的存活率。結果以 means ± SEM 表示，
n=4。
圖 6-2
MES23.5 細胞經過 resistin 及 6-OHDA 處理後在 phase-contrast 顯微鏡 下觀察到的變化。細胞經過 vehicle，resistin 5 ng/ml，6-OHDA 75 µM 的處理，或是先經過 5 ng/ml 的 resistin 處理 1 小時，然後再加入 6-OHDA 75 µM 繼續處理 24 小時。Scale bar: 50 µm。
圖 6-3
Resistin 減少 6-OHDA 引起的細胞死亡。細胞先經過不同的 resistin 濃度處理 1 小時，然後再加入 6-OHDA 繼續處理 24 小時，之後利用 MTT 分析法(A)，SRB 分析法(B)及 LDH 分析法(C)來分析細胞的存活 率。結果以 means ± SEM 表示，n=4。*與控制組相比 p＜0.05；#與 6-OHDA 組相比 p＜0.05。
圖 7-1
在螢光顯微鏡下利用 Hoechst 染色觀察到的細胞外觀變化。細胞經過 vehicle，resistin 5 ng/ml 或 6-OHDA 75 µM 的處理，或是先經過 5 ng/ml 的 resistin 處理 1 小時，然後再加入 6-OHDA 75 µM 繼續處理 24 小時。
箭號表示細胞內染色質濃縮。
圖 7-2
Annexin V 及 PI 的流式細胞儀雙染分析。將 MES23.5 細胞株置放在 不同條件下(經過 vehicle，resistin 5 ng/ml 或 6-OHDA 75 µM 的處理，
或是先經過 2 ng/ml，5 ng/ml 或 10 ng/ml 的 resistin 處理 1 小時，然後 再加入 6-OHDA 75 µM 繼續處理 24 小時)， 然後以流式細胞儀利用 Annexin V 與 PI 雙染法分析，觀察 apoptosis 之變化。Q2 區代表 late apoptosis，Q4 區代表 early apoptosis。
圖 8
6-OHDA 會增加 MES23.5 細胞株的活性氧化物生成量，而將細胞前 處理 resistin 會抑制此現象。(A) 細胞經過 vehicle，resistin 5 ng/ml 或 6-OHDA 75 µM 的處理，或是先經過 5 ng/ml 的 resistin 處理 1 小時，
然後再加入 6-OHDA 75 µM 繼續處理 24 小時。活性氧化物生成量的 變化是將細胞以 DCFH-DA 染色，然後在 20 倍螢光顯微鏡下觀測。
(B)以流式細胞儀定量在不同條件下活性氧化物生成量。結果以 means
± SEM 表示，n=4。*與控制組相比 p＜0.05；#與 resistin 組相比 p＜
0.05。
圖 9
6-OHDA 會減少 MES23.5 細胞株的粒線體膜電位，而將細胞先行以 resistin 前處理會抑制此現象。(A) 細胞經過 vehicle，resistin 5 ng/ml 或 6-OHDA 75 µM 處理，或是先經過 5 ng/ml 的 resistin 處理 1 小時，
然後再加入 6-OHDA 75 µM 繼續處理 24 小時。粒線體膜電位的變化 是將細胞以 Rh123 染色，然後在 20 倍螢光顯微鏡下觀測。(B)以流式 細胞儀定量在不同條件下的粒線體膜電位。結果以 means ± SEM 表 示，n=4。*與控制組相比 p＜0.05；#與 resistin 組相比 p＜0.05。
圖 10
以 Western blot 分析 6-OHDA 與 resistin 對於 apoptosis 相關蛋白質表 現量的影響。加入 6-OHDA (75 µM) 會減少 Bcl-2 表現量，但是會增 加 Bax，cleaved PARP-1 及 cleaved caspase 3 的量。將細胞先行經過 不同濃度的 resistin 處理 (2 ng/ml，5 ng/ml 或 10 ng/ml) 再加入 6-OHDA 會抑制這些變化 (n=3)。
圖 11-1
以 Western blot 分析不同濃度的 resistin 對於三種細胞保護蛋白質表現 量的影響。將 MES23.5 細胞株經過不同濃度的 resistin 處理 24 小時，
結果發現 Hsp 73，HO-1 及 Bcl-2 的表現量都增加 (n=3)。
圖 11-2
以 Western blot 分析 resistin 經過不同時間後對於三種細胞保護蛋白質 表現量的影響。將 MES23.5 細胞株經過 5 ng/ml 的 resistin 處理不同 時間，結果發現 Hsp 73，HO-1 及 Bcl-2 的表現量都增加 (n=3)。
圖 12-1
以 MTT 分析法分析 resistin 經由 heat shock protein 的表現而抑制 6-OHDA 所引起的細胞死亡現象。將細胞經過不同濃度的 ZnPP IX (0.1 或 0.3 mM) 或 KNK 437(25 或 50 µM)處理 30 分鐘，接著加入 resistin 5 ng/ml 處理 1 小時，然後再加入 6-OHDA 繼續處理 24 小時，
再以 MTT 分析法觀察細胞存活率。*與控制組相比 p＜0.05；#與 6-OHDA 組相比 p＜0.05。
圖 12-2
以 SRB 分析法分析 resistin 經由 heat shock protein 的表現而抑制 6-OHDA 所引起的細胞死亡現象。將細胞經過不同濃度的 ZnPP IX (0.1 或 0.3 mM) 或 KNK 437 (25 或 50 µM)處理 30 分鐘，接著加入 resistin 5 ng/ml 處理 1 小時，然後再加入 6-OHDA 繼續處理 24 小時，
再以 SRB 分析法觀察細胞存活率。*與控制組相比 p＜0.05；#與 6-OHDA 組相比 p＜0.05。
圖 12-3
以 LDH 分析法分析 resistin 經由 heat shock protein 的表現而抑制 6-OHDA 所引起的細胞死亡現象。將細胞經過不同濃度的 ZnPP IX (0.1 或 0.3 mM) 或 KNK 437 (25 或 50 µM)處理 30 分鐘，接著加入 resistin 5 ng/ml 處理 1 小時，然後再加入 6-OHDA 繼續處理 24 小時，
再以 LDH 分析法觀察細胞存活率。#與 6-OHDA 組相比 p＜0.05。
第四
peptides(Pan et al. 2006)。如前所述，leptin 及 adiponectin 屬於脂肪激 素，原先認為它們只與能量平衡有關，但是後續的研究發現 leptin 與 lymphocytes(Howard et al. 1999)，pancreatic β-cells(Shimabukuro et al.1998)及 hepatic stellate cells(Saxena et al. 2004)等，而在 cancer cell lines 的實驗中也證實 leptin 可減少癌細胞(Russo et al. 2004)或神經細胞 (Guo et al. 2008) 的 死 亡 ， 而 其 中 參 與 的 訊 息 傳 遞 路 徑 (signaling pathway)包括 JAK-STAT，PI3K/Akt 及 MAPK/ERK 等。
Adiponectin 是另一種被證實具神經保護作用的脂肪激素，在 in vitro 的實驗中，將adiponectin 加入 primary hippocampal neuron，可 保護 neuron 受 kainic acid(一種 glutamate 的衍生物)所引起的細胞凋
亡現象(Qiu et al. 2011)，而 adiponectin 也可以保護 SH-SY5Y 細胞株 長激素分泌受體(Growth hormone secretagogue receptor，GHS-R)，
ghrelin 與其結合後會刺激進食增加體重，此外更具有增加脂肪貯存 (mitochondrial dysfunction)是可能的機轉(Lin et al. 2009)。MES23.5 細 胞株具有 dopaminergic 細胞的特色，利用 6-OHDA 與 dopamine 結構 的相似性，將 6-OHDA 加入此細胞株後，6-OHDA 會被細胞經由
dopamine transporter 吸收，增加活性氧化物生成以及破壞粒線體電子 傳遞鏈，造成細胞死亡。如果先加入 resistin 到細胞再加入 6-OHDA，
此細胞損傷或死亡的比例會降低。
由細胞存活率分析法(MTT，SRB 及 LDH 分析法)我們可得知 6-OHDA 確實可減少 MES23.5 細胞存活率，而且在相位差顯微鏡下 觀察可發現神經細胞的 neurites 幾乎完全消失；然而細胞如果先經過 resistin 前處理再加入 6-OHDA，則可發現這些現象的程度較不嚴重，
因此可證明 resistin 確實有保護神經細胞的效果。經由 PI 與 Annexin V-FITC 雙染流式細胞儀分析可知，6-OHDA 會使細胞分布趨向細胞 凋亡的象限(Q2 及 Q4)，且由本實驗可知，6-OHDA 會引起活性氧化 物增加及造成粒線體受損(由粒線體膜電位減少推論而來)，而此兩種 現象都會因為細胞凋亡而產生，再加上 6-OHDA 會減少抗細胞凋亡 蛋白質 Bcl-2 及增加促細胞凋亡蛋白質 Bax 的表現量，而且 cleaved PARP-1 及 cleaved caspase-3 的表現量都會增加，這些現象更加佐證 細胞凋亡的產生，故 6-OHDA 引起的神經細胞死亡較有可能的機轉 為細胞凋亡。如果先將 MES23.5 細胞經過 resistin 前處理再加入 6-OHDA，則以上細胞凋亡的現象皆 會被抑制，且最佳濃度為 5 ng/ml。由以上結果可推論，resistin 具有抑制 6-OHDA 引發的細胞凋 亡的效果。
三三
三三、、、 Resistin 與細胞保護蛋白質的討論、 與細胞保護蛋白質的討論與細胞保護蛋白質的討論 與細胞保護蛋白質的討論
本實驗證明 resistin 會增加 Bcl-2，HSP73(HSP70)及 HO-1(HSP32) 的表現量。Bcl-2 是一種抗細胞凋亡的蛋白質，其主要作用為抑制促 細胞凋亡蛋白質的作用，而達到保護細胞的效果。熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是一種壓力性蛋白質，能被許多外在壓力所引 發，如：感染，抗癌藥物，氧化壓力(Morimoto et al. 1992)等等，在 動物實驗中被證明能減少腦部及心肌缺氧的程度(Plumier et al. 1997;
Trost et al. 1998)，且具有抑制細胞凋亡的作用(Li et al. 2000)。
細胞凋亡有一個很重要的現象，就是促細胞凋亡的 Bcl-2 家族蛋 白質(如：Bax)在粒線體外膜開孔，造成通透性(mitochondrial outer membrane permeability，MOMP)增加，使得粒線體內的促細胞凋亡因 子(如：cytochrome c)滲出至粒線體外。Bcl-2 則是抗細胞凋亡 Bcl-2 家族的代表，藉由抑制促細胞凋亡蛋白質的作用來維持粒線體外膜的 完整性，進而抑制細胞凋亡現象的產生。
有文獻提出 HSP73 抑制細胞凋亡的作用可分成三個層級(Lanneau et al. 2007)，首先是粒線體前層級(pre-mitochondrial level)，HSP73 可 結合至 c-Jun N-terminal kinase(JNK)上，抑制其作用，進而防止 caspase-3 的活化；在粒線體層級(mitochondrial level)，HSP73 可以抑 制 Bax translocation 至粒線體外膜，防止 cytochrome c 自粒線體釋放
出來；在粒線體後層級(post-mitochondrial level)，HSP73 可直接與 Apaf-1 結合，防止其與 procaspase 9 形成 apoptosome。
HO-1，亦稱為 HSP32，是另外一種具有細胞保護作用的蛋白質，
可將 heme 轉變成 biliverdin，carbon monoxide(CO)及 iron。神經細胞 只含有極少濃度的 antioxidants，如 glutathione(GSH)，而 biliverdin 及 它的代謝產物 bilirubin 具有 antioxidant 的功能，故在氧化壓力下，可 提供抗氧化的作用(Nimura et al. 1996)。由於外加的 CO 具有類似 HO-1 的細胞保護作用，故目前認為 HO-1 是藉由 CO 而達成細胞保 護的效果(Brouard et al. 2000)。細胞凋亡可以由許多具細胞毒性的因 子所誘發，以 tumor necrosis factor(TNF)為例，其與 TNF receptor 結 合 後 會 形 成 complex I ， HO-1 可 與 之 活 化 nuclear factor kappa B(NF-κB)，進入細胞核後與 DNA 結合，再活化抗細胞凋亡的基因 (Brouard et al. 2002)。另一方面，TNF 與 TNF receptor 結合後會形成 另一 protein complex 稱為 complex II，其與 Fas-associated death domain 及 caspase 8 結合後會活化 caspase 8，進而引發細胞凋亡的反應，而 Complex II 也會經由 JNK 而持續活化 caspase 8。HO-1 會活化 p38 mitogen-activated protein kinase(MAPK) 路 徑 ， 然 後 經 由 phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K/Akt)路徑而活化 Bcl-xL 和 Bcl-2，
達到抗細胞凋亡的效果(Katori et al. 2002)。
如果加入 ZnPP IX 及 KNK 437(分別是 HO-1 及 HSP 的抑制劑)，
則原先 resistin 所呈現的神經保護作用在細胞存活率分析法的檢測下 皆呈現下降的變化，由此可推論，HO-1 及 HSP73 為 resistin 能夠有 神經保護作用所必需。
四四
四四、、、 Resistin 神經保護作用的可能機轉、 神經保護作用的可能機轉神經保護作用的可能機轉 神經保護作用的可能機轉
綜合以上的討論結果，我們可以推論 resistin 神經保護作用的可能 機轉為：Resistin 透過增加 HSP73 及 HO-1 的表現量，然後經過對抗 氧化壓力及抗細胞凋亡的機制，達到神經保護的作用。對於 resistin 增加 HO-1 及 HSP73 的訊息調節機制還需要更多實驗證實。
第二節第二節
第二節第二節 其他相關性討論其他相關性討論其他相關性討論其他相關性討論
目 前 Parkinson’s disease 的 治 療 藥 物 主 要 是 左 旋 多 巴 (L-3,4-dihydroxyphenylalanine， levodopa)，藉由其 可通過血腦屏障 (blood-brain barrier，BBB)的特性進入中樞神經系統，然後轉換成 dopamine，補充 PD 病人 dopamine 的不足；然而左旋多巴也有其副 作用在，長期使用會產生情緒激動，腸胃障礙，不隨意運動等情形，
或引起「開關現象」發作，此時病人會不能運動數秒或數分鐘，此外 在用藥約 8 年後可能會出現神智混亂的副作用(Jankovic 1999)。在外 科手術方面，治療方法有三種：損毀術（切除）、深部腦刺激術（DBS）
研究階段(Arenas 2010; Foltynie et al. 2010)。本實驗的結果提供另外一 種 PD 的可能治療方向，HSP73 及 HO-1 皆為內生性的神經保護蛋白 質，藉由 resistin 的神經保護作用可能是經由 HSP73 及 HO-1 的結論，
研究階段(Arenas 2010; Foltynie et al. 2010)。本實驗的結果提供另外一 種 PD 的可能治療方向，HSP73 及 HO-1 皆為內生性的神經保護蛋白 質，藉由 resistin 的神經保護作用可能是經由 HSP73 及 HO-1 的結論，