第一章 前言
第二節 研究目的
第二節 第二節
第二節 研究目的研究目的研究目的研究目的
Resistin 是一種脂肪激素，與大多數的脂肪激素一樣 (如 leptin 及 adipokinectin)，主要是與體內能量平衡有關。除了脂肪激素以外，胃 部所分泌的一種叫做 ghrelin 的 peptide 也與能量平衡有關，主要是促 進食慾。在 leptin，adiponectin 及 ghrelin 相繼被發現與神經保護有關 以後，目前並沒有 resistin 與神經保護作用有關的文獻，因此本論文 要探討 resistin 的神經保護作用。
本研究的目的在於利用已知的 6-OHDA 實驗室模型，初步探討 resistin 是否具有神經保護的作用。此模型為利用 6-OHDA 作為神經 毒素，觀察在先行以 resistin 處理的 dopaminergic 細胞加入 6-OHDA，
是否會降低神經毒性，之後再推論其可能的途徑。此結果可作為更進 一步研究 resistin 的作用的基礎，並能對於 PD 的治療提供一個潛在 的新方向。
圖 1
6-hydroxydopamine (6-OHDA)是一種 dopamine 的衍生物，在結構上 比 dopamine 多 了 一 個 hydroxyl group (Adapted from Wikimedia Commons website)。
Dopamine 6-hydroxydopamine
圖 2
6-OHDA 藉 著 其 與 dopamine 結 構 上 的 相 似 性 經 由 dopamine transporter 進入細胞。一旦進入細胞，6-OHDA 會促進活性氧化物的 生成，並抑制粒線體的電子傳遞鏈活性，造成細胞毒性 (Adapted from Schober 2004)。
圖 3
人體的能量平衡與攝食行為受到許多蛋白質的調控，包括內分泌及脂 肪激素都與其有關 (Adapted from Gale et al. 2004)。
圖 4
在老鼠體內 resistin 由脂肪組織製造，在肝臟能增加糖新生作用，使 血糖升高，在周邊肌肉組織能減低其在 insulin 刺激下的糖分攝取作 用，產生胰島素抗性 (Adapted from Steppan et al. 2004)。
圖 5
細胞凋亡的啟動機制一般分成外路徑與內路徑，而其最終皆走向執行 路徑，活化 caspase 3，造成細胞凋亡 (Adapted from Elmore 2007)。
第二章 第二章 第二章
College of Medicine, Texas, USA)所提供。MES23.5 是由小鼠 N18TG2 細 胞 (neuroblastoma-glioma cell) 與 大 鼠 中 腦 神 經 元 (mesencephalicResistin 購自 PeproTech(Rocky Hill，NJ)。
Fetal bovine serum(FBS) ， LipofectamineTM 2000(LF2000) ， Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM) ， DMEM/F12 及 OPTI-MEM 購 自 Gibco BRL(Invitrogen Life Technologies ， Carlsbad，CA)。
Goat anti-mouse 和 anti-rabbit horseradish peroxidase-conjugated IgG，primary antibodies against Bax, Bcl-2, β-actin 及 PARP1/2 購 自 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。
Primary antibody against cleavage caspase-3 購自 Cell Signaling
and Neuroscience(Danvers，MA)。
Primary antibodies against HSP73 及 HO-1 購 自 StressGen Biotechnologies(Victoria，BC，Canada)。
Znpp IX 及 KNK 437 購自 Calbiochem(San Diego，CA)。
其它的試劑購自 Sigma-Aldrich(St Louis，MO)。
第二節第二節
Medium: Nutrient Mixture F12 (DMEM/F12)中，同時給予 5% fetal bovine serum (FBS) 與 100 U/ml penicillin 及 100 mg/ml streptomycin，於 5% CO2及 95% air，溫度為 37 ℃的細胞培養箱 中培養，每隔 2 天，當細胞快長滿時，再以 Trypsin-EDTA 處理，
更換一次培養液，收集細胞做進一步實驗或繼代培養(subculture)。
(二二二)二 細胞存活率分析細胞存活率分析細胞存活率分析細胞存活率分析
MTT 分析法分析法分析法分析法
MTT ， 即 3-[4,5,-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide，為一種黃色化合物，可作用在活細胞粒線體上，一旦被粒 線體內膜上的琥珀酸去氫酶(succinate dehydrogenase)還原，會形成紫 色顆粒狀的 formazan 結晶，溶在 DMSO 中成為紫色溶液，而死亡的 細胞因不含琥珀酸去氫酶，故無法形成此結晶。然後利用分光光譜儀 (spectrophotometer)在波長 500 和 600 nm 之間測其吸光值定量，可代 表細胞之活性(Hansen et al. 1989)。實驗步驟如下：將細胞置入 96-well plate 中，依實驗所需以不同濃度的 resistin，6-OHDA，HO-1 抑制劑 ZnPP IX 及 HSP 抑制劑 KNK 437 處理細胞 24 小時後，再以 PBS (PH 7.4)清洗。然後每個 well 加入 20 µl 濃度為 0.5 mg/ml 的 MTT 溶液，
放置在細胞培養箱中。1 小時後取出，小心地將黃色的 MTT 溶液抽 走，再加入 200 µl DMSO 於每個 well 中，以震盪器搖動約 10 分鐘，
使 formazan 結晶完全溶解。之後將 microplate 中的每一個 well 之吸 光值以 microplate reader(Bio-Tek, Winooski, VT)讀取(波長 550 nm)。
SRB 分析法分析法分析法分析法
SRB(sulforhodamine B)是一種粉紅色染劑，可與被 trichloroacetic acid(TCA)固定住的細胞的蛋白質結合，間接代表活細胞的總量，然 後在分光光譜儀下測定其吸光值來代表細胞的存活率(Skehan et al.
1990)。實驗步驟如下：將細胞置入 96-well plate 中，依實驗所需以不 同濃度的 resistin，6-OHDA，HO-1 抑制劑 ZnPP IX 及 HSP 抑制劑 KNK 437 處理細胞 24 小時或 48 小時後，加入 10%的 TCA 在 4℃下 固定細胞一小時，然後緩慢地在自來水下沖洗四次。接下來在每個 well 中加入 0.4%的 SRB，30 分鐘後用 1%的 acetic acid 洗掉未與細胞 結合的 SRB，而與細胞結合的 SRB 則以 200 µl 濃度為 10 mM 的 Trizma base 溶液洗出，然後利用 microplate reader 測定其在波長為 515 nm 下的吸光值。
LDH 分析法分析法分析法分析法
Lactate dehydrogenase(LDH)是存在於細胞質中的一種脢，當細胞 死亡或受到破壞時，會自細胞質釋放出來至培養夜，因此測量培養夜 中的 LDH 可作為細胞膜完整性的指標，間接代表測試藥物的細胞毒 性，反之測量細胞溶解物中的 LDH 則可代表細胞活性。藉由 lactate
氧化成 pyruvate 的過程可將 NAD+還原成 NADH，而 LDH 可催化此 過程；接著 diaphorase 可利用此新生成的 NADH 來催化 tetrazolium salt(INT)還原成 formazan，然後在 490 nm 至 520 nm 波長下測其吸光 值，間接代表 LDH 的量(Wolterbeek et al. 2005)。此實驗使用 LDH cytotoxicity assay kit(Promega，USA)，實驗步驟如下：將細胞置入 96-well plate 中，依實驗所需以不同濃度的 resistin，6-OHDA，HO-1 抑制劑 ZnPP IX 及 HSP 抑制劑 KNK 437 處理細胞 24 小時或 48 小時 後，以離心機離心 4 分鐘，取出 50 µl 上清液放置另一 96-well plate 中，然後加入 50 µl 的 substrate mixture，在避光的條件下使其作用 30 分鐘後加入 stop solution，接著利用 microplate reader 測其在波長 450 nm 的吸光值。
(三三三)三 DNA 螢光染色顯微鏡觀察螢光染色顯微鏡觀察螢光染色顯微鏡觀察螢光染色顯微鏡觀察
Hoechst dye 是一種藍色螢光的染劑，可穿透細胞膜進入細胞內而 染在 DNA 上，對於 DNA 的結構變化及染色質的形態改變敏感，因 此普遍被用來偵測 DNA 的傷害程度(Ellwart et al. 1990)。實驗步驟如 下：將細胞經過 vehicle，resistin 5 ng/ml 或 6-OHDA 75 µM 的處理，
或是先經過 5 ng/ml 的 resistin 處理 1 小時，然後再加入 6-OHDA 75 µM 繼續處理 2 小時，接下來加入濃度為 1 µg/ml 的 Hoechst 33258 染劑，
在室溫下使其作用 10 分鐘，然後在螢光顯微鏡下觀察其外觀的變化。
(四四四)四 流式細胞儀分析流式細胞儀分析流式細胞儀分析流式細胞儀分析
流式細胞儀技術(flow cytometry)是一種能觀測細胞在流體狀態下 運動的方法，將單一細胞被雷射光激發所產生的光學訊號轉換成電子 訊號後，被電腦所偵測，分析細胞的顆粒與特性。利用可震盪的噴嘴 (vibration nozzle)將含有細胞的水柱分裂成只含有單一細胞的水滴，並 加上正電或負電荷，在高壓電場下使水滴偏折，篩選所要的細胞，若 以特殊染劑染在細胞上，則流式細胞儀可利用不同激光波長將不同染 劑的細胞分類。
PI 與與與與 Annexin V-FITC 雙染分析雙染分析雙染分析雙染分析
此實驗利用 propidium iodide(PI)及 Annexin V 將細胞雙重染色，
利用流式細胞儀區分染有 PI 或 Annexin V 的細胞。PI 是一種能染在 DNA 及 RNA 上的染劑，本身無法通過細胞膜，但是細胞死亡(凋亡 或壞死)時細胞膜失去完整性，PI 就可進入細胞。Annexin V 是一種能 與磷脂(phospholipid)結合的蛋白質，磷脂絲胺酸（phosphatidylserine，
PS）即是一種磷脂，位於細胞膜內側面，在細胞凋亡初期時會外翻至 外側面，可以被 Annexin V 結合，若 Annexin V 先接上螢光染劑(如：
fluorescein isothiocyanate，FITC)再與 PS 結合，則可利用流式細胞儀 區分出來。實驗步驟如下：將細胞培養於 37℃，5% CO2 條件下 24 小時，然後經過 vehicle，resistin 5 ng/ml 或 6-OHDA 75 µM 的處理，
或是先經過 2 ng/ml，5 ng/ml 或 10 ng/ml 的 resistin 處理 1 小時，然後 再加入 6-OHDA 75 µM 繼續處理 24 小時。接著加入濃度為 0.025 µg /ml 的 FITC-Annexin V，將此細胞及染劑的混合液於室溫下避光置放 10 分鐘後用 PBS 沖洗，以離心機離心後加入 10 µg 濃度為 1 µg /ml 的 PI，再利用流式細胞儀分析其結果。
(五五五)五 活性氧化物活性氧化物活性氧化物活性氧化物生成量分析生成量分析生成量分析生成量分析
活性氧化物(reactive oxygen species，ROS)是氧化代謝作用的中間 產 物 ， 其生 成 量可 利 用 螢光 染 色法 加 以 監測， 常使 用 的 染劑 為 2',7'-dichlorfluorescein-diacetate(DCFH-DA)，本身不發螢光，在穿過 細 胞 膜 後 被 酯 酶 (esterase) 去 乙 醯 化 (deacetylated) 成 為 2',7'-dichlorfluorescein(DCFH)，然後被活性氧化物轉為具螢光性的 DCF。實驗步驟如下：細胞經過 vehicle，resistin 5 ng/ml 或 6-OHDA 75 µM 的處理，或是先經過 5 ng/ml 的 resistin 處理 1 小時，然後再加入 6-OHDA 75 µM 繼續處理 24 小時，之後將含有細胞之培養液離心，
吸掉上清液，加入 10 µM 的 DCFH-DA，於室溫下置放 30 分鐘，然 後在 20 倍螢光顯微鏡下觀察，接著利用流式細胞儀定量在不同條件 下的 DCF 產量，即代表活性氧化物生成量。
(六六六)六 粒線體膜電位分析粒線體膜電位分析粒線體膜電位分析粒線體膜電位分析
粒線體在是細胞內的能量製造工廠，在呼吸氧化過程中，將所產 生的能量以電化學位能儲存於粒線體內膜，稱之為粒線體膜電位 (mitochondrial membrane potential，∆Ψm)，並以此位能來進行電子傳 遞鏈，產生 ATP 供細胞使用。Rhodamine 123(Rh123)為一親脂性的 螢光性陽離子化合物，會與能進行產能作用的活細胞粒線體內膜結 合，對粒線體膜電位的變化敏感，可使用螢光顯微鏡來觀察(Johnson et al. 1980)。實驗步驟如下：將細胞經過 vehicle，resistin 5 ng/ml 或 6-OHDA 75 µM 處理，或是先經過 5 ng/ml 的 resistin 處理 1 小時，然 後再加入 6-OHDA 75 µM 繼續處理 24 小時，加入 500 µl 濃度為 1 µg/ml 的 Rh123，在室溫下置放 10 分鐘，然後在 20 倍螢光顯微鏡下 觀察，接著利用流式細胞儀定量在不同條件下的 Rh123 結合量，即 間接代表粒線體膜電位。
(七七七)七 西方西方西方西方墨墨墨墨點點點法點法法 法
西方墨點法(Western blot)為一廣泛用來偵測特定蛋白質的分析 法，其原理主要是以電泳分離蛋白質，利用螢光免疫染色在螢光下觀 察特定蛋白質的表現量。此實驗方法由許多步驟組成，包括抽取細胞 蛋白質，蛋白質電泳(SDS-PAGE)，轉漬(Transfer)，填充(Blocking)，
抗體偵測及螢光偵測等。實驗步驟為：將 MES23.5 細胞依照 2×105 cells
/well 種植於 six-well 培養皿中，靜置 24 小時後，加入 6-OHDA (75 µM)，不同濃度的 resistin (2 ng/ml，5 ng/ml 或 10 ng/ml)，或先經過 resistin 前處理再加入 6-OHDA，經過不同時間後收集細胞，取得細胞 溶解物(cell lysate)，此溶解物內含蛋白質。利用 10 % SDS-PAGE gel 電泳分離含 30 µg 蛋白質的樣本，然後轉漬到 polyvinylidene difluoride (PVDF)膜(Millipore, Bedford, MA)。接著將 PVDF 膜於室溫下以 5%
脫脂奶粉進行 blocking，1 小時後取出 PVDF 膜，以 0.05 % Tween 20 及 1X PBS（PBST）混和液清洗 10 分鐘共 3 次。之後加入一級抗體，
於 4 ℃下搖晃 1 小時，然後用 PBST 清洗 PVDF 膜 5 分鐘共 3 次，
再加入二級抗體(goat anti-rabbit or anti-mouse peroxidase-conjugated secondary antibody (1:1000))，於室溫下搖盪進行 1 小時，最後取出
再加入二級抗體(goat anti-rabbit or anti-mouse peroxidase-conjugated secondary antibody (1:1000))，於室溫下搖盪進行 1 小時，最後取出