數據處理與分析

以 TIRF 顯微系統觀察 DNA 樣品，在實驗開始前必須先找到螢光分子配對，

我們使用較易觀察的螢光標記球樣品來進行配對（mapping）的實驗，以每秒 20 個圖像（frame）紀錄，接著以 IDL（Interactive Data Language, Exelis）軟體進行螢 光分子配對，也就是在分割的雙畫面中找到 Cy3 分子並對應到同樣位置點的 Cy5 漏到 Cy5 分子的偵測區，因此必須將這些逸漏（leakage）修正，做法是在拍攝後 10 幅時將原來激發 Cy3 分子的光源改成激發 Cy5 分子波長的光源，可偵測到 Cy3 逸漏的百分比，扣除這些逸漏的百分比便可計算真正的𝐸_{𝐹𝑅𝐸𝑇}。透過 Origin 程序

（OriginLab）將這些𝐸_{𝐹𝑅𝐸𝑇}畫成柱狀圖可得到其分布情形，一般而言可透過改變鹽 濃度觀察𝐸_{𝐹𝑅𝐸𝑇}分布改變以推估構形是否有變化（Figure 20），或是追蹤在不同時間 下𝐸_FRET分布的變化情形。

29

Figure 21. 不同鉀離子濃度下 G-四股結構 FRET 值分布變化圖

若所得研究分子的 EFRET值柱狀圖分布很廣，代表可能不只存在一種構形，且 每個構形之間可能會轉換。為了探討此種動態變化，在取樣的時候改以每秒 2000~4000 幅錄影，經由校正的多項式配對對所有檔案找尋可成功配對的分子對，

計算出螢光訊號強度（intensity）以及時間軌跡（time trace），並存為矩陣檔，接著 使用 MatLab 程序進行分析，可繪製出 Cy3 及 Cy5 隨時間的變化圖和 FRET 效率 的時間軌跡圖。

A. 滯留時間分析（Dwell time analysis）

若所觀察到為明顯的兩種構形之間的變化，如 Figure 22，則可以利用程式計 算出在每一個狀態所滯留的時間，若為單純的一步反應，將滯留時間畫成長條圖

30

會呈現單一指數衰減（single exponential decay），而正逆反應速率常數就為衰減常 數（decay constant）。

Figure 22. 單分子時間軌跡圖

上圖分別為 Cy3 及 Cy5 分子螢光強度隨時間的變化圖，下圖為對應之 EFRET值

B. 隱馬可夫（Hidden Markov）分析

若所觀察到為超過兩種狀態之間的動態轉換，可使用隱馬可夫方法分析，由 Taekjip Ha 研究團隊發展的 HaMMy 程式[55]，將多個時間軌跡圖加以分析，並繪 製機率密度地圖（transition probability density map），可以有效地區分不同的狀態 以及獲得彼此之間轉換的反應速率常數。

C. 交叉相關（Cross-correlation）分析

若分子的動態變化是非常快速的或是變化程度不明顯的，無法使用上述兩項 方法分析，需採用交叉相關分析，其數學方程式如下

31

𝐶𝐶(𝜏) = ∫ {[𝐼_−∞^∞ 𝐷(𝑡 − 𝜏) − 〈𝐼_𝐷〉][𝐼_𝐴(𝑡) − 〈𝐼_𝐴〉]}𝑑𝑡

〈𝐼_𝐷〉〈𝐼_𝐴〉

其中𝐶𝐶(𝜏)為交叉相關函數，〈𝐼_𝐷〉與〈𝐼_𝐴〉分別為供體與受體信號之平均值，𝐼_𝐷(𝑡) 與𝐼_𝐴(𝑡)為供體與受體信號隨時間變化的函數

經由此交叉相關函數，若分子為此兩種狀態構形的互相轉變，則會得到一個 單一反相指數衰減（single inversed exponential decay）函數，衰減常數為正逆反應 常數之和。

32

Figure 23. 交叉相關（Cross-correlation）分析

（A）螢光信號隨時間快速變化圖（B）經由交叉分析擬合結果，呈現反指數衰減，表示 此變化確實為構形之間的動態轉換

33