以單分子光譜研究B細胞淋巴癌致癌基因G-四股結構分子之結構動態學

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(1)國立臺灣師範大學理學院化學系研究所碩士學位論文 Graduate institute of Chemistry College of Science National Taiwan Normal University Master Thesis. 以單分子光譜研究 B 細胞淋巴癌致癌基因 G-四股結構分子之結構動態學 Structural Dynamics Study of B-cell Lymphoma Oncogene G-quadruplex Molecules Using Single-Molecule Spectroscopy. 吳佳諭 Jia-Yu Wu 指導教授：李以仁博士 Advisor：I-Ren Lee, Ph.D. 中華民國一 ○ 五年七月 July, 2016.

(2) 摘要人類 B 細胞淋巴癌基因（B-cell Lymphoma 2，BCL2）是一致癌基因，基因的過表達已被顯示出跟多數癌症息息相關，而在此基因啟動子區域所形成的 G-四股結構已被研究顯示出可以抑制啟動子的活性，調節癌基因的轉錄，進而抑制癌蛋白的形成。先前，已有使用圓二色光譜及核磁共振光譜檢測出 BCL2 基因可以形成至少三種以上的 G-四股結構構形。在此，我們使用全內反射式螢光顯微光譜結合單分子螢光共振能量轉移技術來探討 BCL2 序列在不同鹽類濃度條件下所形成的 G-四股結構構形以及其含量變化。本實驗主要研究的目標為完整的 BCL2 序列（39 個鹼基對）以及其縮短版序列（27 個鹼基對）（Full length BCL2 和 BCL2MidG4），由實驗結果觀察到當低鉀離子濃度時，縮短版序列的 G-四股結構構形有快速變動的現象，隨著鉀離子濃度提升，漸漸趨向於一穩定的構形。完整的 BCL2 序列觀察到其構形之間除了有快速變動的現象之外，還觀察到相對較慢的不同構型間的相互轉換，這些狀態之間的轉換不需要經過打開的構形，與文獻報導的人類端粒酶序列的 G-四股結構構形之間的轉換不同，且觀察到有循序折疊的現象。而當溶液中鉀離子濃度提升，其構形也出現停留在某一特定狀態的現象。由於穩定 G-四股結構的構形對於致癌基因的表達調節有相當的重要性，近年來已有相關研究發展可穩定 G-四股結構的小分子藥物，然而這些小分子藥物對於 G-四股結構可能有選擇性的結合，因此了解 G-四股結構的多樣性以及其之間的轉換有助於藥物的發展及合成。. 關鍵字：人類 B 細胞淋巴癌基因、G-四股結構、全內反射式螢光顯微鏡、單分子螢光共振能量轉移. i.

(3) Abstract B-cell lymphoma 2 (Bcl-2) is an oncoprotein that involves in the regulation of programmed cell death or apoptosis.. The overexpression of BCL2 gene has been. observed in a wide range of human cancers.. It has been reported that the P1 promoter. of BCL2 gene contains a 39-nucleotide(nt) GC-rich region which can form multiple G-quadruplex structures that inhibit gene transcription, and the most stable one is formed by internal four G-tracts.. Previous studies have shown that this 39nt GC-rich. region might fold into at least three different G-quadruplex conformations.. Here, we. apply single molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET) spectroscopy using total internal reflection fluorescence (TIRF) microscope to investigate the G-quadruplex conformations in the BCL2 gene promoter and further analyze the structural dynamics of these conformational transitions.. We found that the. conformations formed in the BCL2MidG4 sequence at low potassium concentration interconverts quickly, while at high salt concentration, it tends to maintain at a high FRET steady state.. For Full length BCL2 sequence, the fast conformational. interconversion is also observed.. Besides the fast change, BCL2 G-quadruplex. undergoes a relatively slow interconversion between conformational states. Unlike the conformational transitions of human telomere G-quadruplex, this interconversion does not go through an open conformation, suggesting a direct conformational transition. addition, a sequential folding is observed.. In. At higher potassium concentration, similar. to the BCL2MidG4 sequence case, majority of the molecules remain in a steady state. Because the stability of G-quadruplex is highly correlated to oncogene transcription, great efforts have been made to develop small molecule drugs of binding and stabilizing the G-quadruplex.. Understanding the interchange of the conformations and the ii.

(4) structural dynamics further provides valuable information on the development of small molecule drugs.. Key word: B-cell Lymphoma 2, G-quadruplex, total internal reflection fluorescence microscope, single molecule fluorescence resonance energy transfer. iii.

(5) 目錄. 摘要 ........................................................................................................................... i Abstract ..................................................................................................................... ii 目錄 ......................................................................................................................... iv 圖目錄 ..................................................................................................................... vi 表目錄 ..................................................................................................................... ix 誌謝 .......................................................................................................................... x 第一章. 緒論 .................................................................................................. 1. 1.1. B 細胞淋巴瘤基因 2（B-cell Lymphoma 2） ............................... 1. 1.2. G-四股結構（G-quadruplex） ........................................................ 3 1.2.1. G-四股結構的形成 .................................................................. 3. 1.2.2. G-四股結構的多樣性 .............................................................. 5. 1.2.3. G-四股結構特性及穩定 .......................................................... 7. 1.3. BCL2 的四股結構 ............................................................................ 9. 1.4. 研究動機 ........................................................................................ 12. 第二章實驗方法與儀器 ...................................................................................... 13 單分子螢光共振能量轉移 ............................................................ 13. 2.1 2.1.1. 原理 ........................................................................................ 13. 2.1.2. 發生條件 ................................................................................ 15. 2.1.3. 優點與應用 ............................................................................ 16 全內反射式螢光顯微鏡 ................................................................ 18. 2.2 2.2.1. 儀器原理 ................................................................................ 18. 2.2.2. 儀器架設 ................................................................................ 19 iv.

(6) 應用 ........................................................................................ 20. 2.2.3. 反應玻片的製備 ............................................................................ 21. 2.3 2.3.1. 玻片表面清洗與修飾 ............................................................ 21. 2.3.2. 反應腔室製作 ........................................................................ 22 核酸分子設計 ................................................................................ 22. 2.4 2.4.1. 染料標記核酸分子 ................................................................ 23. 2.4.2. 核酸分子黏合（anneal）反應流程 ...................................... 23. 2.5. 除氧系統（Oxygen Scavenging System） ................................... 23. 2.6. 實驗流程 ........................................................................................ 25. 2.7. 2.6.1. 表面束縛分子 ........................................................................ 25. 2.6.2. 除氧系統溶液配置（Gloxy） .............................................. 26. 2.6.3. 緩衝溶液條件 ........................................................................ 26 數據處理與分析 ............................................................................ 28. 第三章實驗結果與討論 ...................................................................................... 33 3.1. BCL2MidG4 和 Full length BCL2 隨鹽類濃度變化的 EFRET 直方圖 .........................................................................................................33. 3.2. BCL2MidG4 序列時間軌跡圖（time trace）（Figure A1） ........ 36. 3.3. Full length BCL2 序列時間軌跡圖（time trace）（Figure A2） . 38. 第四章結論 .......................................................................................................... 42 參考文獻 ................................................................................................................ 44 附錄 ........................................................................................................................ 51. v.

(7) 圖目錄 Figure 1. Bcl-2 蛋白質家族 ............................................................................................ 2 Figure 2. 人類 BCL2 基因啟動子結構.......................................................................... 3 Figure 3. G-四股結構的成型與陽離子錯合圖 .............................................................. 4 Figure 4. 多種 G-四股結構的構形 ................................................................................ 6 Figure 5. 人類端粒酶 d[AGGG(TTAGGG)3]序列的 G-四股結構 .............................. 7 Figure 6. G-四股結構在啟動子中影響 .......................................................................... 9 Figure 7. BCL2 序列........................................................................................................ 9 Figure 8. c-MYC 及 BCL2MidG4 的 G-四股結構 ....................................................... 10 Figure 9. BCL2 的平行構形...........................................................................................11 Figure 10. 兩穩定交換的 BCL2 G-四股結構構形 ......................................................11 Figure 11. 螢光共振能量轉移能階示意圖 ................................................................. 14 Figure 12. 螢光共振能量轉移與距離關係圖(摘自 Ref.[51]) .................................... 15 Figure 13. 最廣泛使用的螢光染料配對 Cy3 和 Cy5................................................. 16 Figure 14. 單分子 FRET 實驗的優勢 ......................................................................... 17 Figure 15. 兩種全內反射式螢光顯微鏡 ..................................................................... 19 Figure 16. 本論文所採用之單分子螢光共振能量轉移光譜顯微術儀器簡圖 ......... 20 Figure 17. 反應腔室 ..................................................................................................... 22 Figure 18. 螢光漂白機制 ............................................................................................. 24 Figure 19. GODCAT 除氧反應(摘自 Ref.54) ............................................................... 25 Figure 20. 核酸分子固定於玻片表面示意圖(摘自 Ref.51) ....................................... 26 Figure 21. 不同鉀離子濃度下 G-四股結構 FRET 值分布變化圖 ............................ 29 Figure 22. 單分子時間軌跡圖 ..................................................................................... 30 Figure 23. 交叉相關（Cross-correlation）分析 ......................................................... 32 vi.

(8) Figure 24. 兩 BCL2 序列可能形成之部分環型構形.................................................. 34 Figure 25. BCL2MidG4 EFRET 隨著鹽濃度變化的直方圖 .......................................... 35 Figure 26. Full length BCL2 EFRET 隨著鹽濃度變化的直方圖 ................................... 35 Figure 27. BCL2MidG4 快速變動的時間軌跡圖 ........................................................ 37 Figure 28. 快速變動時間軌跡圖之 Cross-correlation 分析 ....................................... 37 Figure 29. Full length BCL2 相對慢速變化的時間軌跡圖 ......................................... 39 Figure 30. 使用 HaMMy 程式所繪製的機率密度地圖 ............................................. 40 Figure A1-1. 鉀離子濃度為 10mM， BCL2 MidG4 EFRET 快速變動的時間軌跡圖51 Figure A1-2. 鉀離子濃度為 50mM， BCL2MidG4 EFRET 快速變動的時間軌跡圖 52 Figure A1-3. 鉀離子濃度為 50mM， BCL2MidG4 EFRET 快速變動的時間軌跡圖 53 Figure A1-4. 鉀離子濃度為 100mM， BCL2 MidG4 EFRET 快速變動的時間軌跡圖 ................................................................................................................. 54 Figure A1-5. 鉀離子濃度為 150mM， BCL2MidG4 EFRET 穩定狀態的時間軌跡圖 ................................................................................................................. 55 Figure A1-6. 鉀離子濃度為 200mM， BCL2MidG4 EFRET 穩定狀態的時間軌跡圖 ................................................................................................................. 56 Figure A2-1. 鉀離子濃度為 10mM，Full length BCL2 EFRET 相對慢速變動狀態的時間軌跡圖................................................................................................. 57 Figure A2-2. 鉀離子濃度為 50mM，Full length BCL2 EFRET 相對慢速變動狀態的時間軌跡圖................................................................................................. 58 Figure A2-3. 鉀離子濃度為 100mM，Full length BCL2 EFRET 相對慢速變動狀態的時間軌跡圖................................................................................................. 59 Figure A2-4. 鉀離子濃度為 100mM，Full length BCL2 EFRET 相對慢速變動狀態的時間軌跡圖................................................................................................. 60. vii.

(9) Figure A2-5. 鉀離子濃度為 100mM，Full length BCL2 EFRET 穩定狀態的時間軌跡圖............................................................................................................. 61 Figure A2-6. 鉀離子濃度為 150mM，Full length BCL2 EFRET 相對慢速變動狀態的時間軌跡圖................................................................................................. 62 Figure A2-7. 鉀離子濃度為 150mM，Full length BCL2 EFRET 穩定狀態的時間軌跡圖 ................................................................................................................. 63 Figure A2-8. 鉀離子濃度為 200mM，Full length BCL2 EFRET 相對慢速變動狀態的時間軌跡圖................................................................................................. 64 Figure A2-9. 鉀離子濃度為 200mM，Full length BCL2 EFRET 穩定狀態的時間軌跡圖 ................................................................................................................. 65. viii.

(10) 表目錄 Table 1. 啟動子序列及人類端粒酶序列比較 ............................................................... 8 Table 2. DNA 序列及修飾 ............................................................................................ 27 Table 3. 黏合反應條件 ................................................................................................. 27 Table 4. 除氧系統濃度條件 ......................................................................................... 27 Table 5. 緩衝溶液濃度條件 ......................................................................................... 27 Table 6. 鉀離子濃度為 50mM、100mM 及 150mM 時，慢速變化軌跡圖使用 HaMMy 軟體所得到的動力學參數 ............................................................................ 41 Table A 1. 藥品清單 ..................................................................................................... 66. ix.

(11) 誌謝很開心來到師大化學系就讀研究所，進入了李以仁老師實驗室，記得剛進入實驗室時，由於儀器尚未架設完全，因此大部份的時間都在讀相關研究資料，但也因為已經讀了很多資料，當真正開始著手實驗時也較快上手，由於實驗室相關研究會用到一些生物及物理的觀念，我也因此從中學習到了很多。在就讀研究所的期間，幫助過我的人很多，首先要感謝李以仁老師，因為是老師的第一屆學生，在一開始我們什麼都不懂的時候親自教導我們，無論是學識上或是實驗技術方面都詳細的傳授給我們，即使我們有很多基本的問題，老師也不厭其煩的幫我們解決，在寫論文的同時也給了我相當多的建議，對我真的受益良多。除了老師之外，還要感謝實驗室的同學們，在我遇到困難的時候幫我一起解決，也不吝嗇的教導我，雖然每天都窩在實驗室裡，但讓我在這裡學習的同時也過得很歡樂。還要感謝口試委員們：侯明宏老師以及孫英傑老師，在繁忙之中抽空幫我改論文以及口試，且在口試過程中給予我許多建議，讓我能順利的完成我的畢業論文。最後要感謝的是我的家人，在求學的過程中一路上支持著我，即使離鄉背井，但給予的關心及鼓勵也從不缺少。覺得自己很幸運，雖然曾經也有表現不盡理想或是茫然的時候，但還是努力的堅持過來了，很開心在這兩年學習到了很多，也期許未來能夠繼續不斷地增進自己。. x.

(12) 第一章緒論 1.1 B 細胞淋巴瘤基因 2（B-cell Lymphoma 2）近年來有許多研究致力於開發治療癌症的藥物，而首要了解的便是癌症的成因，多種基因異常的變化進而產生癌細胞，最常發生變化的基因有兩種：致癌基因（oncogene）及抑癌基因（tumor suppressor gene），其中致癌基因的前身是原致癌基因（proto-oncogene），原致癌基因為正常細胞中促進細胞存活的基因，參與了細胞生命週期的階段：包含細胞生長、細胞分裂和細胞分化等過程，在正常情況下，若有異常或者受損的 DNA，細胞本身會啟動修復機制來修補，使得細胞能夠繼續進行分裂延續生命週期，然而，若 DNA 的受損程度過大，已經達到細胞本身無法修復的程度，這些受損的 DNA 就會進行程序性細胞死亡（programmed death），即細胞凋亡（apoptosis），如此一來，受損的 DNA 便會被清除，而細胞也得以繼續延續其週期。但當原致癌基因獲得啟動子、發生染色體易位、基因擴增、點突變等活化機制，會使得原致癌基因活化形成致癌基因，一旦形成活化的致癌基因，異常的 DNA 就不會進入細胞凋亡程序，且還會使得異常的細胞團不受控制地增長，導致惡性腫瘤的產生，若因過多突變使抑癌基因也失去活性，就會演變成癌症。人類 B 細胞淋巴瘤 2（B-cell lymphoma 2）是一種粒腺體膜蛋白，簡稱 Bcl-2，由 BCL2 基因編碼而成，在細胞死亡程序控制中扮演一個重要的角色，作用為細胞凋亡抑制劑[1][2]，其蛋白質家族至少有 16 個成員，每個成員至少都帶有一個或多個 Bcl-2 同源（Bcl-2 Homology, BH）區域，主要可分為三大類：（一）抗凋亡蛋白（anti-apoptotic protein），例如：Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w （二）促凋亡蛋白（pro-apoptotic protein），例如：Bax、Bak（三）BH3-only 促凋亡蛋白（BH3-only pro-apoptotic protein），例如：Bik、Bim、Hrk [3][4]。如 Figure 1 所示。在細胞中，此三類蛋白質彼此達成平衡以調控細胞的凋亡程序。. 1.

(13) Figure 1. Bcl-2 蛋白質家族有三大類：anti-apoptotic 成員的功能為促進細胞存活，而 pro-apoptotic 和 BH3-only 為促進細胞凋亡[3]. BCL2 最初被發現在人類濾泡性淋巴瘤細胞中，t（14;18）染色體的易位造成抗凋亡 BCL2 基因過表達進而抑制淋巴細胞的凋亡[5]。在人類多數的癌症中均發現 BCL2 基因異常地過表達，如 B 細胞和 T 細胞淋巴癌[6]、乳癌[7]、前列腺癌[8]、非小細胞肺癌[9]、子宮頸癌[10]和直腸癌[11]，因此，BCL2 基因被認為是一種原致癌基因。此外， BCL2 基因的過表達也被發現到會影響傳統的抗癌治療方法 [12][13]，抗癌藥物的作用為誘導腫瘤細胞的凋亡，然而，BCL2 基因的過表達使得腫瘤細胞會抑制凋亡，與抗癌藥物抗衡而影響治療效果，因此，調節 BCL2 基因的表達也成為目前在抗癌治療方面上的一大目標[14]；相反地，BCL2 也被用於神經保護治療方面，可以預防在神經老化疾病中神經元的細胞死亡，如帕金森氏症、阿茲海默症和中風等[15][16]，基於 BCL2 基因的表達與細胞的程序性死亡有相當大的關聯，有關於 BCL2 的研究也越來越被重視。 BCL2 基因有兩個控制轉錄起始的啟動子區域，稱作啟動子 1（promoter 1, P1）和啟動子 2 （promoter 2, P2），主要的啟動子為 P1，位於轉譯起始位上游第 1386-1432 個鹼基對處，是一段富含 GC 的序列，含有多個轉錄起始位（-1394，-1399， -1406，-1410 和-1432）[17][18]，多種轉錄因子透過與此區域結合以調節 BCL2 基. 2.

(14) 因的表達，如 Sp1[17]、WT1[19]、E2F[20]和 NGF[21]。先前已有研究指出移除或改變此區域會增加啟動子的活性 2.1 倍或 2.6 倍[19]，顯示出此區域有抑制轉錄的作用。而 P2 啟動子則是含有典型的 TATA 片段，在大多細胞中佔轉錄的比例較少。在 P1 啟動子上游位於-1451 至-1490 處有一 39 個鹼基對的區域與基因表達的調節息息相關，且在鹽離子條件下會形成一種特殊的 DNA 二級結構，稱作 G-四股結構（G-quadruplex），此區包含六個至少由三個以上連續 Guanine 組成的片段，且相鄰之間有其他鹼基對，如 Figure 2 所示，也因此為典型可形成分子內 G-四股結構的序列[22]。. Figure 2. 人類 BCL2 基因啟動子結構顯示的序列為一 39 個鹼基對，與基因表達調節有關的片段(圖片來自 Ref22). 1.2 G-四股結構（G-quadruplex） 1.2.1 G-四股結構的形成 G-四股結構是由一段富含鳥嘌呤（Guanine）序列的基因在特定鹽類濃度以及酸鹼值的條件下所折疊而成的 DNA 二級結構，四個不相鄰的 Guanine，兩兩 Guanine 上的氮和氧與相鄰 Guanine 上的氫先以 Hoogsteen 氫鍵鍵結形成一個稱作 G-quartet 的平面（Figure 3A）[23]，由好幾個 G-quartet 平面堆疊便形成了 G-四股結構（Figure 3B），中心有離子鍵結中心。這些富含 Guanine 的序列形成 G-四股結構必須有陽離子的參與，如 K+和 Na+，陽離子依據其離子半徑大小可能位於單一個 G-quartet 平面中的離子通道（如 Na+等比較小的離子）或者是位於兩個堆疊. 3.

(15) G-quartet 的中間形成雙錐反柱體的排列（如 K+等半徑較大的離子）（Figure 3C-D），由於陽離子與 Guanine O6 的靜電力相互抵消，減少了負電排斥力，使得 G-四股結構的堆疊更加穩定，且已經被證實 K+的穩定效果比 Na+好[24][25][26]，而在生物細胞中，K+和 Na+是不可或缺的，因此在生理條件下是有利於 G-四股結構的形成。. Figure 3. G-四股結構的成型與陽離子錯合圖（A）四個 Guanine 經由 Hoogsteen 氫鍵形成 G-quartet 平面（B）G-quartet 堆疊成 G四股結構（C）（D）分別為 Na+(紫色球狀)位於(d(TGGGGT)4)序列 G-四股結構和 K+(綠色球狀)位於(dA(GGGTTA)3GGG)序列 G-四股結構 (摘自 Ref.26). 4.

(16) 1.2.2 G-四股結構的多樣性 G-四股結構因其 DNA 股的數目、股的方向性以及環的排列造成其多樣性。由單一股序列所形成的為分子內構形（intramolecular），而由兩股以上所形成的則為分子間構形，常見的有雙分子（bimolecular）和四分子（tetramolecular）（Figure 4A）。依據每條 Guanine 股的方向又可分為平行（parallel）、反平行（antiparallel）或混合型（hybrid）（平行和反平行共存）構形（Figure 4B）。由於在連續 Guanine 之間的鹼基對數目不同，這些連接的鹼基對會形成 G-四股結構的環，以不同的方式將堆疊的 G-quartet 連接，造成 G-四股結構有多種構形，有三種主要形式：（1）對角線（diagonal），通常由三個或三個以上的鹼基對組成（2）橫向（lateral），由兩個或以上的鹼基對組成（3）螺旋槳（或稱雙鏈反轉）（propeller or double-chain-reversal），最少可由一個鹼基對、最多有六個或以上的鹼基對組成（Figure 4C）。對角線和橫向形式所連接的兩條 Guanine 股是相反的、反平行的位向，而螺旋槳形式則是連接兩條相同、平行位向的股，在堆疊結構中將底端的 G-quartet 和頂部的 G-quartet 連結。不同的環也影響了 G-四股結構的穩定性，而所形成的特定形式則取決於核酸序列、環的長度和陽離子種類[27][28][29][30]。. 5.

(17) Figure 4. 多種 G-四股結構的構形（A）不同股的數目所形成的 G-四股結構，分別為單分子(monomer)、雙分子(bimolecular) 及四分子(tetramolecular) （B）依據股的方向性可分為 parallel、antiparallel 和 hybrid （C）環所連接的三種主要類型（箭頭所指）：對角線(diagonal)、橫向(lateral)和螺旋槳(propeller). 6.

(18) 以人類端粒酶的 G-四股結構為例子，這是一段富含（TTAGGG）n 的重複序列，不同的序列長度會形成不同的 G-四股結構，如兩個重複的 d(TAG3TTAG3T)序列在鉀離子溶液中形成螺旋槳式的平行構形和橫向式的反平行構形，而四個重複的 d[(TTAGGG)4TT]序列（26 個鹼基對）在鉀離子條件下形成的是含兩個橫向環及一個螺旋槳環的混合型構形。此外，近年來發現另一段四個重複的縮短序列─ d[AGGG(TTAGGG)3]（22 個鹼基對），在鈉離子條件下所形成的為單一混合型 G四股結構，然而在鉀離子溶液中卻形成兩種 G-四股結構，且此兩種構形可以互相轉換（Figure 5）[30]。由於有許多小分子可以穩定 G-四股結構的構形，因此了解 G-四股結構的多樣性及相互之間的轉換有利於發展可與 G-四股結構結合的小分子藥物。. Figure 5. 人類端粒酶 d[AGGG(TTAGGG)3]序列的 G-四股結構在鈉離子條件下為單一構形，在鉀離子為兩個可互換的 G-四股結構 [31]. 1.2.3 G-四股結構特性及穩定 G-四股結構首先被認為在真核生物染色體端粒末端的 DNA 序列所形成[32]，端粒在細胞分裂的過程中長度會縮短，藉由端粒酶以修復之，在正常人體細胞中，端粒酶的活性受到相當嚴密的控制，因此老化及衰退是生命正常現象，然而，在腫瘤細胞中，端粒酶卻大量過表達，造成細胞無限制的增長引發癌症，在 1997 年， Sun 研究團隊發展了一種小分子藥物可與端粒的 G-四股結構結合並穩定 G-四股結. 7.

(19) 構，發現可以抑制端粒酶的活性，因此使得 G-四股結構被視為一個有潛力的抗癌目標[33]。近年來，G-四股結構也被發現在許多啟動子序列中形成，作用為轉錄的調節者，這些啟動子多為富含 Guanine 的基因序列，且為與細胞生長與增殖相關的致癌基因，例如：c-MYC[34]、VEGF[35]、HIF-1α[36]、RET[37]、c-KIT[38]、BCL2[22]… 等（Table 1），由於在這些啟動子的序列為雙股螺旋結構，轉錄為 RNA 過程中必須將雙股打開成為單股，因此可能形成 G-四股結構，一旦形成 G-四股結構，啟動子的活性便被抑制，使得基因無法繼續轉錄，進而抑制癌細胞的生長（Figure 6） [39]。此外，G-四股結構也存在基因組的其他區域，如免疫球蛋白開關區[40]、核糖體 DNA[41]和 RNA[42]…等。由於 G-四股結構的穩定與端粒酶及致癌基因啟動子活性有相當大的關聯，因此設計小分子穩定 G-四股結構已經成為目前主要的抗癌治療藥物的發展方向[43][44]。. Table 1. 啟動子序列及人類端粒酶序列比較. 8.

(20) Figure 6. G-四股結構在啟動子中影響 G-四股結構的穩定會抑制啟動子活性，進而使得基因無法轉錄[39]. 1.3 BCL2 的四股結構先前已有研究團隊利用多種方法鑑定 BCL2 基因的 G-四股結構， Hurley 研究團隊藉由實驗結果認為在 BCL2 P1 啟動子上游這段富含 GC、39 個鹼基對的序列會形成至少三種分子內的 G-四股結構，且必須是由相鄰的連續 Guanine 所形成的，即 Figure 7 中的 I-II-III-IV、II-III-IV-V 和 III-IV-V-VI 所形成，而最穩定的構形是由中心 II-III-IV-V（BCL2MidG4）這段所形成的 G-四股結構[22]。. Figure 7. BCL2 序列. 由圓二色光譜（Circular Dichroism, CD）結果判斷，此三段所形成的 G-四股結構均是平行和反平行共存的混合型構形。在 BCL2Mid 的第 IV 段中有五個. 9.

(21) Guanine，對照其他形成 G-四股結構的啟動子序列（Table 1），3’端均由 G3NG3 所組成，因此由靠近 3’端的三個 Guanine 參與的 G-四股結構較為穩定，如同 c-MYC 形成螺旋槳式平行結構（Figure 8A）[45]，此 G3NG3 所形成的為螺旋槳（雙鏈反轉）的環，而主要造成 BCL2MidG4 形成和其他序列不同結構是由於 5’端的鹼基對數不同，因此形成含兩個橫向環及一個螺旋槳環的混合構形（Figure 8B），之後也使用 NMR 證實了此構形[46][47]。. Figure 8. c-MYC 及 BCL2MidG4 的 G-四股結構 c-MYC 所形成的為平行的 G-四股結構，BCL2MidG4 則形成混合型構形，紅色代表 Guanine(G)，藍色代表 Thymine(T)，綠色代表 Adenine(A)，黃色代表 Cytosine(C). 近年來，他們團隊還發現到 BCL2 另一新的 G-四股結構，由不連續的 I-II-IV-V 所折疊而成（BCL21245G4），由於在兩端為 G3NG3 組成，因此形成了螺旋槳式的平行構形（Figure 9），此構形以熱力學上（Tm=71˚C）較 BCL2MidG4（Tm=61˚C）所形成的混合構形穩定。有趣的是，他們認為此平行構形和 BCL2Mid 的混合構形雖然折疊的方式不同，但卻可以互相轉換（Figure 10），這可能對基因表達的調節有相當大的重要性，因為不同的 G-四股構形可能被不同蛋白質所辨識導致有不同的基因調節表現[48]。然而，目前尚未有其構形轉換的證據。由上述結果亦可以發. 10.

(22) 現在啟動子序列中所形成的 G-四股結構大多是具有兩個 1nt 的環以及一個可變長度的中間環的平行構形。. Figure 9. BCL2 的平行構形不同於先前研究由連續 Guanine 片段組成 G-四股結構，此構形由四段不連續的 Guanine 組成，含有兩個 1nt 的環以及一個 13nt 的中間環(摘自 Ref.48). Figure 10. 兩穩定交換的 BCL2 G-四股結構構形. 11.

(23) 1.4 研究動機 G-四股結構在基因表達的調節扮演很重要的角色，特定的分子會辨識特定的 G-四股結構，進而控制基因的表達，然而 G-四股結構的構形是很多樣性的，因此若能有效的穩定單一 G-四股結構，便能抑制癌細胞基因的表達。傳統的 NMR 及 CD 實驗所偵測的為整體數據，雖然可以鑑定出不同的結構，但因每個生物分子個體的表現是不一致的，因此難以觀察個別分子的行為及定量，在此，我們使用單分子螢光共振轉移（single-molecular fluorescence resonance energy transfer, smFRET）的技術，觀察在不同鹽類濃度下所產生的各種 G-四股結構含量，同時透過 FRET 的效率觀察到不同構形之間的轉換，並進而分析其構形轉換的動力學。. 12.

(24) 第二章實驗方法與儀器 2.1 單分子螢光共振能量轉移 2.1.1 原理為了觀察 DNA 分子的結構及其動態，我們使用了單分子螢光共振能量轉移的技術，在複雜的生物系統中，一般傳統的研究方法是在巨觀下進行實驗及觀察，所得到的數據是所有分子的平均結果，但事實上，每個分子的表現是不一致的，且難以同步，若使用傳統的技術，其中個別分子的特性則會被隱藏在平均之下，使得我們無法得知實際的情況，而單分子技術的優點便是可以觀察個別分子及其動態行為，根據觀察結果得知其分布情形，還能夠提供我們更進一步的反應機制及動力學參數，更重要的是可以操縱個別分子。一般而言，單分子技術通常與兩大類實驗方法做結合，第一種為對分子施加外力，如光鉗（Optical Tweezers）、磁鉗（Magnetic Tweezers）和原子力顯微鏡（Atomic Force Microscopy），另一種則為使用螢光標記目標物以觀察螢光訊號，由於螢光放光有較低的背景值，因此常被用於單分子檢測上，包括單分子螢光光譜（Single-molecule Fluorescence Spectroscopy）、單分子螢光共振能量轉移（Single-molecule Förster Resonance Energy Transfer, smFRET）[49][50]。單分子螢光共振能量轉移（smFRET）的現象為：有兩染料分子，分別作為供體（donor）和受體（acceptor），當螢光分子吸收光子被激發後，電子會從基態（S0）躍至能量較高的激發態（S1*），接著再以光的形式釋放能量回到基態，此時產生的光便是螢光（fluorescence）。在供體分子受到激發放出螢光的過程，部分被激發的供體將能量藉由偶極－偶極交互作用（dipole－dipole interaction）以非放光的形式傳給受體分子，受體分子被激發後放出螢光，呈現供體螢光強度減弱，受體螢光. 13.

(25) 強度增強，且由於供體與受體放光波長不同，呈現不同顏色利於觀察。如 Figure 11。. Figure 11. 螢光共振能量轉移能階示意圖 S0 為原子基態， S1*為激發態. 螢光共振能量轉移效率與染料之間的距離有高度相關性，與兩螢光分子之間距離（R）的六次方成反比，因此適合用來量測兩分子間的距離，關係如下： 𝐸FRET =. 𝐼𝑎𝑐𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜𝑟 1 = 𝐼𝑑𝑜𝑛𝑜𝑟 + 𝐼𝑎𝑐𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜𝑟 1 + (𝑅⁄ )6 𝑅 0. （𝐸FRET ：螢光共振能量轉移效率，𝐼𝑎𝑐𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜𝑟 ：受體的螢光強度，𝐼𝑑𝑜𝑛𝑜𝑟 ：供體的螢光強度，𝑅：供體與受體分子的距離，𝑅0：Förster 半徑，供體能量傳給受體效率達 50%時的距離，與染料分子之間的位向有關）. 14.

(26) 此數值介於 0～1 之間，當𝐸FRET 越接近 1 時，代表供體能量傳給受體越多，反之，若此值越接近 0，代表較沒有發生螢光共振能量轉移的現象，以最廣泛使用的 Cy3 和 Cy5 染料配對為例，其 Förster 半徑為 6 奈米，FRET 效率如 Figure 12 所示。. Figure 12. 螢光共振能量轉移與距離關係圖(摘自 Ref.[51]). 2.1.2 發生條件用於單分子螢光共振能量轉移實驗理想的螢光染料分子必須有以下幾點特性：（1）具有光穩定性，在光漂白之前能夠釋放出光子（2）亮度高（高消光係數及量子產率）（3）低螢光強度波動性（4）激發和吸收波長在可見光範圍內（390-700nm）（5）體積相對地小，使其對目標分子產生較小擾動（6）容易取得，且可以標記在生物分子上。常見的螢光染料分子有：Cyanine 3（Cy3）、Cyanine 5（Cy5）、 Tetramethylrhodamine（TMR）[52]等。. 15.

(27) 除了螢光染料分子本身的特性外，要發生螢光共振能量轉移需有一對染料配對，而此兩染料分子必須滿足以下條件：第一，供體的放射光譜與受體的吸收光譜有部分重疊；第二，螢光染料分子之間的距離很接近（一般小於 10 奈米才會發生 FRET）；第三，兩螢光染料分子能量躍遷的偶極方向（transition dipole orientations）非垂直。最廣泛用於單分子螢光共振能量轉移的螢光染料配對為 Cy3 和 Cy5（Figure 13）。. Figure 13. 最廣泛使用的螢光染料配對 Cy3 和 Cy5 （A）Cy3 和 Cy5 的結構（B）Cy3 和 Cy5 光譜重疊圖. 2.1.3 優點與應用單分子螢光共振能量轉移有幾點優勢，在單分子實驗中獲取 FRET 值，藉由 FRET 值的分布可以作出統計圖。舉例來說，若有一群非均相的分子，含有三個不. 16.

(28) 同 FRET 值的分布，在傳統的整體實驗中所得到的是此三個 FRET 值的平均結果，而使用 smFRET 得到的統計圖能夠清楚獲得 FRET 值的分布狀態（Figure 14A）。生物化學反應亦可使用整體 FRET 實驗來偵測並獲取動力學參數，但使用整體實驗研究時，必須先進行反應的同步，分子在發生反應前需在同一種狀態，對於無法同步的反應便沒辦法偵測，而使用單分子螢光共振能量轉移不需要同步反應，因此單分子使我們更容易觀察單一分子隨時間的變化（Figure 14B），便可以獲取反應的動力學，此外，還能夠偵測到稀少的構形變化以及中間產物，此動力學優勢使得單分子 FRET 實驗被廣泛地應用。. Figure 14. 單分子 FRET 實驗的優勢（A）單分子 FRET 實驗可獲取三個分布個別的 FRET 值，而由整體實驗只能得到一平均值(虛線)（B）由單分子 FRET 實驗所觀察到不同時間下 FRET 值的變動(摘自 Ref.50). 基於單分子 FRET 實驗有如此優勢，因此被應用在許多生物系統構形變化的研究，如蛋白質的折疊、蛋白質的內部運動、核酸構形動態變化和免疫測定等等。而本實驗目的為觀察核酸二級結構的動態變化。. 17.

(29) 2.2 全內反射式螢光顯微鏡 2.2.1 儀器原理光線由高折射率介質（光密介質）進入至低折射率介質（光疏介質）時，光線折射會偏離法線，當入射角大於臨界角時，光線就不會在低折射率介質產生折射，而是將入射光全部反射回高折射率介質，此為全內反射現象。以幾何光學角度來看，光線沒有發生折射而是全部反射，然而，實際上仍有一小部份能量以消逝波的形態進入低折射率介質，穿透的範圍稱為消逝場（Evanescent field），而此消逝場在可見光範圍可穿透的深度僅離介質邊界約 100 奈米。全內反射式螢光顯微鏡（Total Internal Reflection Fluorescent Microscopy, TIRF）便是利用光線全內反射會在介質另一端產生消逝場的特性，激發此區域的螢光分子以觀測螢光標記的目標物，由於消逝波隨著穿透深度呈指數衰減的現象，因此只有落在此狹窄範圍內的螢光分子可以被觀測，降低了背景雜訊對目標物的干擾，形成高度對比的螢光影像[53]。全內反射式螢光顯微鏡有兩種類型：（1）稜鏡式（Prism-type）（2）物鏡式（Objective-type）。稜鏡式全內反射螢光顯微鏡一般為倒立型，光線通過稜鏡在蓋玻片表面產生全反射，激發產生的螢光再由顯微鏡所收集，此類型所使用的為水浸式物鏡（water immersion objective）；而物鏡式全內反射式螢光顯微鏡則是將光束直接打在物鏡邊緣，經由高數值孔徑（(Numerical aperture, NA）物鏡內的鏡片折射在蓋玻片和樣品產生全反射，使用的為油浸式物鏡（oil immersion objective）。兩種類型的架構如 Figure 15。. 18.

(30) Figure 15. 兩種全內反射式螢光顯微鏡（A）稜鏡式（B）物鏡式. 2.2.2 儀器架設本實驗室的儀器為稜鏡式全內反射螢光顯微鏡，使用波長 532 奈米的雷射當作激發光源，為了同時觀察供體跟受體的螢光訊號，架設了雙視（dual view）光學元件組，包括狹縫、透鏡組、分光鏡及反射鏡。被激發的螢光訊號通過顯微鏡收集後，藉由狹縫將影像切割以利觀察，接著以兩個消色差透鏡將影像投影至相機，在透鏡裝置間有分光鏡與反射鏡，分光鏡目的為將供體影像反射並使受體影像穿透，而受體穿透的影像再被反射鏡所反射，這兩個不同波段的影像最終以並列的方式投影至相機感測器。由於單分子螢光影像的信號微弱，因此所選用的相機為電子放大式電荷耦合器(Electron Multiplied Charged Coupled Device，簡稱 EMCCD)，其優點是可對信號強度區進行放大以利觀測。完整架設如下. 19.

(31) Figure 16. 本論文所採用之單分子螢光共振能量轉移光譜顯微術儀器簡圖. 2.2.3 應用全內反射式螢光顯微鏡因其可形成高對比的螢光影像以及對生物分子造成損害小的特性，使得被廣泛地運用在細胞表面動態的觀察上，例如用於觀察單一球蛋白的運動、單一分子對間的螢光共振能量轉移現象、監測生物分子間作用的即時動力學…等。此項技術仍不斷地在精進，如物鏡的改進以及提升照相機的性能，同時亦努力擴充發展與其他儀器的結合以利更多活體生物細胞的觀察。. 20.

(32) 2.3 反應玻片的製備 2.3.1 玻片表面清洗與修飾將已打洞的載玻片和蓋玻片放入反應容器，先使用丙酮浸泡載玻片和蓋玻片，並以超音波震盪 30 分鐘，之後將載玻片及蓋玻片取出以三次水沖洗數次，再浸泡於 3M 氫氧化鉀，以超音波震盪 20 分鐘，完成後取出再以三次水沖洗數次後接著以甲醇沖洗，氮氣吹乾載玻片和蓋玻片表面，將載玻片用火燒烤以清除表面雜質，之後與蓋玻片一起置入氧氣電漿機（Oxygen plasma），接著放回已浸泡過甲醇並吹乾的反應容器中，在容器中加入 100mL 的甲醇、5mL 的醋酸和 1mL 的 3-(甲氧基矽基)丙基乙二胺（3-(Trimethoxysilyl)propyl ethylenediamine），靜置十分鐘後以超音波震盪一分鐘再靜置十分鐘，最後將載玻片跟蓋玻片取出以甲醇及三次水潤洗數次，放置於含水的盒子中。配置 0.1M 的碳酸氫鈉溶液作為聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）的緩衝溶液，秤取 0.1g 的聚乙二醇以及 0.002g 的生物素修飾聚乙二醇（Biotinylated polyethylene glycol, Biotin-PEG），加入 420 μL 的碳酸氫鈉溶液，均勻混合後以離心機離心兩分鐘，接著抽取 70 μL 的此溶液均勻滴在載玻片中心，將蓋玻片以低角度緩緩蓋上，避免氣泡產生，靜置於暗處 4-5 小時，待靜置完成後，小心地將蓋玻片與載玻片分離，以三次水充分沖洗直到玻片呈現疏水性質即聚乙二醇已修飾表面完成，使用氮氣分別吹乾載玻片與蓋玻片後，將此玻片組置入乾淨的收納管中並抽真空封存，保存於-20°C 冰箱。. 21.

(33) 2.3.2 反應腔室製作將玻片組由冰箱拿出後靜置於暗處，待其回到室溫再將封存塑膠袋剪開取出使用，剪取適當長度雙面膠黏貼於載玻片，再將蓋玻片黏上，以 pipet tip 施加壓力使膠帶緊密黏合，四周再以環氧樹脂（Epoxy）密合，待其乾之後便完成腔室製作。. Figure 17. 反應腔室. 2.4 核酸分子設計本實驗的研究對象為 BCL2 基因序列：3’-TTT TAG GGG CGG GCG CGG GAG GAA GGG GGC GGG AGC GGG GCT GTT T-5’（取名為 full length BCL2）以及其縮短版 3’-TTT TCG GGC GCG GGA GGA AGG GGG CGG GAG CTT T-5’（取名為 BCL2MidG4），為了能清楚地觀察到 FRET 的現象，我們設計兩條單股 DNA（Table 2），一條為 18 個鹼基對，在 3’端處延伸接上目標 DNA，並在末端標記 Cy3 染料分子，另一條則為此 18 個鹼基對互補股序列，在 5’端處標記 Cy5 染料分子，3’端處標記生物素（Biotin）。. 22.

(34) 2.4.1 染料標記核酸分子本實驗設計將目標 DNA 前後加入額外的胸線嘧啶（Thymine），目的為將 Cy3 螢光染料標記在胸腺嘧啶上，以避免螢光染料的位向影響 FRET 效率。以下為標記的實驗步驟：將向廠商訂購的 2 O.D DNA（full BCL2 和 truncated BCL2）以及 Cy3 染料以小型離心機離心 30 秒，之後加入 35μL 硼氫化鈉（NaBH4）溶液於 Cy3 管中，將此溶液加入 DNA 管中，以微量移液管混合均勻，使用轉動器在 25˚C 暗處下轉動 12-18 小時，待轉動完成後，加入 87.5μL、99.5%酒精（Ethanol）和 3.5μL、 3M 氯化鈉（NaCl）溶液，遮光後放置-20˚C 冰箱 30 分鐘，接著以高速離心機（4 ˚C，11200r.p.m.）轉 30 分鐘，取出上清液丟廢液後，再加入 87.5μL、99.5%酒精，靜置於-20˚C 冰箱 30 分鐘，再以同樣條件的高速離心機離心 30 分鐘，完成後上清液丟廢液，剩下的沉澱物以氮氣小心吹乾，加入 17μL 的超純水回溶便可保存。. 2.4.2 核酸分子黏合（anneal）反應流程將 1μL PolyCy5、1.5μL 已標記 Cy3 的 full BCL2 或 truncated BCL2 及 17.5μL 含有 50mM NaCl 的 Tris 溶液混合，加熱至 90°C 五分鐘後，以每一分鐘降一度的速度，緩慢降到室溫（約莫 1.5 小時），即可獲得 DNA 樣品，此時的 DNA 樣品濃度為 5μM，為了避免 DNA 樣品被汙染，因此將其稀釋為 10nM 後分裝保存於-20 ˚ C 冰箱。（反應條件如 Table 3）. 2.5 除氧系統（Oxygen Scavenging System）先前提到螢光的發光機制，螢光染料分子在激發過後由基態躍遷至較高激發態（S1*），接著以放出螢光的方式回到基態（S0），發光持續時間介於 10-8~10-5 秒，然而在回到基態過程中，可能藉由系統內跨越將能量轉移到另一自旋三重態的激發態（T1*），接著以非螢光（non-radiation relaxation）或放出磷光（phosphorescence）的方式回到基態（Figure 18）。由於三重態（T1*）與基態（S0）具有不同的自旋多. 23.

(35) 重度，此躍遷過程是被躍遷選擇規則所禁止，需要較長的時間完成，通常持續時間大於 10-8 秒，因此單位時間放出光子的數量遠較螢光為低，可視為暗態(dark state) ，造成實驗上會觀察到閃爍（blinking）的現象。另外，氧分子在調節染料穩定性上亦扮演重要的角色，雖可淬滅三重態但在過程中會產生單重態的氧，氧化染料，使得染料失去螢光性質，因此若能去除氧分子可增加染料的穩定性，減少螢光染料分子光漂白（photobleaching）的現象。最常使用的除氧系統為葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶（Glucose oxidase and catalase, GODCAT）[54]，反應如 Figure 18。除了除氧系統外，一些三重態淬滅劑和還原劑亦可增強螢光染料分子的光穩定性，如 β-巰基乙醇（β-mercaptoethanol, βME）以及水溶性維他命 E（Trolox），在此我們選用 Trolox 作為除氧系統的緩衝溶液，詳細配方見實驗流程。. Figure 18. 螢光漂白機制. 24.

(36) Figure 19. GODCAT 除氧反應(摘自 Ref.54). 2.6 實驗流程 2.6.1 表面束縛分子必須將 DNA 樣品束縛於玻片表面上，常用之一種方法為在載玻片表面上修飾帶有生物素（Biotin）的牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA），接著加入抗生物素蛋白家族（StreptAvidin 或 NeutrAvidin），此種蛋白會與帶有生物素的牛血清蛋白結合，同樣地也可以與帶有生物素的核酸分子結合，DNA 便可以固定於玻片表面上，然而，雖然牛血清蛋白與玻片表面結合力甚強，但若研究分子為蛋白質，蛋白質有可能黏在玻片表面上，因此發展出另一種修飾方法，為使用聚乙二醇（polyethylene glycol, PEG）以及極少量帶有生物素的聚乙二醇（Biotin-PEG）修飾表面，聚乙二醇為一聚合物，覆蓋在玻片表面，可防止生物分子附著到玻片表面，因此我們使用的修飾物為後者。將表面已修飾 PEG 及 Biotin-PEG 的玻片組裝好之後，首先在反應腔室內注入 T0 緩衝溶液(Tris 20mM, pH7.8, 無外加鹽類)，接著注入 0.2 毫克/毫升的中性抗生物素蛋白（NeutrAvidin），使其與 Biotin 結合，靜置兩分鐘後，以 T0 緩衝溶液沖掉，接著配製 DNA 溶液，取 0.4μL 的 DNA 樣品（濃度為 10nM），加入 2μL 牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA），目的為防止 DNA 黏著在管壁，再加入 197.6μL 的 T0 緩衝溶液，便配製好濃度為 10pM 的 DNA 溶液，將此 DNA 溶液注入反應腔室內，靜置兩分鐘後以 T0 緩衝溶液沖掉，此時 DNA 已固定在玻片表面上。其示意圖如下. 25.

(37) Figure 20. 核酸分子固定於玻片表面示意圖(摘自 Ref.51). 2.6.2 除氧系統溶液配置（Gloxy）秤取 155 毫克 Catalase，加入超純水稀釋定量到 500μL，接著取出 20μL 加入 11 毫克 Glucose Oxidase 和 80μL 的 T0 緩衝溶液，使用離心機離心（10000r.p.m.， 2 分鐘），取出後抽取上清液至另一乾淨管內保存，待實驗用時抽取 1μL。（濃度如 Table）. 2.6.3 緩衝溶液條件配製 1M 氯化鉀（potassium chloride, KCl）溶液、32mM Trolox （6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid）、25% β-D-Glucose，經稀釋後作為除氧系統的緩衝溶液。. 26.

(38) Sequence(5’ to 3’) TGG CGA CGG CAG CGA GGC (full length BCL2)-Cy3 TGG CGA CGG CAG CGA GGC (BCL2midG4)-Cy3 Cy5-GCC TCG CTG CCG TCG CCA-Biotin. Oligo Full length BCL2 BLC2MidG4 PolyCy5. Modification 3’-Cy3 3’-Cy3 5’-Cy5 3-Biotin. Table 2. DNA 序列及修飾. Volume (μL). Final concentration. full length BCL2 100μM or BCL2midG4 PolyCy5 100μM. 1.5. 5μM. 1. 5μM. Buffer. 17.5. 17.5mM Tris/Tris-HCl, pH 7.8 43.75mM NaCl. Stock concentration. 20mM Tris/Tris-HCl, pH 7.8 50mM NaCl. Total. 20 Table 3. 黏合反應條件. Catalase Glucose Oxidase T0. Solid 3500U/mg. Image buffer 217000U/mL. 150U/mg. 16500U/mL 20mM Tris/Tris-HCl. Table 4. 除氧系統濃度條件. Trolox β-D-Glucose KCl+ddH2O Gloxy. Stock concentration 32mM 25% (w/v) 1M Catalase 217000U/mg. Volume (μL) 49 2 48 1. Glucose Oxidase 16500U/mg Total. Final concentration 15.7mM 0.5% (w/v) 0~200mM* Catalase 2170U/mg Glucose Oxidase 165U/mg. 100 Table 5. 緩衝溶液濃度條件 (*由於本實驗為觀察鹽濃度對核酸分子摺疊構形的影響，因此鹽濃度為操作變因). 27.

(39) 2.7 數據處理與分析以 TIRF 顯微系統觀察 DNA 樣品，在實驗開始前必須先找到螢光分子配對，我們使用較易觀察的螢光標記球樣品來進行配對（mapping）的實驗，以每秒 20 個圖像（frame）紀錄，接著以 IDL（Interactive Data Language, Exelis）軟體進行螢光分子配對，也就是在分割的雙畫面中找到 Cy3 分子並對應到同樣位置點的 Cy5 分子，將這些圖像疊加起來可將螢光訊號與雜訊分開，使用 MatLab 選出三對位置相對應的 Cy3 和 Cy5 分子，透過選取的三對配對的座標，軟體可計算出成功配對的分子數，並建立一個多項式配對（polynomial map），若大多螢光分子都成功配對，即可使用此多項式配對作為校正繼續進行實驗，反之則重新進行上述步驟。實驗中，曝光時間為 30 毫秒，拍攝 20 個以上 DNA 樣品槽不同位置的 30 幅 (frame)的影片，使用 IDL 程序利用前述的多項式配對找出對應位置後將影像疊加用以辨識單分子位置，而後將每個單分子的螢光強度與時間變化的曲線紀錄於檔案中，之後使用 MatLab 程序對螢光配對進行分析，利用計算𝐸FRET 的公式計算出每個分子的螢光共振能量轉移效率，另外，由於 Cy3 分子的螢光訊號一部份會逸漏到 Cy5 分子的偵測區，因此必須將這些逸漏（leakage）修正，做法是在拍攝後 10 幅時將原來激發 Cy3 分子的光源改成激發 Cy5 分子波長的光源，可偵測到 Cy3 逸漏的百分比，扣除這些逸漏的百分比便可計算真正的𝐸𝐹𝑅𝐸𝑇 。透過 Origin 程序（OriginLab）將這些𝐸𝐹𝑅𝐸𝑇 畫成柱狀圖可得到其分布情形，一般而言可透過改變鹽濃度觀察𝐸𝐹𝑅𝐸𝑇 分布改變以推估構形是否有變化（Figure 20），或是追蹤在不同時間下𝐸FRET 分布的變化情形。. 28.

(40) Figure 21. 不同鉀離子濃度下 G-四股結構 FRET 值分布變化圖. 若所得研究分子的 EFRET 值柱狀圖分布很廣，代表可能不只存在一種構形，且每個構形之間可能會轉換。為了探討此種動態變化，在取樣的時候改以每秒 2000~4000 幅錄影，經由校正的多項式配對對所有檔案找尋可成功配對的分子對，計算出螢光訊號強度（intensity）以及時間軌跡（time trace），並存為矩陣檔，接著使用 MatLab 程序進行分析，可繪製出 Cy3 及 Cy5 隨時間的變化圖和 FRET 效率的時間軌跡圖。 A.. 滯留時間分析（Dwell time analysis）. 若所觀察到為明顯的兩種構形之間的變化，如 Figure 22，則可以利用程式計算出在每一個狀態所滯留的時間，若為單純的一步反應，將滯留時間畫成長條圖. 29.

(41) 會呈現單一指數衰減（single exponential decay），而正逆反應速率常數就為衰減常數（decay constant）。. Figure 22. 單分子時間軌跡圖上圖分別為 Cy3 及 Cy5 分子螢光強度隨時間的變化圖，下圖為對應之 EFRET 值. B.. 隱馬可夫（Hidden Markov）分析. 若所觀察到為超過兩種狀態之間的動態轉換，可使用隱馬可夫方法分析，由 Taekjip Ha 研究團隊發展的 HaMMy 程式[55]，將多個時間軌跡圖加以分析，並繪製機率密度地圖（transition probability density map），可以有效地區分不同的狀態以及獲得彼此之間轉換的反應速率常數。. C.. 交叉相關（Cross-correlation）分析. 若分子的動態變化是非常快速的或是變化程度不明顯的，無法使用上述兩項方法分析，需採用交叉相關分析，其數學方程式如下. 30.

(42) ∞. ∫ {[𝐼𝐷 (𝑡 − 𝜏) − ⟨𝐼𝐷 ⟩][𝐼𝐴 (𝑡) − ⟨𝐼𝐴 ⟩]}𝑑𝑡 𝐶𝐶(𝜏) = −∞ ⟨𝐼𝐷 ⟩⟨𝐼𝐴 ⟩ 其中𝐶𝐶(𝜏)為交叉相關函數，⟨𝐼𝐷 ⟩與⟨𝐼𝐴 ⟩分別為供體與受體信號之平均值，𝐼𝐷 (𝑡) 與𝐼𝐴 (𝑡)為供體與受體信號隨時間變化的函數經由此交叉相關函數，若分子為此兩種狀態構形的互相轉變，則會得到一個單一反相指數衰減（single inversed exponential decay）函數，衰減常數為正逆反應常數之和。. 31.

(43) Figure 23. 交叉相關（Cross-correlation）分析（A）螢光信號隨時間快速變化圖（B）經由交叉分析擬合結果，呈現反指數衰減，表示此變化確實為構形之間的動態轉換. 32.

(44) 第三章實驗結果與討論 3.1 BCL2MidG4 和 Full length BCL2 隨鹽類濃度變化的 EFRET 直方圖本研究為了探討 G-四股結構是否形成以及其含量變化，分別在緩衝溶液中加入不同的鹽類（鉀離子）濃度（0mM, 10mM, 50mM, 100mM, 150mM, 200mM），在沒有鉀離子存在的情況下，無論是 BCL2MidG4 序列或是 Full length BCL2 序列，預期應沒有 G-四股結構的形成，由於此序列長度很長，對照先前文獻 21 個 Thymine （T21）序列沒有摺疊時其 EFRET 值大約為 0.2，本研究序列未摺疊時因長度大於 21 個核酸分子應小於 0.2，然而由實驗結果發現 EFRET 尚有一高峰值約位於 0.4，且在低鹽類狀況即存在，因此推測應為某種在室溫下所形成的部分環型（partial loop）構形的 EFRET（Figure 24）。而隨著鉀離子濃度的增加，EFRET 開始產生變化，表示此核酸分子構形在轉變，藉由 EFRET 分布情形可以進一步探討大約有幾種構形的出現。由 EFRET 直方圖，BCL2MidG4 序列在鉀離子濃度為 50mM 時 EFRET 開始產生偏移（Figure 25），構形開始改變，有趣的是，隨著鉀離子濃度增加至 100mM 和 150mM，我們發現此縮短的序列有不只一個 EFRET 的分布，推測可能形成不只一種 G-四股結構的構形，當鉀離子濃度達到 200mM，則大多為一穩定的狀態。而 Full length BCL2 序列在鉀離子濃度為 50mM 時最高峰 EFRET 約為 0.8，在 EFRET 介於 0.4 至 0.8 之間均有分布（Figure 26），顯示出此一現象可能為多種 G-四股結構同時存在所造成，與先前 Hurley 研究團隊所推測：此全長 BCL2 序列可形成至少三種以上不同構形的 G-四股結構相符合，隨著鉀離子濃度上升，此 EFRET 分布情形沒有太大的變化，介於 EFRET~0.4 至 EFRET~0.8 的分布。. 33.

(45) https://sg.idtdna.com/calc/analyzer Figure 24. 兩 BCL2 序列可能形成之部分環型構形（A）BCL2MidG4 之部分環型構形（B）Full length BCL2 之部分環型構形. 34.

(46) Figure 25. BCL2MidG4 EFRET 隨著鹽濃度變化的直方圖. Figure 26. Full length BCL2 EFRET 隨著鹽濃度變化的直方圖. 35.

(47) 3.2. BCL2MidG4 序列時間軌跡圖（time trace）（Figure A1）. 為了更清楚了解 BCL2MidG4 序列 G-四股結構的構形變化，因此拍攝了 2000 幅的影片，以追蹤在固定濃度下，EFRET 隨時間變化的情形。有效的時間軌跡圖應為螢光總強度維持不變，由數百個有效的時間軌跡圖發現，在低濃度鉀離子的條件下（小於 100mM），Cy3 及 Cy5 分子的螢光強度快速且劇烈地交互變動，使得 EFRET 也隨之快速變動，如 Figure 27 所示，然而我們無法確定此變動是否為真實的狀態轉換，又或者為螢光染料分子本身強度的不穩定性所造成，因此作了交叉相關（Cross-correlation）分析，將所有濃度下觀察到有如此快速交互變動的時間軌跡圖利用 MatLab 程序指令進行 Cross-correlation 分析，接著使用 Origin 軟體繪製曲線圖，得到了反向單一指數衰減曲線（Inversed single-exponential decay, Figure 28），證實了此 EFRET 劇烈變動的情形確實為不同構形轉換所造成。然而，隨著鉀離子濃度增加（達到 150mM 或 200mM），開始出現 EFRET 停留在某一狀態的現象（在 150mM 鉀離子中快速變動的時間軌跡佔 56.6%，停留在某特定狀態佔 43.4%；在 200mM 鉀離子中快速變動的時間軌跡佔 31.6%，停留在某一特定狀態佔 68.4%），且大多位於高 EFRET 狀態（0.6~0.8），闡明了當鹽類離子濃度提升，此構形越趨向於停留在某一穩定的 G-四股結構構形。. 36.

(48) Figure 27. BCL2MidG4 快速變動的時間軌跡圖. Figure 28. 快速變動時間軌跡圖之 Cross-correlation 分析 37.

(49) 3.3 Full length BCL2 序列時間軌跡圖（time trace）（Figure A2）同樣地也對 Full length BCL2 進行 2000 幅的錄影，經由 MatLab 程序分析，發現此時間軌跡圖可大致分為三類：第一種如同 BCL2MidG4 所觀察到的，為 Cy3 與 Cy5 染料分子的螢光強度劇烈地交互變動，造成 EFRET 也產生劇烈的變動，將此類分為快速變動；第二種為 Cy3 及 Cy5 分子螢光強度一樣有交互變動的情形，然而交互變動的時間較慢，使得停留在某一 EFRET 值時間較長，但不同 EFRET 狀態之間仍有互相轉換的現象，此為縮短版序列沒有觀察到的現象，分類為相對慢速的變化（Figure 29）；第三種則為兩染料分子螢光維持在某一強度，EFRET 幾乎保持不變，將此類分為未變化的穩定分子。第一種的快速變動軌跡無論是低鹽或高鹽濃度均有出現，一樣使用 Cross-correlation 分析後可以擬合反相指數衰減曲線，代表構形有快速動態轉換的現象，而第二種相對慢速的時間軌跡圖，則使用 HaMMy 軟體對個別狀態做區分，在此我們僅分析鉀離子濃度為中間濃度如 50mM、100mM 及 150mM 的時間軌跡圖，而鉀離子濃度為 10mM 因構形尚未完全摺疊因此沒有加以分析，鉀離子濃度為 200mM 時，構形大多已處於一穩定的狀態，也沒有再多加探討。這些鉀離子為中間濃度的時間軌跡圖使用 HaMMy 軟體分析後大致可視為三種狀態(EFRET=0.4, 0.6 與 0.8)之間的互相轉換（Figure 30），分別為 EFRET 為 0.4 和 0.6 之間互相轉換以及 EFRET 為 0.6 和 0.8 之間的互相轉換，而由時間軌跡圖僅發現少數 EFRET 為 0.4 和 0.8 之間的轉換，因此我們推測除了 EFRET 位於 0.4 為部分環型構形之外，EFRET 為 0.6 和 0.8 應為兩種不同的 G-四股結構構形，且當鉀離子濃度大於 100mM 時，大多為 EFRET 為 0.6 和 0.8 之間的互相轉換，亦即兩 G-四股結構構形的轉換，且其之間的轉換我們沒有觀察到要經過完全打開（EFRET~0.2）或是回到部分環型(EFRET=0.4)的狀態，另外，EFRET=0.8 的狀態多為經由 0.6 的狀態轉換而來，雖觀察到少數 EFRET=0.4 直接轉換到 0.8 的現象，我們可以推估這些少數的事件為 EFRET=0.6 的滯留時間過短所致，因此我們認為 EFRET=0.8 狀態為一循序 38.

(50) 摺疊造成的結果。由此程序還可得知其之間轉換的反應速率以及事件數，如 Table 6。未變化的穩定分子的分類，與 BCL2MidG4 觀察到的現象類似，隨著鹽類濃度增加，由於狀態趨向穩定因此維持在某狀態的時間軌跡增加，然而與縮短版序列不同的是，Full length BCL2 所停留的狀態介於 EFRET=0.4 至 0.8 之間，因此造成所觀察到的 EFRET 直方圖分布範圍很廣。. Figure 29. Full length BCL2 相對慢速變化的時間軌跡圖. 39.

(51) Figure 30. 使用 HaMMy 程式所繪製的機率密度地圖由上至下分別為 50mM、100mM 及 150mM 鉀離子的濃度 40.

(52) [K+]/50mM Rate (s-1) 11.587 1.326 1.122 0.449. Number of transitions: 324 324 346 351. 0.4 ⇾ 0.6 0.6 ⇾ 0.4. Rate (s-1) 10.0009 1.84762. Number of transitions: 372 349. 0.6 ⇾ 0.8 0.8 ⇾ 0.6. 1.91507 0.73936. 565 544. Rate (s-1) 2.68581 1.12626. Number of transitions: 282 281. Transition (FRET value) 0.4 ⇾ 0.6 0.6 ⇾ 0.4 0.6 ⇾ 0.8 0.8 ⇾ 0.6. [K+]/100mM Transition (FRET value). [K+]/150mM Transition (FRET value) 0.6 ⇾ 0.8 0.8 ⇾ 0.6. Table 6. 鉀離子濃度為 50mM、100mM 及 150mM 時，慢速變化軌跡圖使用 HaMMy 軟體所得到的動力學參數. 41.

(53) 第四章結論綜合上述結果得到以下結論，BCL2 序列為一富含 Guanine 的序列，在陽離子的存在下，由先前研究已預期會摺疊成 G-四股結構的構形，而由本實驗室架設的 TIRF 顯微系統結合單分子 FRET 實驗，亦可證實隨著鉀離子的加入，此序列有產生構形上的變化，是為所預期的 G-四股結構，且隨著陽離子濃度改變，構形也會產生變化。本實驗主要研究的目標為完整的 BCL2 序列以及其縮短版序列（Full length BCL2 和 BCL2MidG4），縮短版序列在鉀離子為低濃度條件下，所產生的構形之間有快速變化的情形，隨著鉀離子濃度增加，構形趨向於停留在某一穩定的 G-四股結構，且 EFRET 值大約為 0.8。完整版序列的 G-四股結構構形除了有快速變動的現象之外，尚有停留在某一狀態較長的時間才互相轉換的現象，在此我們使用 HaMMy 程序分析，由於其狀態數很多，因此在此我們使用 HaMMy 程序大致僅分成三種主要狀態之間的轉換，分別為 EFRET=0.4, 0.6 和 0.8，EFRET=0.4 為部分環型的構形，而 EFRET 為 0.6 和 0.8 可能分別為先前 Hurley 團隊認為可互換的兩種 G四股結構構形，且 EFRET=0.8 大多為 0.6 轉換而來，我們認為有循序摺疊的現象，較特別的是，這些狀態之間的動態轉換不一定要經過完全打開（EFRET~0.2）的構形，與文獻所報導的人類端粒酶序列的 G-四股結構不同。隨著鹽類濃度增加，也趨向於停留在某一穩定的狀態，而此穩定狀態的 EFRET 介於 0.4~0.8 之間。以上所觀察到動態之間的轉換是本實驗方法最大的優勢所在，傳統的 CD 以及 NMR 實驗只能在巨觀的角度下觀察，雖然可得知 G-四股結構的構形，但無法獲得其之間動態轉換的資訊，藉由本論文的研究方法，除了可以發現到 G-四股結構構形的存在，還能得到單一分子構形之間轉換的動力學資訊。因在 BCL2 啟動子序列所形成的 G-四股結構對調節基因表達有相當的重要性，近年來已有越來越多研究 42.

(54) 致力於發展能穩定此構形的小分子藥物，然而這些小分子對於 G-四股結構構形的穩定可能有選擇性，因此了解到 G-四股結構之間的轉換可有助於這些小分子藥物進一步的發展。由於此完整序列可形成的 G-四股結構構形眾多，造成所觀察到的 EFRET 分布太廣，即使使用 HaMMy 軟體仍無法明確的定義其狀態數，因此若要進一部探討詳細的 G-四股結構構形，尚需要對此序列特定的鹼基對作變性(mutation)，以鑑定確認各種 G-四股結構的鳥嘌呤的結構。. 43.

(55) 參考文獻 [1] D. T. Chao and S. J. Korsmeyer, “BCL-2 FAMILY: Regulators of Cell Death,” Annu. Rev. Immunol, 1998, 395–419. [2] J. M. Adams and S. Cory, “The Bcl-2 Protein Family: Arbiters of Cell Survival.,” Science (New York, N.Y.) 281, no. 5381 (1998): 1322–26. [3] Katja C. Zimmermann, Christine Bonzon, and Douglas R. Green, “The Machinery of Programmed Cell Death,” Pharmacology & Therapeutics 92, no. 1 (2001): 57–70 [4] Alex R. D. Delbridge et al., “Thirty Years of BCL-2: Translating Cell Death Discoveries into Novel Cancer Therapies.,” Nature Reviews. Cancer 16, no. 2 (2016): 99–109 [5] J J Yunis, “The Chromosomal Basis of Human Neoplasia.,” Science (New York, N.Y.) 221 (1983): 227–36. [6] Akagi, T. ; Kondo, E and Yoshino, T. “Expression of Bcl-2 Protein and Bcl-2 mRNA in Normal and Neoplastic Lymphoid Tissues,” Leukemia & Lymphoma 13, no. 1–2 (1994): 81–87 [7] H Joensuu, L Pylkkänen, and S Toikkanen, “Bcl-2 Protein Expression and Long-Term Survival in Breast Cancer.,” The American Journal of Pathology 145, no. 5 (1994): 1191–98. [8] Timothy J. McDonnell et al., “Expression of the Protooncogene Bcl-2 in the Prostate and Its Association with Emergence of Androgen-Independent Prostate Cancer,” Cancer Research 52, no. 24 (1992): 6940–44 [9] F Pezzella et al., “Bcl-2 Protein in Non-Small-Cell Lung Carcinoma.,” The New England Journal of Medicine 329, no. 10 (1993): 690–94 44.

(56) [10] W. Tjalma et al., “Expression of Bcl-2 in Invasive and in Situ Carcinoma of the Uterine Cervix,” American Journal of Obstetrics and Gynecology 178, no. 1 I (1998): 113–17 [11] Gustavo Bruno Baretton et al., “Apoptosis and Lmmunohistochemical Bcl-2 Expression in Colorectal Adenomas and Carcinomas,” American Cancer Society, 1996, 255–64. [12] T Miyashita and J C Reed, “Bcl-2 Oncoprotein Blocks Chemotherapy-Induced Apoptosis in a Human Leukemia Cell Line.,” Blood 81, no. 1 (1993): 151–57. [13] By Rakesh K Srivastava et al., “Bcl-2 – Mediated Drug Resistance : Inhibition of Apoptosis by Blocking Nuclear Factor of Activated T Lymphocytes” 190, no. 2 (1999). [14] B. Weyhenmeyer et al., “Targeting the Anti-Apoptotic Bcl-2 Family Members for the Treatment of Cancer,” Experimental Oncology 34, no. 3 (2012): 192–99. [15] M A Yenari et al., “Gene Therapy and Hypothermia for Stroke Treatment,” Neuroprotective Agents 993 (2003): 54–68 [16] G Middleton, G Nunez, and a M Davies, “Bax Promotes Neuronal Survival and Antagonises the Survival Effects of Neurotrophic Factors.,” Development (Cambridge, England) 122, no. 2 (1996): 695–701 [17] M Seto et al., “Alternative Promoters and Exons, Somatic Mutation and Deregulation of the Bcl-2-Ig Fusion Gene in Lymphoma.,” The EMBO Journal 7, no. 1 (1988): 123–31 [18] R L Young and S J Korsmeyer, “A Negative Regulatory Element in the Bcl-2 5’-untranslated Region Inhibits Expression from an Upstream Promoter.,” Molecular and Cellular Biology 13, no. 6 (1993): 3686–97.. 45.

(57) [19] Caroline Heckman et al., “The WT1 Protein Is a Negative Regulator of the Normal Bcl-2 Allele in t(14;18) Lymphomas,” Journal of Biological Chemistry 272, no. 31 (1997): 19609–14. [20] Candelaria Gomez-manzano et al., “Transfer of E2F-1 to Human Glioma Cells Results in Transcriptional Up-Regulation of Bcl-2 Advances in Brief Transfer of E2F-1 to Human Glioma Cells Results in Transcriptional,” no. 713 (2001): 6693–97. [21] Yu-zhen Liu, Linda M Boxer, and David S Latchman, “Activation of the Bcl-2 Promoter by Nerve Growth Factor Is Mediated by the p42 / p44 MAPK Cascade,” Cell 27, no. 10 (1999). [22] Thomas S. Dexheimer, Daekyu Sun, and Laurence H. Hurley, “Deconvoluting the Structural and Drug-Recognition Complexity of the G-Quadruplex-Forming Region Upstream of the Bcl-2 P1 Promoter,” Journal of the American Chemical Society 128, no. 16 (2006): 5404–15 [23] Martin Gellert, Marie N. Lipsett, and David R. Davies, “Helix Formation By Guanylic Acid,” Proceedings of the National Academy of Sciences 48, no. 12 (1962): 2013–18 [24] Nancy H. Campbell and Stephen Neidle, “G-Quadruplexes and Metal Ions.,” Metal Ions in Life Sciences, 2012 [25] Jens Müller, “Functional Metal Ions in Nucleic Acids.,” Metallomics : Integrated Biometal Science 2, no. 5 (2010): 318–27 [26] Andrew N. Lane et al., “Stability and Kinetics of G-Quadruplex Structures.,” Nucleic Acids Research 36, no. 17 (2008): 5482–5515. 46.

(58) [27] Yuwei Chen and Danzhou Yang, “Sequence, Stability, and Structure of G-Quadruplexes and Their Interactions with Drugs,” Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, no. SUPLL.50 (2012): 1–17 [28] Ivan Smirnov and Richard H. Shafer, “Effect of Loop Sequence and Size on DNA Aptamer Stability,” Biochemistry 39, no. 6 (2000): 1462–68 [29] Pascale Hazel et al., “Loop-Length-Dependent Folding of G-Quadruplexes,” Journal of the American Chemical Society 126, no. 50 (2004): 16405–15 [30] Dinshaw J. Patel, Anh Tuan Phan, and Vitaly Kuryavyi, “Human Telomere, Oncogenic Promoter and 5’-UTR G-Quadruplexes: Diverse Higher Order DNA and RNA Targets for Cancer Therapeutics,” Nucleic Acids Research 35, no. 22 (2007): 7429–55. [31] Attila Ambrus et al., “Human Telomeric Sequence Forms a Hybrid-Type Intramolecular G-Quadruplex Structure with Mixed Parallel/antiparallel Strands in Potassium Solution,” Nucleic Acids Research 34, no. 9 (2006): 2723–35 [32] Eric Henderson et al., “Telomeric DNA Oligonucleotides Form Novel Intramolecular Structures Containing Guanine-Guanine Base Pairs,” Cell 51, no. 6 (1987): 899–908. [33] D. Sun et al., “Inhibition of Human Telomerase by a G-Quadruplex-Interactive Compound,” Journal of Medicinal Chemistry, 1997 [34] Tomas Simonsson, Petr Pecinka, and Mikael Kubista, “DNA Tetraplex Formation in the Control Region of c-Myc,” Nucleic Acids Research 26, no. 5 (1998): 1167–72 [35] Daekyu Sun et al., “Facilitation of a Structural Transition in the Polypurine/polypyrimidine Tract within the Proximal Promoter Region of the Human. 47.

(59) VEGF Gene by the Presence of Potassium and G-Quadruplex-Interactive Agents,” Nucleic Acids Research 33, no. 18 (2005): 6070–80 [36] Richard De Armond et al., “Evidence for the Presence of a Guanine Quadruplex Forming Region within a Polypurine Tract of the Hypoxia Inducible Factor 1 Alpha Promoter,” Biochemistry 44, no. 49 (2005): 16341–50 [37] Kexiao Guo et al., “Formation of Pseudosymmetrical G-Quadruplex and I-Motif Structures in the Proximal Promoter Region of the RET Oncogene,” Journal of the American Chemical Society 129, no. 33 (2007): 10220–28 [38] Sarah Rankin et al., “Putative DNA Quadruplex Formation within the Human c-Kit Oncogene,” Journal of the American Chemical Society 127, no. 30 (2005): 10584–89 [39] Dik-Lung Ma, Victor Pui-Yan Ma, Ka-Ho Leung, Hai-Jing Zhong, Hong-Zhang He, Daniel Shiu-Hin Chan and Chung-Hang Leung (2013). Structure-Based Approaches Targeting Oncogene Promoter G-Quadruplexes, Oncogene and Cancer - From Bench to Clinic, Dr. Yahwardiah Siregar (Ed.), InTech [40] Dipankar Sen and Walter Gilbert, “Formation of Parallel Four-Stranded Complexes by Guanine-Rich Motifs in DNA and Its Implications for Meiosis.,” Nature 334, no. 6180 (1988): 364–66 [41] Denis Drygin et al., “Anticancer Activity of CX-3543: A Direct Inhibitor of rRNA Biogenesis,” Cancer Research 69, no. 19 (2009): 7653–61 [42] Rumen Kostadinov et al., “GRSDB: A Database of Quadruplex Forming G-Rich Sequences in Alternatively Processed Mammalian Pre-mRNA Sequences.,” Nucleic Acids Research 34, no. Database issue (2006): D119–124 [43] Laurence H Hurley et al., “G-Quadruplexes as Targets for Drug Design,” Pharmacology & Therapeutics 85, no. June 2016 (2000): 141–58 48.

(60) [44] Guangtao Song and Jinsong Ren, “Recognition and Regulation of Unique Nucleic Acid Structures by Small Molecules.,” Chemical Communications (Cambridge, England) 46, no. 39 (2010): 7283–94 [45] Anh Tuân Phan, Yasha S. Modi, and Dinshaw J. Patel, “Propeller-Type Parallel-Stranded G-Quadruplexes in the Human c-Myc Promoter,” Journal of the American Chemical Society 126, no. 28 (2004): 8710–16 [46] Jixun Dai et al., “An Intramolecular G-Quadruplex Structure with Mixed Parallel/antiparallel G-Strands Formed in the Human BCL-2 Promoter Region in Solution,” Journal of the American Chemical Society 128, no. 4 (2006): 1096–98 [47] Jixun Dai et al., “NMR Solution Structure of the Major G-Quadruplex Structure Formed in the Human BCL2 Promoter Region,” Nucleic Acids Research 34, no. 18 (2006): 5133–44 [48] Prashansa Agrawal et al., “The Major G-Quadruplex Formed in the Human BCL-2 Proximal Promoter Adopts a Parallel Structure with a 13-Nt Loop in K+ Solution,” Journal of the American Chemical Society 136, no. 5 (2014): 1750–53 [49] T Ha et al., “Probing the Interaction between Two Single Molecules: Fluorescence Resonance Energy Transfer between a Single Donor and a Single Acceptor.,” Proceedings of the National Academy of Sciences 93, no. 13 (1996): 6264–68 [50] T Ha, “Single-Molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer,” Methods (Duluth) 25, no. 1 (2001): 78–86 [51] 李以仁、許顥頤、秦志皞、吳佳諭，「單分子螢光共振能量轉移光譜簡介」。化學，73 卷 4 期，303-312 [52] Paul R. Selvin and Taekjip Ha, Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual, CSHL Press, 2008 49.