2-1 皮膚構造
皮膚為人體的最大器官，表面積大約有 1.6~2.0 平方公尺，包覆 著我們身體，具有保護、感覺、調節體溫等功能，防止外來的各種刺 激傷害。皮膚結構由上而下大致可分為表皮 (Epidermis)、真皮 (Dermis)、皮下組織(Hypodermis)三層表皮層。表皮層有(a)角質細胞 (Keratinocytes) 、(b)郎格罕氏細胞(Langerhans)、(c)黑色素母細胞 (Melanosome)，圖 2-1。其中黑色素母細胞內有黑色體(Melanosome) 分泌黑色素(Melanin)，可吸收可見光及紫外光，做為保護的色素。
圖 2-1 皮膚表皮構造圖 (a)
(b)
(c)
角質層 透明層
顆粒層
有棘層
基底層
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2-1.1 黑色素細胞
黑色素細胞為單細胞的分泌器官，佔表皮約5~10 %，位於基底層 及毛根部及毛跟外鞘層，其功能是形成黑色素。這種色素是在黑色素 細胞內的小胞器-黑色素顆粒體(Melanosome)合成後，會經由黑色素細 胞的樹枝狀突起而向周圍相鄰角質細胞移動。
人體皮膚內所含黑色素細胞在不同人種間其分部密度大至是相 同，人種間膚色差異主要是由各個黑色素細胞形成黑色素顆粒體能力 與黑色素顆粒體往表皮移動的數目，成熟度及存在形式所造成的。
每人平均約有20億個黑色素細胞，大約以7~8個基底細胞比1個黑 色素細胞比例存在。黑色素細胞在人體中除了存在於皮膚基底層及頭 髮毛囊外，於軟腦膜和眼睛脈絡膜中也都有黑色素細胞[8,9]。
2-1.2 黑色素生成機轉
黑色素生成與體內酪胺酸酶(Tyrosinase)之活性有關。黑色素 生成過程首先被 Raper 提出，再經由 Mason 的證實與補充而確定，
因此可將黑色素之形成過程稱為 Raper-Mason pathway。黑色素生成 機轉(圖 2-2)，由體內有一種胺基酸稱為酪胺酸(tyrosine)，在酪胺酸酶 (tyrosinase)氧化變成多巴(L-Dopa)，再變成多巴醌(L-Dopaquinone)，
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開始合成與黑色素合成有關酵素，另外還有兩種與酪胺酸酶有關的蛋 白質，如 TRP-1 與 TRP-2 經由這種路逕形成可分為真黑色素
(Eumelanin)和嗜黑色素(Pheomelanin)，最後形成混合型黑色素(mixed type melanins)。
Eumelanin 為黑色或茶色的色素蛋白質在人體內是由皮膚、
黏膜、毛髮黑色素細胞所合成。由酪胺酸經多巴醌產生 DHI，再經氧 化聚合作用產生。Pheomelanin 為黃紅色的含硫色素蛋白質在人體毛 髮中形成。由酪胺酸衍生而來，經由多巴醌在與 Glutathione 或 Cysteine 結合，形成 Cysteinyldopa 產生 Benzothiazine。
了解黑色素形成機轉再藉由美白劑來抑制、還原或破壞黑色素，
減少黑色素形成，而達成皮膚美白效果，大致可分為這四個作用點。
(1)減少黑色素的形成
黑色素形成過程中，抑制酪胺酸脢活性的作用機制最為常見。
如植酸(Phytic acid)、麴酸(Kojic acid)的美白原理是利用螯合銅離子的 機制，使酪胺酸脢失去活性，阻斷黑色素生成。
(2)還原已生成的黑色素
典型的成分如維他命 C (L-ascorbic acid)及其衍生物，可於酪胺 酸轉變為黑色素的反應中，將黑色素的中間體 Dopaquinone 還原成 Dopa，抑制黑色素形成。此種還原作用具有可逆性。
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(3)防止黑色素形成
酪胺酸酶抑制劑對酪胺酸酶活性的影響為凝結作用，酪胺酸酶 為黑色素形成所需的基本物質，抑制劑存在使之酪胺酸酶無法與酪胺 酸無法進行一連串連鎖反應生成黑色素。文獻上有抑制酪胺酸酶活性 成分:杜鵑花酸(Azelaic acid)、熊果素(Arbutin)作為酪胺酸酶反應介質，
競爭酪胺酸導致酪胺酸酶作用之介質減少，抑制黑色素形成。
(4)黑色素細胞破壞作用
破壞黑色素母細胞，造成結構改變，而此類最典型成分:汞化合 物(Mercurous Compound) 塗抹後滲入皮膚與表皮層蛋白質結合，破 壞酵素，始酪胺酸酵素活動力受阻，減少黑色素生成效果十分明顯；
對苯二酚(Hydroquinone)可以產生 Semiquinone 的自由基。此作用方 式的缺點後遺症多且不會產生黑色素而導致皮膚癌或病變。
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圖 2-2 黑色素(Melanin)合成路徑圖[8]
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9 Potassium Methoxysalicylate 甲氧基水楊酸鉀鹽 1.0%~3.0 % 10 3-O-Ethyl Ascorbic Acid 3-氧-乙基維生素 C 1.0%~2.0 % 11 5,5’-Dipropyl-biphenyl-2, 2’ -diol 5, 5-二丙基二苯基-2,
2-二醇 0.5%
12 Cetyl Tranexamate HCI 傳明酸十六烷基酯 3.0％
13 Ascorbyl Tetraisopalmitate 維他命 C 四異棕櫚酸
脂 3.0％
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2-3 美白劑介紹
本研究所要分析的美白劑是現今最常添加於美白化粧品，表 2-2 為本研究所選用七種美白劑的理化特性，其介紹如下:
2-3.1 維生素 C 及其衍生物
維生素 C 學名為抗壞血酸(Ascorbic acid)結構中含有烯二醇基 (Enediol group)，其酸性較羧基(Carboxyl group)酸性大，可與鹼作用 形成鹽類，其對光、熱都相當敏感在鹼性之下完全被破壞。因此有許 多維生素 C 相關衍生物被開發並運用在化妝品上[8]，像是維生素 C 醣苷、維生素 C 磷酸鎂鹽、維生素 C 磷酸鈉鹽、3-氧-乙基維生素 C 等。
維生素 C 及其衍生物其美白作用機制:酪胺酸轉換成黑色素的酪 胺酸反應中經由還原作用將黑色素中間體多巴醌(Dopaquinone)加以 還原，發揮其抑制黑色素形成作用；可將深色氧化型黑色素加以還原 而形成淡色還原型黑色素，進而達到美白作用。
2-3.2 麴酸
麴酸近幾年被大量使用在化粧品中，其美白作用機制:酪胺酸酵 素的抑制劑，藉由結構上第四位置 Carbonyl group 及第五位置的 Hydroxy group 螯合作用將酪胺酸酵素的銅離子移除，達到抑制酵素
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的活性，影響酪胺酸酵素將 N-acetyl tyrosine 氫氧化為 N-acetyl dopa 和 N-acetyl dopaquinone 的過程，進而阻斷黑色素生成。
研究指出麴酸使用含量過高皮膚會產生過敏現象，在日本衛生最 高機關-厚生省被列為禁藥，根據厚生省研究發現，長期餵食麴酸老 鼠容易罹患癌症[12]，但若不經食用僅在皮膚上使用不經肝臟代謝是 無害的。
2-3.3 熊果素
熊果素為一分子的 Hydroquinone 與一分子 Glucose 所結合，在 弱酸下易水解得 Hydroquinone。其美白作用機轉就是透過與酪胺酸 競爭酪胺酸脢的活性位置而使酪胺酸酶失去活性，阻礙黑色素的形成 [13]。衛生福利部 89 年公告熊果素 (Arbutin)可使用於化粧品美白劑，
熊果素使用限量 7％，且不可摻入對苯二酚，同時製品中所含不純物 對苯二酚須低於 20ppm 。如長期使用高濃度，可能會使皮膚免疫力 下降。
2-3.4 對苯二酚
對苯二酚可產生 Semiquinone 自由基，破壞細胞膜，造成黑色素 結構改變，進而達到美白效果。醫學上藥用標準約 2~5％ ，超過 5
％可能會引起皮膚吸收的全身性副作用[14]而目前衛生福利部並未
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核准使用在化粧品上。行政院衛生署於七十九年二月二十八日，衛生 藥字第 8549964 號函明示“市售化粧品經檢驗含有對苯二酚成份者，
不論其含量均列為藥品管理化粧品不得添加”。
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表 2-2 七種美白劑之理化性質
分析物 維生素 C 維生素 C 醣苷 維生素 C 磷酸鎂鹽
化學名 L-Ascorbic acid Ascorbic acid 2-glucoside L-Ascorbic acid phosphate magnesium salt
結構式
IUPAC name
(5R)-[(1S)-1,2-dihydroxyethyl]- 3,4-dihydroxyfuran-2(5H)-one
2-O-a-D-Glucopyranosyl- L-ascorbic Acid
Magnesium di-L-ascorbate ismagnesium (5R)-5-[(IS)-1,2dihydroxyl]-3-hydroxy
CAS No. 50-81-7 29499-78-1 108910-78-7
化學式 C6H8O6 C12H18O11 C6H7MgO9P
分子量 176.12g mol-1 338.26g mol-1 278.39g mol-1
使用限量 --- 2％ 3％
縮寫 AA AA2G MAP
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表 2-2 七種美白劑之理化性質(續)
分析物 3-氧-乙基維生素 C 麴酸 熊果素 對苯二酚
化學名 3-O-Ethyl Ascorbic Acid Kojic acid Arbutin Hydroquinone
結構式
IUPAC name
(2R)-2-[(1S)-1,2-dihydroxyethyl]- 3-ethoxy-4-hydroxy-2H-furan-5-one
5-Hydroxy-2-(hydroxymethyl) -4H-pyran-4-one
(2R,3S,4S,5R,6S)-2-Hydroxymethyl- 6-(4-hydroxyphenoxy)oxane-3,4,5
-triol
Benzene-1,4-diol
CAS No. 86404-04-8 501-30-4 497-76-7 123-31-9
化學式 C8H12O6 C6H6O4 C17H16O7 C6H6O2
分子量 204.18g mol-1 142.11g mol-1 272.25g mol-1 110.11 g mol-1
使用限量 1~2％ 2％ 7％ ---
縮寫 3OEAA KA AR HQ
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2-4 美白劑相關之研究
美白劑分析檢驗方法，以薄層層析(TLC)[1,2]、高效能液相層析 (HPLC)、氣相層析(GC)[3]、分光光度法(Spectrophotometry)[4,5、微 胞電動層析(MEKC)[6,7]，但以 HPLC 分析方法為主。針對上述分析 方法，高效能液相層析法在分析化粧品中美白劑，有比其他分析方法 簡便極高選擇性的優勢。以下就針對 HPLC 及 GC 分析方法做介紹。
表 2-3 為統整美白劑分析方法及詳細內容。
2-4.1 高效能液相層析(high performance liquid chromatography；HPLC) HPLC 常被使用於化粧品分析美白劑中，靈敏度、精確度高，能 夠因應分析物需求改變靜相類型、移動相組成及偵測器種類、適用於 高沸點不易揮發、分子量大、不同極性有機化合物。下列幾種由 HPLC 以不同移動相及固定相組成分析美白劑的方法:
(1)逆相層析法 (Reverse-phase Liquid Chromatography ;RPLC)
2007 年衛生福利部食品藥物管理署建議化粧品中美白劑檢測方 法[15]，同時測定維他命 C 磷酸鎂鹽、維他命 C 葡萄醣苷、對苯二酚、
熊果素、麴酸，以 COSMOSIL 5C18-AR-II 250×4.6mm 為固定相，
0.05M 磷酸二氫鉀溶液(pH 2.5) :甲醇( 99:1v/v )混液再以濾膜過濾為 移動相，等度沖提。光二極體烈陣檢出器，波長 280nm。樣品前處理
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取檢體約 0.1g 以 0.05M 磷酸二氫鉀溶液溶解定量至 20ml，超音波震 盪約 30 分鐘，冷卻至室溫，以濾膜過濾即可上機。檢出限量分別為 維生素 C 磷酸鎂鹽 0.08μg/ml、維生素 C 葡萄糖苷 0.04μg/ml、麴酸 0.008μg/ml、熊果素 0.04μg/ml、對苯二酚 0.02μg/ml。
2008 年 A. Balaguer 等人[16]，使用環保的方法同時測定化妝品 中為生 C 及其衍生物，維他命 C、維生素 C 棕梠酸脂、維生素 C 醣 苷、維生素 C 鹽類(鎂鹽或鈉鹽)以 Octadecylsilica (C18)做為固定相，
50mM 磷酸緩衝溶液(不同的 pH 值)加入 0.1M 氯化鈉:乙醇，梯度沖 提。偵測極限在 2 至 6μg/ml 之間。
(2)離子對層析法 (Ion-pair Chromatography
;
IPC)離子對層析法是逆相分配層析法的一種，以離子對試劑在固定相 上生成暫時之離子交換基位，或與分析物生成離子配對而改變分析 物在移動相與固定相間之平衡關係，而達到分離的目的，用來分離離 子化合物。
離子對層析技術分離機制常以下列三種作用模式來解釋：
(1)離子交換模式，此種模式認為離子對試劑先於固定相表面生成離 子交換基，再與分析物作用，如同離子交換層析的反應。
(2)離子配對模式，此種模式認為分析物先與離子對試劑生成離子配 對後，於系統中與固定相及移動相進行平衡作用。
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(3)離子作用力模式，認為分析物之滯留行為乃與固定相表層離子對 試劑在移動相沖提液作用力平衡關係而生成。
2011 年由 A. C. Wang 等人[17]，使用離子對液相層析法同時分離 維他命 C、麴酸、熊果素、對苯二酚、維他命 C 磷酸鎂鹽，以 Inertsil ODS-3V 250×4.6mm 5μm 為固定相，緩衝液為 50mM 磷酸二氫鈉再 加入 2mM 溴化十六烷三甲基銨(pH 值 4.5)，移動相為梯度沖提，第 一階段為 0 至 20 分鐘乙腈與緩衝溶液( 1 : 99 )混合，第二階段 21 至 41 分鐘乙腈與與緩衝溶液( 70 : 30 )混合，第 41 分鐘回復以乙腈與緩 衝溶液( 1 : 99 )混合，平衡時間 10 分鐘，總分析時間為 51 分鐘。流 速 1ml/min，樣品注射量 10μl，檢測波長 270nm。線性相關系數值( r2 ) 0.9968~0.9997，回收率介於 96.97％至 100.80％。
2003 年由 C. M. Chang 和 M. L. Chang 的研究[18]以離子對層析 法來測定化粧品中親水性美白劑維生素 C、熊果素、維他命 C 磷酸鎂 鹽、甘醇酸，作者所使用離子對試劑為 Butylammanium hydroxide (TBAH)再搭配 0.05M 磷酸二氫鉀水溶液(pH 值 2.5)做為移動相，以 Stainless-steel Mightysil RP-18GP 為固定相，維他命 C 磷酸鎂鹽滯留 時間不但延長，且得到良好的分離效果。樣品注射量 25μl，流速 1ml/min，紫外光/可見光偵測器 ，檢測波長 220nm。線性相關系數
2003 年由 C. M. Chang 和 M. L. Chang 的研究[18]以離子對層析 法來測定化粧品中親水性美白劑維生素 C、熊果素、維他命 C 磷酸鎂 鹽、甘醇酸，作者所使用離子對試劑為 Butylammanium hydroxide (TBAH)再搭配 0.05M 磷酸二氫鉀水溶液(pH 值 2.5)做為移動相，以 Stainless-steel Mightysil RP-18GP 為固定相，維他命 C 磷酸鎂鹽滯留 時間不但延長，且得到良好的分離效果。樣品注射量 25μl，流速 1ml/min，紫外光/可見光偵測器 ，檢測波長 220nm。線性相關系數