4-1 七種美白劑紫外線吸收波長探討
以紫外光-可見光分光光譜儀進行測試，波長掃描範 200~400nm 之間。測試結果七種美白劑之特定吸收波峰波長(圖 4-1)，表一為各 美白劑最大吸收波峰。維生素 C 、維生素 C 磷酸鎂鹽、維生素 C 醣 苷及麴酸最大吸收波再 260nm，熊果素、對苯二酚最大吸收波為 280nm，
3-氧-乙基維生素 C 最大吸收值較低則在 240nm。而本實驗 HPLC 系 統所使用紫外光可見光 UV/Vis 偵測器為 HITACHI L-7420，經評估後 選擇 264nm 做為偵測波長。
表 4-1 七種美白劑，最大吸收波峰
化合物名稱 最大吸收波
維生素 C (AA) 260nm
維生素 C 磷酸鎂鹽 (MAP) 260nm
維生素 C 糖苷 (AA2G) 260nm
3-氧-乙基維生素 C (3OEAA) 244nm
熊果素 (AR) 220、282nm
對苯二酚 (HQ) 221、288nm
麴酸 (KA ) 216、268nm
45
圖 4-1(a)維生素 C(b)維生素 C 磷酸鎂鹽(c)維生素 C 醣苷(d)3-氧-乙基 維生素 C(e)熊果素(f)對苯二酚(g)麴酸(20μg/ml) 溶於二次水之 UV 吸 收圖譜。
(g) (a) (a)
(c)
(b)
(d)
(e) (f)
46
Mobile phase (4℃) 第一天
第三天 第五天
(b) (a)
47
48
4-3
不同濃度 TBAH 離子對試劑影響各美白劑層析結果之探討本實驗使用七種美白劑標準溶液 50μg/ml 溶液，再以溴化四丁 基銨(TBAH)配製 2、5、10、15mM 四種不同濃度進行實驗，結果顯 示圖 4-6，添加 15mM (TBAH)離子對試劑時，維他命 C 磷酸鎂鹽滯 留時間延長至 30 分鐘；添加 2mM (TBAH)維他命 C 磷酸鎂鹽滯留時 間大幅減短。維生素 C 及維生素醣苷相鄰波峰與麴酸及熊果素兩相 鄰波峰解析度是此七種美白劑中要有良好的解析度是較困難，添加 2mM (TBAH)維生素 C 及維生素醣苷之間解析度為 2.71 與其他離子 對試劑濃度相比雖然分離度不是最大，但值大於 1.5 以上為完全分離，
層析時間也只需要 20 分鐘就能達到所有化合物完全分離，本實驗考 慮到分析實驗中都盡可能將分析時間縮短，提高效率，減少有機廢液 產量，故本實驗選擇添加 2mM TBAH 離子對試劑作為移動相的組成。
圖 4-7 添加不同離子對試劑濃度之層析圖譜。
解析度計算公式: R=
∆ Wave =
t 2-t 1
∆Wave
49
(a)
(b)
圖 4-6 添加不同離子對試劑濃度(a)滯留時間(b)解析度之相較圖 (層析條件如 3.3-2 中所述)
50
圖 4-7 添加不同離子對試劑濃度之層析圖譜，(a)2mM (b) 5mM (c)10mM (d) 15mM.Peak 1for AA, peak 2 for AA2G, peak 3 for KA, peak 4 for AR,peak 5 for HQ, peak 6 for MAP, peak 7for 3-O-EAA.
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4-4 不同比例有機修溶劑影響各美白劑層析結果之探討
本實驗使用七種美白劑標準溶液 50μg/ml 以添加不同比例的有 機修飾劑-甲醇，觀察各美白劑滯留時間。其結果顯示圖 4-8，有機修 飾劑甲醇添加量到 6%，沖提強度變強，也會使美白劑在移動相中極 性大小改變，使得滯留時間縮短無法得到好的分離；添加 4%甲醇時，
七種美白劑都有達到分離，維生素 C 與維生素 C 醣苷滯留時間很接 近但是兩個波峰之間解析度也有達到(2.83)，移動相中添加 4%甲醇最 為適當。圖 4-9 添加不同有機修飾劑(Methanol)比例層析圖譜。
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(a)
(b)
圖 4-8 添加不同比例有機修飾劑(a)滯留時間(b)解析度之相較圖 (層析條件如 3.3-2 中所述)
53
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圖 4-9 添加不同有機修飾劑(Methanol)比例層析圖，(a)2％(b)3％(c)4 ％(d) 5％(e) 6％. Peak 1for AA, peak 2 for AA2G, peak 3 for KA, peak 4for AR, peak 5 for HQ, peak 6 for MAP, peak 7for 3-O-EAA.
(e)
1 2
3
4 5 6
7
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4-5 不同 pH 值緩衝溶液影響七種美白劑層析結果之探討
移動相中緩衝液 pH 值會影響離子性分析物的解離相對的也會 影響層析結果。本實驗使用七種美白劑標準溶液 100μg/ml 以 pH 2.5、
pH 5、pH 7 緩衝溶液進行實驗，結果顯示圖 4-10，隨著 pH 值增加維 生素 C 磷酸鎂鹽滯留時間也延後最為明顯。針對維生素 C 與維生素 C 醣苷解析度在 pH 2.5 解析度為 2.83 與 pH 5、pH 7 相較之下是最好的，
而在 pH 2.5 維生素 C 磷酸鎂鹽在此條件下滯留時間也是最短，所有 分析物都可以達到好的分離。因此本實驗移動相緩衝溶液 pH 值調整 至 pH 2.5。圖 4-11 不同 pH 值緩衝溶液層析圖。
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(a)
(b)
圖 4-10 不同 pH 值緩衝溶液(a)滯留時間(b)解析度之相較圖 (層析條件如 3.3-2 中所述)
57
58
選擇以上各參數最佳條件，靜相為 Agilent HC-C18 , 250×4.6mm, 5μm，移動相 0.05M KH2PO4 (pH2.5)、0.2mM TBAH : Methanol 96:4(v/v) 偵測波長為 264nm 流速 1ml/min，樣品注射量 20μl，進行以下實驗。
4-6 檢量線建立
七種美白劑不同濃度混合標準溶液，以 HPLC 的最佳沖提條件 進行分析，結果如表 4-2，七種分析物在 5μg/ml-100μg/ml 濃度範圍內，
線性方程式相關系數(R2)均在 0.9993 以上。圖 4-12 為對七支美白劑 標準品層析圖譜，由圖可見層析順序及個別化合物滯留時間為: (1)維 生素 C 4.24 分鐘 (2)維生素 C 醣苷 4.94 分鐘 (3)麴酸 6.70 分鐘 (4) 熊果素 7.46 分鐘 (5)對苯二酚 12.41 分鐘 (6)維生素 C 磷酸鎂鹽 16.89 分鐘 (7)3-氧-乙基維生素 C 19.68 分鐘。
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表 4-2 七種美白劑之檢量線參數
a檢量線濃度範圍 5μg/ml-100μg/ml
圖 4-12 七種美白劑標準溶液(均為 100 μg/mL)之層析圖
層析條件: Agilent HC-C18 , 250×4.6mm, 5μm，0.05M KH2PO4 (pH2.5)、
0.2mM TBAH : Methanol 96:4(v/v)波長:264nm，流速 1ml/min，樣品 注射量 20μl。Peak 1for AA, peak 2 for AA2G, peak 3 for KA, peak 4 for AR, peak 5 for HQ, peak 6 for MAP, peak 7for 3-O-EAA.
線性方程式 a 相關系數(R2)
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4-7 偵測極限(LOD) 及定量極限(LOQ)
取 0.5μg/ml、1μg/ml 及 2μg/ml 濃度點各測定七次，求出各美白 劑面積平均標準偏差值(SD)檢量線方程式。由 HPLC 測定為偵測極限 (LOD)；定量極限(LOQ)約為偵測極限 3.3 倍。
偵測極限表 4-3，分別為維生素 C 0.03μg/ml、維生素 C 醣 0.05μg/ml、麴酸 0.02μg/ml、熊果素 0.16μg/ml、對苯二酚 0.19μg/ml、
維生素 C 磷酸鎂鹽 0.4μg/ml、3-氧-乙基維生素 C 0.07μg/ml。
表 4-3 偵測極限、定量極限
美白劑 LOD( μg/ml) LOQ( μg/ml)
維生素 C 0.03 0.09
維生素 C 醣苷 0.05 0.16
麴酸 0.02 0.06
熊果素 0.16 0.52
對苯二酚 0.19 0.62
維生素 C 磷酸鎂鹽 0.4 1.32
3-氧-乙基維生素 C 0.07 0.23
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4-8 精密度與準確度
4-8.1 自製樣品含量測試及添加回收率
利用本研究所建立離子對層析分析條件，應用於自製樣品以 評估再現性，圖 4-13、4-14 為自製樣品的層析圖，表 4-4 為自製樣品 含量及添加回收率測試結果。結果顯示用此方法對於同時含有維生素 C、維生素 C 醣苷、維生素 C 磷酸鎂鹽、3-氧-乙基維生素 C、麴酸、
熊果素及對苯二酚樣品，均可得良好的回收率，精華液及乳液回收率 在 94.73-112.56％，所以本實驗中所提出樣品含量測定方法，皆可確 實萃取出不同劑型配方中美白劑含量。
回收率計算公式:
4-8.2 自製樣品安定性評估
本實驗評估自製樣品中含有七種美白劑在不同劑型－精華液、
乳液產品的安定性評估，評估第一天、二天、三天、五天。（樣品製 造日期為：2012 年 7 月 22 日）結果顯示表 4-5，精華液中七種美白 成分前三天含量沒有太大變化到第五天含量就有稍稍下降。配製在乳 液七種美白劑在第三天含量就明顯下降，到第五天其中維生素 C、維 生素 C 糖苷、麴酸、對苯二酚及 3-氧-乙基維生素 C 含量減少更為明
添加樣品含量 － 未添加樣品含量平均
添加量 ×100％
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顯，濃度分別為 0.45、0.48、0.08、0.48、0.43μg/ml。
從數據上得知精華液與乳液比較起來精華液較為安定，這可能 是有關精華液配方中所使用的 pH 3 緩衝溶液，這些美白劑大多屬於 弱酸性相對的在酸性環境下較為安定。
圖 4-13 自製精華液層析圖
圖 4-14 自製乳液層析圖
63
4-8.3 異日間分析(Inter-day)、同日間分析 (Intra-day)
次與次之間(Intra-day)重複性和日與日間(Inter-day)再現性評 估重複注射精密度，重複性試驗一日內連續重複進行三次，再現性實 驗為連續三日。以七種美白劑 5、10、20、50、100μg/ml 標準溶液進 行實驗。重複性、再現性的變異系數(CV)％是以同日、非同日連續注 射三次所得積分面積平均標準偏差(SD)除以積分面積平均值乘以 100。
結果顯示表 4-6，同日分析七種美白劑 CV％值分別在 0.16％~3.04％
之間，無明顯差異(CV＜5％)，所以在同日分析上精密度準確度接有 良好的可信度；而異日分析 CV％值則分別在 0.04％~10.32％之間與 同日分析相較之下 CV％值較大，精確度及準確度就相對來的較差。
變異係數計算公式:
4-8.4 市售樣品測定
將以確立的分析方法運用在市售美白產品，本實驗選用樣品 劑型分別有面膜、精華液、精華乳及乳液。購買產品時選擇在包裝上 特別強調美白、淡斑並含有本實驗七種美白劑為主，檢測含量及添加 回收率測試，實驗皆為三重複。結果顯示表 4-7，樣品 1 標示含有熊 果素及維生素 C 磷酸鎂鹽，實驗結果只測得熊果素 3.3％但未測得維
C.V. =
×100％
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生素 C 磷酸鎂鹽，也許有可能未添加此種成分或者添加量太少在製 造過程中導致成分降解。樣品 3 (熊果素 6％)、樣品 4 (維生素 C 5％) 包裝上皆有顯示添加美白劑含量，檢測結果與標示含量相符。回收率 分別為 97.67±1.8％至 104.78±5.74％。此次購買的產品內含有熊果素 成份皆未測得對苯二酚，其檢測結果都在法規標示含量之內。
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66
表 4-5 自製精華液、乳液安定性
Mean
±
SD ( n=3 )精華液(%) 乳液(%)
美白劑 第一天 第二天 第三天 第五天 第一天 第二天 第三天 第五天
維生素 C 1.01±0.05 0.97±0.04 0.98±0.01 0.96±0.02 0.52±0.07 0.49±0.07 0.46±0.01 0.45±0.01 維生素 C 醣苷 1.01±0.006 1.06±0.001 1.01±0.01 0.98±0.03 0.53±0.08 0.50±0.009 0.50±0.01 0.48±0.003
麴酸 1.08±0.01 1.03±0.03 1.02±0.006 1.0±0.003 0.13±0.005 0.13±0.001 0.097±0.004 0.08±0.0002 熊果素 1.01±0.007 1.09±0.07 0.99±0.06 0.94±0.01 0.49±0.01 048±0.006 0.50±0.02 0.48±0.07 對苯二酚 1.02±0.002 1.07±0.05 1.0±0.004 1.0±0.01 0.52±0.03 0.50±0.008 0.48±0.007 0.48±0.004 維生素 C 磷酸鎂鹽 0.99±0.05 1.09±0.06 0.98±0.05 0.95±0.02 0.47±0.03 0.48±0.02 0.43±0.06 0.46±0.005 3-氧-乙基維生素 C 1.03±0.01 1.10±0.008 0.99±0.03 0.98±0.05 0.53±0.007 0.53±0.004 0.49±0.04 0.43±0.03
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表 4-6 同日分析及異日分析 CV％值
CV％：SD / Mean ( n=3 )
同日 Intra-day CV(％) 異日 Inter-day CV(％)
美白劑 5μg/ml 10μg/ml 20μg/ml 50μg/ml 100μg/ml 5μg/ml 10μg/ml 20μg/ml 50μg/ml 100μg/ml 維生素 C 2.69 3.04 0.23 1.13 0.43 10.32 1.08 0.75 0.77 1.11 維生素 C 醣苷 1.12 1.91 0.59 1.82 0.70 6.97 2.68 1.87 0.005 0.96 麴酸 0.75 1.68 0.76 0.34 0.10 0.41 1.48 2.15 0.65 1.14 熊果素 0.30 2.59 1.30 3.19 1.51 3.59 2.51 7.63 0.53 0.04 對苯二酚 1.88 1.28 0.31 0.27 0.11 1.20 1.43 1.39 1.15 1.29 維生素 C 磷酸鎂鹽 2.25 0.80 1.64 0.52 0.71 2.66 4.29 2.60 4.42 1.87 3-氧-乙基維生素 C 0.50 0.53 0.16 1.16 0.19 2.48 2.70 2.68 1.15 0.78
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表 4-7 市售樣品含量測定
( n=3 )
樣品編號 產品成分表中標示美白劑 標示含量(％) 平均測得濃度(％) 添加量(％) 添加回收率(％)
01
熊果素 --- 3.33±0.04 3.5 97.67±1.8
維生素 C 磷酸鎂鹽 --- 未測得 1 104.45±4.1
02 維生素 C 醣苷 --- 0.01±0.001 0.05 103.08±5.0
03
熊果素 6％ 6.05±0.04 6 98.24±1.09
3-氧-乙基維生素 C --- 0.53±0.004 0.5 104.78±5.7
04 維生素 C 5％ 5.08±0.13 5 99.20±2.9
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