構築表現載體

將ALVa/ ALVb 所增幅出之 PCR 產物經限制酶 EcoRⅠ與 BamHⅠ處理後，將 PCR 產 物與相同處理之載體 pRSET B (Invitrogen, CH Groningen, the Netherlands)進行接合，此表現 載體命名為pRSET 2921，而其經 IPTG 誘導表現出之重组蛋白命名為 ”gp85N ”，其分子量 為28.15 kDa。

除此之外，我們還有王金和老師自美國Avian Disease and Oncology Laboratory (ADOL) 所帶回的表現載體pGEX RavSu。pGEX RavSu 為含有家禽白血病 A 亞群病毒部份 env 基因 (gp85 gene)，而其經 IPTG 誘導表現出之重组蛋白命名為 ”RAV1 ”。

4.9 重組蛋白之表現與纯化

4.9.1 勝任細胞的製備與表現載體的轉殖

以無菌操作方式取ㄧ E. coli BL21(DE3) 或是 E. coli BL21 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 單一菌落於50 mL LB broth 中，於 37℃，250 rpm 下隔夜培養。隔日取 4 mL 菌液加入 400 mL LB broth 中，再於 37℃，250 rpm 下培養至菌液吸光值 OD590為0.375 後，將菌液分裝 於8 管 50 mL 離心管中，並冰浴 5 到 10 分鐘後，再於 4℃下以 1600g 離心 7 分鐘。離心後 去除上清液，每管再以10 mL 預冷之氯化鈣溶液 (60 mM CaCl2, 15% (v/v) glycerol, 10mM PIPES pH7.0) 輕緩的將菌體懸浮起來，於 4℃下以 1100g 離心 5 分鐘。去除上清以後每管 再加入10 mL 預冷氯化鈣輕緩的將菌體懸浮起來，接著置於冰上冰浴 30 分鐘後，在 4℃下 以1100g 離心 5 分鐘。而後去除上清液再以 2 mL 預冷氯化鈣輕緩的將菌體懸浮起來，最後 每250µL 分裝成一管，馬上放於-70℃冷凍保存。

取10 ng 建構好的表現載體 DNA (約 10-25 µL) 於 1.5 mL 小管中，再加入 100 µL 勝 任細胞後進行冰浴10 分鐘，此時 DNA 會因勝任細胞上鈣離子所帶的正電而被吸引至勝任

細胞外圍，故此時不可隨意移動反應小管。待10 分鐘後取出冰浴中的反應小管並將之置於

42℃水浴，進行 Heat shock，此時勝任細胞因熱刺激而於其細胞外壁產生小孔而使原本附

於勝任細胞外之DNA 被吸入細胞內，完成轉殖。完成轉殖後的細胞仍然相當脆弱，因此馬

上加入1 mL 不含任何抗生素之 LB broth，於 37℃，250 rpm 下培養 1 小時，使其恢復。1 小時後將菌液做適當的稀釋後塗於含100 µg/ mL ampicillin 之 LB agar 上，以篩選出具有表 現載體之菌落。篩選出具ampicillin 抗性之菌落更進一步做限制酶切割及定序來確定載體含 有目標片段DNA。

4.9.2 重組蛋白之表現

本實驗所使用的表現細胞為 E. coli BL21(DE3) (Novagen, Madison, WI) 此菌株帶有 T7

RNA polymerase 的基因，而 T7 RNA polymerase 基因可由 lac UV5 promoter 控制，因此可 利用IPTG (isopropyl β-D-thiogalatopyranoside)來誘導基因表現，進而合成出大量的重組蛋 白。將確定轉殖成功的細胞以無菌操作的方式取ㄧ單一菌落於SOB 培養液中，在 37℃，225 rpm 下隔夜培養。隔日取 3 mL 隔夜培養菌液至 200 mL SOB 培養液中，於 37℃，225 rpm 下培養至菌液吸光值 OD600為 0.3。而後加入 IPTG 並使其最終濃度為 1 mM。6 小時後以 5000 g 離心 15 分鐘後去除上清液。再以 20 mL Lysis buffer 1 (50 mM Tris-HCl pH7.8, 5%

glycerol, 0.1 mM EDTA, 200 mM NaCl) 懸浮菌體後，在加入 10 mL Lysis buffer 2 (50 mM EDTA, 10% Triton X-100)，於 4℃下作用一整晚。隔日以超音波震盪機破菌。完成破菌後於 4℃下以 12000 g 離心 15 分鐘，收集上清液與沉澱物，進行蛋白質電泳以確定重組蛋白為 可溶或不可溶蛋白。若重組蛋白位於沉澱物中，則將沉澱物先以4.5 M urea 溶液 (10 mM Tris-HCl pH 7.0, 4.5 M urea, 0.1 M 2-mercaptoethanol, 5% glycerol) 隔夜溶解後，於 4℃下以 12000 g 離心 15 分鐘，收取上清液，剩下之沉澱物再加入 6 M urea 溶液 (10 mM Tris-HCl pH 7.0, 6 M urea, 0.1 M 2-mercaptoethanol, 5% glycerol) 處理 6 小時後，再於 4℃下以 12000 g 離心15 分鐘，收取上清液，殘餘之沉澱物再加入 8 M urea 溶液 (10 mM Tris-HCl pH 7.0, 8 M urea, 0.1 M 2-mercaptoethanol, 5% glycerol) 隔夜處理後，於 4℃下以 12000 g 離心 15 分鐘，

收取上清液。將不同濃度urea 溶液所收得之蛋白質溶液進行電泳以確認重組蛋白較易溶解 於何種濃度中。

4.9.3 重組蛋白之純化

重組蛋白純化主要是使用商業純化套組 Ni-TED^TM (Protein Purification Silica-based purification of 6x His-tagged protein) (Active Motif, Carlsbad, USA) 來進行，首先將粗蛋白加 入純化管柱中，再以2000g 離心 2 分鐘，去除流出液後加入 600µL Buffer A，以 2000g 離心 2 分鐘，去除流出液後再重複加入 600µL Buffer A，以 2000g 離心 2 分鐘，最後加入 100µL Elution Buffer 以 2000g 離心 3 分鐘洗出重組蛋白，此步驟可重覆 4 次，一共可收得 400µL 純化好之重組蛋白。

4.10 重組蛋白之應用

4.10.1 gp85N 塗鍍 ELISA 平盤之製備與應用-Indirect ELISA

將純化好的gp85N 以 coating buffer 稀釋成 50ng/ dL 與 100ng/ dL，再分別以 50ng/ well 及100ng/ well 之 gp85N 加入 ELISA 平盤中 (Immuno-plate, NUCK)，並置於室溫下隔夜塗 鍍後，用340µL/ well 之 PBST (Phosphate buffer saline + 0.1% Tween-80)清洗 1 次，以除去未 結合在ELISA 平盤上的 gp85N。接著加入 100µL/ well 的 blocking buffer (Phosphate buffer saline + 0.1% Tween-80 + 5% nonfat dried milk) 於 ELISA 平盤中，置於室溫下作用 30 分鐘，

以將各well 內的間隙補滿。而後再以 340µL/ well 之 PBST 清洗 1 次以除去多餘的 blocking buffer。將血清以 PBS 做一定倍數稀釋後，分別以 100µL/ well 加入 ELISA 平盤中，再將之 置於37℃恆溫箱中作用 30 分鐘，而後以 340µL/ well 之 PBST 清洗 3 次，除去多餘的血清 後再加入100µL/ well 以 PBS 做 2500 倍稀釋 HRP labeled goat-anti-chicken IgG conjugate (Kirkegaard & Perry Laboratories INC., Gaithersburg, MD)，於 37℃恆溫箱中作用 30 分鐘後，

以340µL/ well 之 PBST 清洗 5 次，最後加入 100µL/ well 的呈色劑 (1 tablet OPD + 12mL substrate buffer + 8µL 30% H2O2) 避光作用 10 分鐘後，加入 100µL/ well 之 stop solution (1M H2SO4) 以終止呈色反應。再以分光光度計 (Bio-Kinetics reader EL 312e, Bio-Tek)讀取 490

nm 波長之吸光值。

4.10.2 不同 gp85N 塗鍍量對抗體偵測結果之影響

為了找出最好的抗原塗鍍量，因此使用不同稀釋倍數 (100 倍、200 倍及 400 倍稀釋) 的 家禽白血病病毒抗血清 (Charles River, North Franklin, CT ) 分別與 50 ng/ dL 及 100 ng/ dL 純化好的gp85N 作用，藉由 OD490的結果來評估抗原的最佳塗鍍量，且不同處理組合均有 3 個血清樣本。

4.10.3 不同血清種類與血清稀釋倍數對抗體偵測結果之影響

為尋求最佳的血清稀 釋條件，先利用不同 亞群之家禽白血病病 毒抗血清 (anti-J antiserum、anti-A antiserum、anti-B antiserum 及 14 週齡 SPF 雞隻血清) 與不同的血清稀釋 倍數 (100 倍、200 倍及 400 倍稀釋) 來觀察 gp85N 的抗原性及不同稀釋倍數下，各血清樣 本與gp85N 間的作用情形，以進一步找出可區分不同亞群之家禽白血病病毒抗血清之最佳 稀釋條件，應用於ELISA 上。將各血清以 PBS 做 100 倍、200 倍及 400 倍稀釋後，分別以 100µL/ well 加入 ELISA 平盤中。不同處理組合都有 3 個血清樣本。

4.11 單株抗體之生產與應用 4.11.1 單株抗體之生產

單株抗體之生產主要是委託濁水溪公司 (台北, 台灣）進行，其中 BALB/c 小鼠之免 疫計畫如下：將含有目標DNA 片段之質體以 25µg/ mL，每次 2 mL 的劑量，用靜脈注射方 式免疫4 隻 BALB/c 小鼠，每二週免疫一次，共免疫四次，而後以 2921/ 00 分離株感染之 DF 1 細胞株進行免疫化學染色，確認小鼠血清免疫效價。接著選擇具最高效價者進行細胞

融合，而後對細胞培養液進行二次陽性孔的篩選，最後選定 2 株陽性株進行單株化選殖，

分別命名為，mAb14 及 mAb22。

4.11.2 單株抗體之確認

4.11.2.1 Immunodot blot assay

取已純化 2921/ 00 分離株、未純化之 gp85N 粗蛋白、pRSET B 空載體經 IPTG 誘導表 現之粗蛋白，以及未純化之RAV1 粗蛋白 (美國 ADOL) 與 mAb14 及 mAb22 進行 Immunodot blot assay 以初步確認單株抗體 mAb14 及 mAb22 是否只會辨識 ALV-J 的抗原。首先將所有 樣本稀釋到 1µg/ mL 後，取 1 µL 樣本點至硝基纖維濾紙 (nitrocellulose membrane) (Protran®

nitrocellulose membrane, 0.45µm, Schleicher & Schuell)，再於室溫下乾燥 30 到 60 分鐘。接 著將點上樣本的硝基纖維濾紙 (nitrocellulose membrane) (Protran® nitrocellulose membrane, 0.45µm, Schleicher & Schuell)置入 0.25% Gelatin-NET 溶液 (0.25% gelatin, 0.15 M NaCl, 5mM EDTA-Na, 0.5% Tween 20, 50mM Tris) 於室溫下緩慢震盪 60 到 90 分鐘以將無蛋白質 部份的硝基纖維濾紙做阻隔。完成阻隔後加入以Gelatin-NET 溶液做 5000 倍及 10000 倍單 株抗體mAb14 及 mAb22，於室溫下緩慢震盪作用 1 小時。接著以 washing buffer (PBS, 0.05%

Tween 20, pH 7.4) 洗硝基纖維濾紙 4 次，每次 5 分鐘。然後加入以 Gelatin-NET 溶液做 2500 倍稀釋的Goat anti-mouse-HRP conjugate (Kirkegaard & Perry Laboratories INC., Gaithersburg, MD)，於室溫下感作 1 小時。重複清洗步驟 4 次後，取出硝基纖維濾紙，加入 TMB (Kirkegaard

& Perry Laboratories INC., Gaithersburg, MD) 進行呈色。

4.11.2.2 免疫螢光分析 (immunofluorescence assay, IFA)

取培養於24 孔細胞培養盤上且確定感染分離株 2921/ 00 之 DF1 細胞，以 acetone: 95%

酒精 (6: 4) 於-20℃下進行細胞固定 10 分鐘。10 分鐘後倒除固定液並將細胞培養盤置於室 溫下乾燥至少30 分鐘。完成乾燥後將 primary antibody 以 PBS 稀釋 500 倍後再於感染細胞 於室溫下作用1 小時，期間要時常觀察避免 PBS 乾掉。1 小時後取出玻片以 PBS 洗去多餘 的primary antibody，清洗時需小心勿直接沖洗到細胞，接著加入以 PBS 稀釋 150-200 的螢 光標示的secondary antibody，同樣於室溫下避光作用 1 小時。1 小時後重複清洗步驟以移 除多餘的抗體。接著於細胞滴上10% mounting solution (10% glycerol, 90% PBS) 並進行封 片，再以螢光顯微鏡觀察結果。

4.11.2.3 單株抗體 之應用-Sandwich ELISA

確認單株抗體辨識 ALV-J 抗原能力後，將單株抗體或 Subgroup J avian leukosis antiserum (Charles River, North Franklin, CT) 以 coating buffer 做 500 倍、5000 倍及 10000 倍 稀釋，再分別以100 µL/ well 之稀釋抗體加入 ELISA 平盤中 (Immuno-plate, NUCK)，並置 於室溫下隔夜塗鍍後，用340µL/ well 之 PBST (Phosphate buffer saline + 0.1% Tween-80)清洗 1 次，以除去未結合在 ELISA 平盤上的 gp85N。接著加入 100µL/ well 的 blocking buffer (Phosphate buffer saline + 0.1% Tween-80 + 5% nonfat dried milk) 於 ELISA 平盤中，置於室 溫下作用30 分鐘，以將各 well 內的間隙補滿。而後再以 340µL/ well 之 PBST 清洗 1 次以 除去多餘的 blocking buffer。將病毒或重组蛋白以 PBS 稀釋至相同的濃度後，再分別以 100µL/ well 加入 ELISA 平盤中，將之置於 37℃恆溫箱中作用 30 分鐘，而後以 340µL/ well 之PBST 清洗 3 次，除去未結合的抗原後再加入 100µL/ well 以 blocking buffer 做 500 倍和 2000 倍稀釋的 Subgroup J avian leukosis antiserum (Charles River, North Franklin, CT) 或單株 抗體，於37℃恆溫箱中作用 30 分鐘後，再以 340µL/ well 之 PBST 清洗 5 次，再加入 100µL/

well 以 blocking buffer 做 2500 倍稀釋 HRP labeled goat-anti-mouse IgG conjugate，於 37℃

恆溫箱中作用30 分鐘後，以 340µL/ well 之 PBST 清洗 5 次，最後加入 100µL/ well 的呈色 劑 (1 tablet OPD + 12mL substrate buffer + 8µL 30% H2O2) 避光作用 15 分鐘後，加入 100µL/

well 之 stop solution (1M H2SO4) 以終止呈色反應。再以分光光度計 (Bio-Kinetics reader, EL 312e) 讀取 490 nm 波長之吸光值。

5. 結果

5.1 台灣有色雞群之血清學調查

自2002 年 11 月起至 2003 年 4 月止，一共調查了 16 群有色雞群，其中公母各半。血 液樣本大致分為兩個來源，其一是種雞場來源的雞隻抗凝血樣本，另外則為屠宰場來源之 抗凝血樣本。各群雞隻之基本資料詳見於Table 1.，其中病例 3068 於病雞剖檢時，在其肝 臟見有腫塊；病例3070 之母雞有產蛋率下降的情形；病例 3093 的雞隻則有蒼白、跛腳的

情形發生；病例3094 的公雞正常，剖檢也未見有異常，但是母雞則外觀蒼白，剖檢時發現

肝臟、脾臟腫大；病例3095 有跛腳情形，剖檢後見有肝脾腫大且有壞死點。本實驗所檢測

的有色雞品種包括安樂、珍珠雞、紅羽土雞等；採樣年齡主要針對12 週齡以上 ALV-J 抗體 陽轉的雞群 (Hunt et al., 2000)。利用 ALV-J 商業用酵素連結免疫吸附套組 (Enzyme-linked immunosorbent assay kit, ELISA kit, IDEXX, Westbook, Maine) 調查台灣北部 4 群雞群、中部

的有色雞品種包括安樂、珍珠雞、紅羽土雞等；採樣年齡主要針對12 週齡以上 ALV-J 抗體 陽轉的雞群 (Hunt et al., 2000)。利用 ALV-J 商業用酵素連結免疫吸附套組 (Enzyme-linked immunosorbent assay kit, ELISA kit, IDEXX, Westbook, Maine) 調查台灣北部 4 群雞群、中部