第三章 實驗材料與方法 實驗材料與方法 實驗材料與方法 實驗材料與方法
3.3 斑馬魚胚胎毒性試驗 斑馬魚胚胎毒性試驗 斑馬魚胚胎毒性試驗 斑馬魚胚胎毒性試驗材料與方法 材料與方法 材料與方法 材料與方法 .1 斑馬魚養斑馬魚養斑馬魚養 斑馬魚養殖殖殖 殖
本實驗動物採用市售野生型(wild-type)斑馬魚，購入後置於魚類養殖循環系統 進行馴養，如圖 3-1 所示。放置魚苗於系統前，循環養殖系統的溫度設定在 26±1℃，
需先將系統裡的水曝氣一日以上，去除水中餘氯與增加溶氧，且等到原本運送時 裝魚苗的水與系統的水溫調整一致後即可放入系統，馴養時依照性別分開飼養於 缸中，以便配對時取用。斑馬魚光週期為 14：10 小時(光：暗)，以市售斑馬魚成 魚飼料(成分：粗蛋白質 46.8%以上，脂肪 5.2%以上)每日餵食兩次，於實驗前三 天另以乾燥豐年蝦餵食種魚補充養分。斑馬魚養殖水使用後會經由管線流至系統 下方的過濾硝化系統進行處理，處理完迴流至養殖魚缸前還有紫外線進行殺菌，
系統循環用水每個月會換水一次，以保持水質品質。
圖 3-1 斑馬魚養殖循環系統
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3.3.2 斑馬魚配對條件與方法 斑馬魚配對條件與方法 斑馬魚配對條件與方法 斑馬魚配對條件與方法
(1) 挑選種魚雄魚：性成熟前後外觀變化不大，保持原本的流線型，臀鰭較母魚長。在身 上各個魚鰭末端，時常可看到有明顯的黃色出現。
雌魚：性成熟後肚子開始膨大，裡面卵囊形成卵，臀鰭較公魚來得小、短且 較圓，魚鰭末端有時也有黃色出現，但相對於公魚出現的時間比較少。
(2) 多對配對：斑馬魚在一定空間內可做多對配對，放置種魚於配對缸的數量不 宜超過10隻，比例以雄魚：雌魚為(n+1)：n較佳。
(3) 配對環境：水溫維持在26~28.5℃之間，光暗週期調控為14：10小時。
(4) 交配情形：經過10小時的暗室環境，斑馬魚在光照後會分泌費洛蒙，雄魚便 會往雌魚方向前去追尾進行交配。
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3.3.3 斑馬魚胚胎毒性試驗 斑馬魚胚胎毒性試驗 斑馬魚胚胎毒性試驗 斑馬魚胚胎毒性試驗
(1) 毒性暴露之胚胎採集a. 經過暗室 10 小時的斑馬魚，光照後待種魚產卵，選取產出 1 小時內的受 精卵進行胚胎試驗。
b. 挑出受精卵至稀釋水(5.0 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2．2H2O, 0.33 mM MgSO4．7H2O)中，並滴入 2~3 滴 0.1 mg/L 的甲基藍溶液殺菌。
c. 將受精卵放置於顯微鏡下，挑選無死亡或變形的胚胎進行毒性試驗。
(2) 待測溶液
a. 模擬含氮溶液：以氯化銨、硝酸鈉與氫氧化四甲基銨三種化合物，分別 配製代表氨氮、硝酸鹽氮與有機氮的模擬含氮廢水。
b. 半導體廢水：取自某半導體廠之三股廢水，分別為氟系與化學研磨製程 廢水(HF/CMP)、製程酸鹼廢水與經處理過之出流水。
(3) 胚胎毒性暴露
a. 每次進行胚胎毒性暴露皆須同時做控制組，確保每次實驗的品質。控制 組取配置好的濃縮儲備溶液，使用前需先稀釋 50 倍，暴露組依每次實驗 內容稀釋不同倍數，每組暴露濃度皆 3 重覆。
b. 配製好的暴露溶液需調整 pH 值至 7.5±0.1。
c. 調整完 pH 值的暴露溶液，放入挑選過的斑馬魚胚胎，靜置 2 小時後即 可將斑馬魚胚胎移入塑膠 96 孔盤，每一個孔盤只放置一顆斑馬魚胚胎。
d. 維持毒性暴露環境溫度於 27~28.5℃。
e. 暴露觀察時間：24、48、60、72 及 96 小時。
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3.3.4 斑馬魚試驗終點觀察 斑馬魚試驗終點觀察 斑馬魚試驗終點觀察 斑馬魚試驗終點觀察
使用受精後 1 小時(hours post fertilization)內的斑馬魚胚胎暴露於控制組及不 同濃度的含氮物質，除了觀察胚胎的死亡情形，並於不同的時間點對斑馬魚胚胎 的孵化情形、心跳速率、胚胎體長與畸形型態進行觀察並記錄。
如表 3-1 所示，每一個觀測的時間點皆會記錄胚胎的死亡情形，並以公式(1) 計算得到胚胎的死亡率，不過本實驗只針對 48 及 96 小時的胚胎死亡率進行探討。
在暴露後 48、60、72 與 96 小時還會觀察胚胎孵化個數，依據記錄的結果計算上 述不同時間點的累積孵化率(如公式 2 所示)。此處亦有觀察胚胎心跳速率，觀測 時間為 48 跟 96 小時，計算心跳前需先將胚胎置於室溫條件 10 分鐘，待胚胎以 穩定的心跳速率跳動再進行計算，每次心跳次數計量採隨機取樣 10 隻斑馬魚胚 胎，並計算其 10 秒的心跳次數，量測結束再以 Excel 計算平均值。最後的暴露觀 測時間點為 96 小時，此時需觀察幼魚發育有無異常的型態，如脊椎彎曲、心包 膜腫大與卵黃囊腫大的現象，記錄其數量與類型並使用公式(3)計算其致畸率。最 後一項觀測項目為量測胚胎體長，此處同樣隨機取樣 10 隻幼魚量測其生長體長，
量測距離如圖 3-2 所示，從頭部頂端量至最後一節體節，量測完以 Excel 計算平 均值。
死亡率% = 暴露胚胎總數 − 胚胎存活個數
暴露胚胎總數 1
累積孵化率% = 胚胎累積孵化個數
暴露胚胎總數 2
畸形率% = 已孵化胚胎之畸形個數
存活幼魚個數 3
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