以斑馬魚胚胎評估半導體廢水之生物毒性

國立交通大學

環境工程研究所

碩士論文

以斑馬魚胚胎評估半導體廢水之生物毒性

Toxicity assessment of semiconductor wastewater

using zebrafish embryos

研究生：吳蕙如

指導教授：黃志彬、袁如馨 教授

以斑馬魚胚胎評估半導體廢水之生物毒性

Toxicity assessment of semiconductor wastewater

using zebrafish embryos

研究生：吳蕙如 Student：Heiju Wu

指導教授：黃志彬、袁如馨 Advisor：Chihpin Huang

Jill Ruhsing Pan

國立交通大學

國立交通大學

國立交通大學

國立交通大學

環境工程研究所

環境工程研究所

環境工程研究所

環境工程研究所

碩士論文

碩士論文

碩士論文

碩士論文

A Thesis

Submitted to Institute of Environmental Engineering

College of Engineering

National Chiao Tung University

in partial Fulfillment of the Requirements

for the Degree of

Master of Science in

Environmental Engineering

October 2013

Hsinchu, Taiwan, Republic of China

中華民國 102 年 10 月

I

以斑馬魚胚胎評估半導體廢水之生物毒性

研究生：吳蕙如 指導教授：黃志彬、袁如馨 教授

國立交通大學

國立交通大學

國立交通大學

國立交通大學

環境工程研究所

環境工程研究所

環境工程研究所

環境工程研究所

摘要

摘要

摘要

摘要

半導體製程中常使用到許多含氮物質作為原物料，導致廢水含氮量過高，排 放至水體會造成優養化及產生毒性。目前環保署公告的放流水管制標準為化學物 質濃度管制，雖可有效控管各事業單位污染物的排放，卻無法反映水體生物可承 受之濃度，因此目前許多國家亦使用生物毒性試驗來評估水體污染程度。相較於 傳統生物毒性試驗單以死亡率為標的，斑馬魚胚胎具有繁殖容易、產量大與胚胎 外觀透明等優勢，不僅可進行大量毒性暴露試驗，亦可直接使用顯微鏡觀察胚胎 發育的狀態以獲得更多毒物暴露後的資訊，因此本研究選用斑馬魚(Danio rerio) 胚胎來評估半導體廢水對水體生物的影響，此處使用模擬含氮廢水與半導體廢水 進行胚胎毒性暴露試驗，所取用的半導體廢水為氟系與化學研磨製程混合廢水、 製程酸鹼廢水以及經處理過的出流水，除觀察胚胎的死亡率，另選用不同的觀測 終點如累積孵化率、心跳、體長與致畸率，分析含氮物質對胚胎發育產生的影響。 斑馬魚胚胎暴露於實驗室配置的氯化銨、硝酸鈉及氫氧化四甲基銨溶液，其 96 小時半數致死濃度值分別為 111 mg NH3-N/L、1347.3 mg NO3--N/L 及 68 mg N/L，

最低效應濃度(Low observed effect concentration, LOEC)為 0.41 mg NH3-N/L、0.51

mg NO3--N/L 及 0.1 mg N/L。經含氮物質暴露後的斑馬魚，皆有累積孵化率下降、

心跳次數降低、生長速度趨緩與畸形發育的現象，而畸形發育的型態有三種，暴 露後出現的先後順序為脊椎彎曲，其次是心包膜腫大，最後為卵黃囊腫大。

II 三股半導體廢水毒性結果顯示，除了氟系與化學研磨製程混合廢水 96 小時死 亡率為 77%，其他兩股廢水的死亡率皆在 20%以下。觀察尚未死亡的斑馬魚胚胎 發現累積孵化率、心跳與生長體長有發育減緩的趨勢，其中又以心跳抑制的現象 最為顯著，且有脊椎彎曲、心包膜腫大與卵黃囊腫大畸形發育的情形。半導體廢 水毒性試驗結果雖為低死亡率，但在終點項目的觀察可發現廢水中的毒性物質對胚胎發 育有產生影響，且與模擬含氮廢水有相似的畸形發育型態，表示此毒性試驗可用於評估 不同類型的暴露溶液與濃度範圍，且可給予更多的毒性訊息，對於毒性評估有很大的潛 力，未來可使用此毒性暴露試驗評估毒性物質對水體的潛在危害。 關鍵字：含氮物質、半導體廢水、毒性、斑馬魚胚胎毒性試驗

III

Toxicity assessment of semiconductor wastewater

using zebrafish embryos

Student：Heiju Wu Advisor：Chihpin Huang

Jill Ruhsing Pan

Institute of Environmental Engineering

National Chiao Tung University

Abstract

In semiconductor manufacturing processes nitrogenous substances are extensively used, resulting in production of very high nitrogen-containing wastewater. The high concentration of nitrogen-containing wastewater discharged to aquatic environment may cause eutrophication and toxicity. Although Taiwan EPA has regulated effluent standards for many pollutants, they are not sufficient to tell us if the discharge is toxic or not. Therefore, many countries are using animals to detect the toxicity of wastewater. Traditional toxicity tests usually use mortality as endpoint, but the sensitivity of this method is not adequate for low concentration pollutants. Zebrafish embryo assay has been regarded as a suitable alternative to the fish acute toxicity test which, apart from ethical reasons, provides very limited data (only LC50)

and no ecotoxicological relevance. Due to transparency and extra-uterine development, zebrafish embryos can be directly observed the phenotypic changes during embryonic development. As a result, in this study zebrafish embryos were used to evaluate the toxicity and teratogenicity in nitrogen-containing wastewater. The purpose of this study is to examine the acute toxicity and developmental abnormalities in synthetic and real wastewater by using zebrafish embryos.

IV

tetramethylammonium hydroxide were 111 mg NH3-N/L, 1347.3 mg NO3--N/L and 68

mg N/L, respectively; the low observed effect concentration were 0.41 mg NH3-N/L,

0.51 mg NO3--N/L 及 0.1 mg N/L, respectively. The endpoints such as hatching rate,

heart rate and body length significantly declined in these three nitrogenous solutions. Abnormalities including spinal curvature, pericardial edema and yolk sac edema were also observed in sequence in zebrafish larvae.

In real wastewater, the HF/CMP wastewater, acid-base wastewater and effluent from a semiconductor manufacturing factory were used. The mortality of zebrafish embryos in the acid-base wastewater and effluent was under 20% and 77% in HF/CMP wastewater in 96 hours. Although the mortality was low in the acid-base wastewater and effluent, the cumulative hatching rate, body length and especially heartbeat significantly decline. Abnormalities including spinal curvature, pericardial edema and yolk sac edema were also observed in real wastewater tests. The results indicate that the zebrafish embryos can be instrumental to detect the potential harm caused by wastewater on aquatic organisms at low concentrations. It suggests that embryo toxicity assay should be used to evaluate the toxicity of wastewater in the future.

Keywords: nitrogenous substances, semiconductor wastewater, toxicity, zebrafish embryo toxicity test

V

致謝

致謝

致謝

致謝

歷經兩年多終於完成我的碩士論文啦，想到這陣子常常看到太陽公公升起的 日子，就有種莫名的感動。首先非常感謝黃志彬 教授這段時間的指導，在我準 備論文期間總能即時的指引我方向，給予我莫大的幫助，還有可愛的袁如馨 教 授，雖然您提前去不同的國度環遊世界，但每次經過您的辦公室依然覺得您仍伴 我左右，想跟您說我已經完成我的論文了，您有看到嗎?在此還要感謝陳伯中 教 授與李季眉 教授義不容辭的教導，因為某些插曲很幸運能夠在攻讀碩士學位期 間接受您們細心的指導，您們對我實驗上的幫助與建議都是幫助我完成論文的動 力。還有親愛的老大—張時獻 教授，您真是我的良師益友，大學時如果沒有您 一步步拉著我往前邁進，我也不會有機會在這裡感謝您，大學四年除了學術上的 指導，您教的待人處事的道理，直至現在我依然受用無窮，未來我會帶著您教我 的精神繼續在人生路途中找尋屬於我的寶物，內化成自身的能量。如果沒有以上 這些 教授，我絕對無法順利完成碩士學位，在此獻上我最深的敬意。 身為黃 Group 驕傲的一員，超級感謝大家這一路的幫忙，首先是年紀一大把 了卻還是有死因仔精神的 哈利，雖然是你帶領我一起貢獻給朵莉無數的咖啡錢， 依然很謝謝你這一年在生物組為我撐腰；我心目中永遠的黃家支柱 OK，當我們 碩二這群小朋友做了什麼蠢事，謝謝妳永遠都是第一個站出來幫我們，每次我的 心中都是無限感激，搞得我現在音頻跟你越來越像了；感謝 大王在我超瞎掰咖 的時候很 man 的背起我，還很細心的幫我處理腳傷，沒有你我怎麼辦；感謝拍照 永遠側臉的走鐘采潔姐 Susu 永遠都在最緊急的時刻伸出援手幫我一把，雖然從 大學時會寄激勵信件的優質學姐形象到後來變質成為搞笑諧星，回不去了~但我 絕對不會忘記妳這段時間的意氣相挺；感謝很油跟愛碎碎念的 阿富，總是在我 很累的時候幫我跑腿替我打氣；感謝四大金釵 小胖、Kitty、揪低、媽媽與全能 Vivi 的陪伴，小碩一時期幸好有你們罩著，我才得以茁壯成老碩二，尤其是我的 好鄰居 小胖，雖然你常常按門鈴會嚇到我，但因為妳常跑來我房間，我才有機 會結交妳這位有義氣的朋友，還跟 Susu 成為妳媽唱 KTV 的固定班底；感謝 芳

VI 瑜、阿強、羽婷、昕維、Eddy 與奕如，在我接近口試那段期間總是有求必應，都 能幫我完成所有的請求。 與我共同度過碩士生涯的好夥伴，如果一路上沒有你們的喧鬧，我的碩士生 活不會如此精采。我相信這世界上沒有 小佑不會的周星馳電影台詞，每次只要 一見面對話就會出現劇中對白，而笑聲充滿特色的 嘎嘎自從發現胃幽門桿菌就 變無敵了，他們兩個只要在一起自動就會變成雙簧組合；進實驗室就是鄰居的 阿 凱，想當初在一館我們也算是不罵不相識，那時還時常陪學長姐寫論文到深夜； 而這屆唯一的陸生也是聰明的 山山，常常都會用大陸口音講出讓我笑翻的話。 雖然我是這屆唯一的女生，走在一起偶爾我會變成大家攻擊的箭靶，但就是你們 吵吵鬧鬧的聲音讓我的碩士生活永遠都不無聊，曾經有苦一起吐，有開心事一起 同樂，這樣度過的兩年生活你們才剛離開不久我就開始懷念了，感謝你們與我共 同營造如此美好的回憶，它將會占據我心中一大位置。 感謝我大學的學長姐 恆菁學姐與大嘴學長，因為你們我在實驗室永遠不會 找不到方向；感謝 彤恩與倚楨我兩位大學親愛的室友兼好朋友，大學幸好有妳 們當我的指南針，讓我在很多事情少走很多冤枉路；我永遠的演唱會夥伴小燕、 Stammer 與采蓉，謝謝你們總會陪我去演唱會上瘋狂，並且聆聽我講生活上的瑣 事；感謝 COS 從高中以來一路的陪伴，不管何時只要我一通電話，妳就能瞭解 我的心情。真的是少了你們哪一個都不行，每一個對我來說都是非常珍貴的。 最後，最最感激的是永遠在背後支持我的家人，感謝你們包容我的任性，並 且總是在我最需要你們的時候適時出現，未來我也會以一樣的心情支持著你們。 吳蕙如 僅致於 國立交通大學環境工程研究所 中華民國 102 年 10 月

VII

目錄

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摘要 摘要 摘要 摘要 ... I Abstract ... III 致謝 致謝 致謝 致謝 ... V 目錄 目錄 目錄 目錄 ... VII 表目錄 表目錄 表目錄 表目錄 ... IX 圖目錄 圖目錄 圖目錄 圖目錄 ... X 第一章 第一章 第一章 第一章 前言前言前言前言 ... 1 1.1 研究背景研究背景研究背景研究背景 ... 1 1.2 研究目的與內容研究目的與內容研究目的與內容研究目的與內容 ... 3 1.3 研究架構研究架構研究架構研究架構 ... 4 第二章 第二章 第二章 第二章 文獻回顧文獻回顧文獻回顧文獻回顧 ... 5 2.1 半導體廢水種類與特性半導體廢水種類與特性半導體廢水種類與特性半導體廢水種類與特性 ... 5 2.2 半導體製程廢水之含氮來源半導體製程廢水之含氮來源半導體製程廢水之含氮來源半導體製程廢水之含氮來源 ... 6 2.2.1 含氮物質對生態環境的危害含氮物質對生態環境的危害含氮物質對生態環境的危害 ... 7 含氮物質對生態環境的危害 2.3 生物毒性檢測生物毒性檢測生物毒性檢測生物毒性檢測 ... 9 2.3.1 生物毒性測試方法生物毒性測試方法生物毒性測試方法 ... 9 生物毒性測試方法 2.3.2 斑馬魚繁殖行為與胚胎發育特性斑馬魚繁殖行為與胚胎發育特性斑馬魚繁殖行為與胚胎發育特性 ... 10 斑馬魚繁殖行為與胚胎發育特性 2.3.3 斑馬魚胚胎毒性試驗之應用斑馬魚胚胎毒性試驗之應用斑馬魚胚胎毒性試驗之應用 ... 14 斑馬魚胚胎毒性試驗之應用 第三章 第三章 第三章 第三章 實驗材料與方法實驗材料與方法實驗材料與方法實驗材料與方法 ... 17 3.1 模擬含氮廢水配製與半導體廢水採集模擬含氮廢水配製與半導體廢水採集模擬含氮廢水配製與半導體廢水採集模擬含氮廢水配製與半導體廢水採集 ... 17

VIII 3.2 分析方法與儀器分析方法與儀器分析方法與儀器分析方法與儀器 ... 17 3.3 斑馬魚胚胎毒性試驗材料與方法斑馬魚胚胎毒性試驗材料與方法斑馬魚胚胎毒性試驗材料與方法斑馬魚胚胎毒性試驗材料與方法 ... 19 3.3.1 斑馬魚養殖斑馬魚養殖斑馬魚養殖 ... 19 斑馬魚養殖 3.3.2 斑馬魚配對條件與方法斑馬魚配對條件與方法斑馬魚配對條件與方法 ... 20 斑馬魚配對條件與方法 3.3.3 斑馬魚胚胎毒性試驗斑馬魚胚胎毒性試驗斑馬魚胚胎毒性試驗 ... 21 斑馬魚胚胎毒性試驗 3.3.4 斑馬魚試驗終點觀察斑馬魚試驗終點觀察斑馬魚試驗終點觀察 ... 22 斑馬魚試驗終點觀察 3.4 數據分析數據分析數據分析數據分析 ... 23 第四章 第四章 第四章 第四章 結果與討論結果與討論結果與討論結果與討論 ... 24 4.1 斑馬魚胚胎暴露於模擬含氮廢水之毒性斑馬魚胚胎暴露於模擬含氮廢水之毒性斑馬魚胚胎暴露於模擬含氮廢水之毒性斑馬魚胚胎暴露於模擬含氮廢水之毒性 ... 24 4.1.1 斑馬魚胚胎之死亡率斑馬魚胚胎之死亡率斑馬魚胚胎之死亡率 ... 24 斑馬魚胚胎之死亡率 4.1.2 斑馬魚胚胎之發育情形斑馬魚胚胎之發育情形斑馬魚胚胎之發育情形 ... 29 斑馬魚胚胎之發育情形 4.2 斑馬魚胚胎暴露於半導體廢水之毒性斑馬魚胚胎暴露於半導體廢水之毒性斑馬魚胚胎暴露於半導體廢水之毒性斑馬魚胚胎暴露於半導體廢水之毒性 ... 42 4.2.1 水質特性分析水質特性分析水質特性分析 ... 42 水質特性分析 4.2.2 斑馬魚胚胎之死亡率與發育情形斑馬魚胚胎之死亡率與發育情形斑馬魚胚胎之死亡率與發育情形 ... 44 斑馬魚胚胎之死亡率與發育情形 第五章 第五章 第五章 第五章 結論與建議結論與建議結論與建議結論與建議 ... 57 5.1 結論結論結論結論 ... 57 5.2 建議建議建議建議 ... 58 參考文獻 參考文獻 參考文獻 參考文獻 ... 59

IX

表目錄

表目錄

表目錄

表目錄

表

表

表

表 2-1 斑馬魚胚胎毒性試驗之應用

斑馬魚胚胎毒性試驗之應用

斑馬魚胚胎毒性試驗之應用 ... 15

斑馬魚胚胎毒性試驗之應用

表

表

表

表 3-1 各項終點觀測時間點

各項終點觀測時間點

各項終點觀測時間點 ... 23

各項終點觀測時間點

表

表

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表 4-1 實廠廢水水質特性分析

實廠廢水水質特性分析

實廠廢水水質特性分析 ... 43

實廠廢水水質特性分析

X

圖目錄

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圖 1-1 研究架構

研究架構

研究架構

研究架構 ... 4

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圖 2-1 雄雌斑馬魚之辨別

雄雌斑馬魚之辨別

雄雌斑馬魚之辨別

雄雌斑馬魚之辨別 ... 11

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圖 2-2 斑馬魚胚胎各階段發育狀態

斑馬魚胚胎各階段發育狀態

斑馬魚胚胎各階段發育狀態

斑馬魚胚胎各階段發育狀態 ... 12

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圖 2-3 斑馬魚各器官分布位置

斑馬魚各器官分布位置

斑馬魚各器官分布位置

斑馬魚各器官分布位置 ... 13

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圖 3-1 斑馬魚養殖循環系統

斑馬魚養殖循環系統

斑馬魚養殖循環系統

斑馬魚養殖循環系統 ... 19

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圖 3-2 幼魚體長量測範圍

幼魚體長量測範圍

幼魚體長量測範圍

幼魚體長量測範圍 ... 23

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圖 4-1 模擬含氮廢水對胚胎死亡率之影響

模擬含氮廢水對胚胎死亡率之影響

模擬含氮廢水對胚胎死亡率之影響 ... 25

模擬含氮廢水對胚胎死亡率之影響

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圖 4- 2 模擬含氮廢水對胚胎累積孵化率之影響

模擬含氮廢水對胚胎累積孵化率之影響

模擬含氮廢水對胚胎累積孵化率之影響 ... 30

模擬含氮廢水對胚胎累積孵化率之影響

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圖 4- 3 模擬含氮廢水對斑馬魚心跳次數之影響

模擬含氮廢水對斑馬魚心跳次數之影響

模擬含氮廢水對斑馬魚心跳次數之影響 ... 33

模擬含氮廢水對斑馬魚心跳次數之影響

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圖 4- 4 模擬含氮廢水對胚胎與幼魚外觀發育之影響

模擬含氮廢水對胚胎與幼魚外觀發育之影響

模擬含氮廢水對胚胎與幼魚外觀發育之影響 ... 36

模擬含氮廢水對胚胎與幼魚外觀發育之影響

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圖 4- 5 模擬含氮廢水對幼魚產生之致畸率與畸形數量

模擬含氮廢水對幼魚產生之致畸率與畸形數量

模擬含氮廢水對幼魚產生之致畸率與畸形數量 ... 37

模擬含氮廢水對幼魚產生之致畸率與畸形數量

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圖 4- 6 模擬含氮廢水對幼魚生長體長之影響

模擬含氮廢水對幼魚生長體長之影響

模擬含氮廢水對幼魚生長體長之影響 ... 40

模擬含氮廢水對幼魚生長體長之影響

圖

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圖 4- 7 不同稀釋倍數之

不同稀釋倍數之

不同稀釋倍數之

不同稀釋倍數之 HF/CMP 製程混合廢水對斑馬魚胚胎死亡率之影響

製程混合廢水對斑馬魚胚胎死亡率之影響

製程混合廢水對斑馬魚胚胎死亡率之影響

製程混合廢水對斑馬魚胚胎死亡率之影響

... 45

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圖 4- 8 不同稀釋倍數之

不同稀釋倍數之

不同稀釋倍數之 HF/CMP 製程混合廢水對斑馬魚胚胎發育之影響

不同稀釋倍數之

製程混合廢水對斑馬魚胚胎發育之影響

製程混合廢水對斑馬魚胚胎發育之影響

製程混合廢水對斑馬魚胚胎發育之影響

... 46

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圖 4- 9 不同稀釋倍數之製程酸鹼廢水對斑馬魚胚胎死亡率之影響

不同稀釋倍數之製程酸鹼廢水對斑馬魚胚胎死亡率之影響

不同稀釋倍數之製程酸鹼廢水對斑馬魚胚胎死亡率之影響 ... 49

不同稀釋倍數之製程酸鹼廢水對斑馬魚胚胎死亡率之影響

圖

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圖 4- 10 不同稀釋倍數之製程酸鹼廢水對斑馬魚胚胎發育之影響

不同稀釋倍數之製程酸鹼廢水對斑馬魚胚胎發育之影響

不同稀釋倍數之製程酸鹼廢水對斑馬魚胚胎發育之影響

不同稀釋倍數之製程酸鹼廢水對斑馬魚胚胎發育之影響 ... 50

XI

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圖 4- 11 不同稀釋倍數之出流水對斑馬魚胚胎死亡率之影響

不同稀釋倍數之出流水對斑馬魚胚胎死亡率之影響

不同稀釋倍數之出流水對斑馬魚胚胎死亡率之影響

不同稀釋倍數之出流水對斑馬魚胚胎死亡率之影響 ... 53

圖

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圖 4- 12 不同稀釋倍數之出流水對斑馬魚胚胎發育之影響

不同稀釋倍數之出流水對斑馬魚胚胎發育之影響

不同稀釋倍數之出流水對斑馬魚胚胎發育之影響

不同稀釋倍數之出流水對斑馬魚胚胎發育之影響 ... 54

1

第一章

第一章

第一章

第一章 前言

前言

前言

前言

1.1 研究背景

研究背景

研究背景

研究背景

半導體產業在台發展已久，不但替台灣經濟帶來可觀的成長，亦帶來許多環 境危害問題亟待處理。根據環保署調查，一個 12 吋晶圓廠每天就能排放出約 1 噸的廢水，且半導體產業製程繁複，會使用多樣化學品，導致產生之廢水成分複 雜，製程廢水主要可分為氟系廢水、一般酸鹼無機廢水、有機廢水及化學研磨廢 水等，其中又以酸鹼廢水水量最大，成分也最為複雜，廢水中含有大量陰陽離子、 有機物質及氨氮等，廢水裡氨氮濃度高達 2000 mg/L (王，2003)_{。然而濃度過高的有} 機氮及氨氮排放至環境水體後，除了本身具有的毒性，還可能轉變成硝酸鹽氮產 生二次污染，這三者皆會造成水質惡化及水體優養化，甚至會危害到水中生物生 存，可見含氮物質對生態可能造成的危害不容小覷。因此環保署已於 100 年 12 月 1 日訂定法規管制氨氮放流水，依據「晶圓製造及半導體製造業放流水標準」， 既有事業氨氮管制採兩階段執行，第一階段限制值 75 mg/L，第二階段限制值 30 mg/L，而硝酸鹽氮原定的管制標準則為 50 mg/L，目前對有機氮，如氫氧化四甲 基銨尚無法規管制(環保署，2011)_。 然而若僅以傳統水質標準來管制含氮放流水的排放，其流放至水體仍有可能 對水生生物造成的潛在危害，因此為彌補水質化學分析測試上之不足，許多國家 早已建立放流水生物毒性檢測方法瞭解放流水中的化學物質對生物的影響，如美 國環保署的全放流水毒性測試方法(Whole effluent toxicity method, WET)，荷蘭的 直接毒性評估(Direct toxicity assessment, DTA)，各國皆發展出各自的方法論(Tislera et

al., 2004; Naddy et al., 2011)_{，我國也於 2005 年公告五種水樣急毒性檢測方法(水蚤、米蝦、}

羅漢魚、鯉魚及粗首鱲) (王，2011)

，開始對放流水急毒性進行規範。

但這些毒性檢測方法的判定終點大多以死亡率為標的(Wollenberger et al., 2000)_，如果

2

已有使用魚類胚胎進行毒性試驗的方法，在魚類胚胎生長的過程觀測不同的實驗 終點如孵化速率、心跳與生長型態等，可避免多數生物測定方法在無效應濃度(No observed effect concentration, NOEC) 或 最 低 觀 察 濃 度 (Lowest observed effect concentration, LOEC)之下所遺漏之訊息。

斑馬魚的胚胎是進行胚胎毒性試驗合適的選擇，因其產卵量大與卵的體積小，

可在小空間進行大量的樣本暴露(OECD, 1992)，且胚胎有外觀透明、發育快速等優勢，

96 小時身體結構即建立完成，使用顯微鏡便可觀察胚胎發育狀態(Lawrence et al., 2007)，

加上斑馬魚的基因有 87%與人體相似，研究所得之毒物資料對人體有很大的參考 價值。德國也已在 2005 年提出標準化學會(Deutsches Institut fur Normung, DIN) 的標準規範，指出以斑馬魚胚胎進行毒性測試的便利性與利用價值，更欲將之應 用在放流水排放規範中。斑馬魚胚胎近幾年常使用在環境毒物研究當中，利用魚 類胚胎可評估工業排放廢水的生物毒性，還可觀察毒物對幼魚發育的影響(Shi et al., 2011)_{。因目前對斑馬魚胚胎暴露於半導體廢水的研究有限，本研究欲評估含氮物} 質對斑馬魚胚胎的生物毒性，找出不同含氮物質對胚胎發育的影響方式，並探討 暴露於實廠廢水與模擬含氮廢水的胚胎毒性試驗結果之關聯性。

3

1.2 研究目的與

研究目的與

研究目的與

研究目的與內容

內容

內容

內容

本研究欲先探討模擬含氮廢水對斑馬魚胚胎存活率的影響，以及胚胎發育過 程是否有延遲發育、生理機能衰退或畸形發育等現象，再取半導體廢水進行胚胎 毒性測試，觀察經實廠廢水暴露的胚胎其生長發育與模擬含氮廢水毒性試驗結果 之間的關聯性。 本研究內容包括： (1) 利用斑馬魚胚胎毒性試驗找出模擬含氮廢水對胚胎的半數致死濃度 (LC50)及最低效應濃度(LOEC)。 (2) 探討斑馬魚胚胎暴露於模擬含氮廢水，對胚胎有無延遲發育、生理機能 衰退以及產生畸形發育的現象，並觀察其畸形表現型態。 (3) 探討斑馬魚胚胎暴露於半導體廢水，其胚胎存活率與幼魚發育情形，並 與模擬含氮廢水暴露結果比較找出其關聯性。

4

1.3 研究架構

研究架構

研究架構

研究架構

本研究欲使用斑馬魚胚胎評估模擬含氮廢水與半導體廢水之生物毒性。實驗 分成兩部分，如圖 1-1 所示，首先利用斑馬魚胚胎暴露於模擬含氮廢水，觀察胚 胎死亡率以及各項終點項目，如累積孵化率、體長、心跳次數與致畸率，瞭解含 氮物質對胚胎產生影響的部位；另採半導體廢水，對廢水水質特性進行分析，並 觀察經半導體廢水暴露的斑馬魚胚胎其死亡率與各項終點項目的發育情形。觀察 所得的結果再使用 SPSS 統計軟體，分析各個暴露濃度的終點項目其顯著性，並 找出斑馬魚胚胎暴露於模擬含氮廢水與半導體廢水間之關聯性。 圖 1-1 研究架構

5

第二章

第二章

第二章

第二章 文獻回顧

文獻回顧

文獻回顧

文獻回顧

2.1 半導體廢水

半導體廢水

半導體廢水

半導體廢水種類與特性

種類與特性

種類與特性

種類與特性

半導體產業之範圍包括積體電路(Integrated circuit, IC)、分離式元件(Discrete devices)及光電元件(Optoelectronic devices)，而在半導體製造亦即晶圓加工(Wafer fabrication)是資金與技術最為密集之處，其上游產業包括產品設計、晶圓製造以 及光罩製造等，下游產業則更為龐大，其中包括半導體後段製程的 IC 封裝、測 試、包裝，以及週邊的導線架製造、連接器製造與電路板製造等，製作過程步驟 多且繁複，且製程原料大多具有毒性，對於環境生態具有相當大的影響，包括廢 水排放、廢氣排放、事業廢棄物處置及有毒化學物質等幾個部分，需特別注意並 加以防範與控制(陳，2007)_。 在半導體製造業所產生的廢水種類大致可分為酸鹼廢水、氟系廢水與化學研 磨廢水。酸鹼廢水主要是集結製程系統中所使用的一些強酸、鹼與去離子水，以 及濕式洗滌法過程中所使用的酸鹼氣體排放所產生；氟系廢水主要是製程中所使 用到的高濃度氫氟酸，通常氟系廢水中的氟離子含量範圍在 500~3000 mg/L，為 此股廢水中很高濃度的污染物，目前雖也會使用添加氨水的氫氟酸來取代高濃度 的氫氟酸，但氨水中的銨離子卻有可能再跟廢水中的氟離子產生氟化氨污染物； 化學機械研磨是半導體產業必備的一項製程，目的是為將晶圓拋光，製程會使用 到大量研磨液，以免薄膜沉積時可能不均勻影響晶圓品質，因此研磨廢水會含有 大量的微粒，以及研磨液中的 pH 緩衝劑與氧化劑皆為強鹼的液體，因此所產生 的廢水也具有高污染性(周，2010)_。

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2.2 半導體

半導體

半導體

半導體製程

製程

製程廢水

製程

廢水

廢水之含氮來源

廢水

之含氮來源

之含氮來源

之含氮來源

半導體產業在台灣為重要的經濟指標之一，可是產業蓬勃發展往往會伴隨大 量廢水的產生，而廢水污染源皆依製造作業各有不同，在所有製程中晶圓清洗是 很重要的程序，為移除晶圓製程中產生的殘留物與控制表面之化學性生成超薄氧 化物，每一道晶圓製程步驟之後以及每一道製程操作之前都必須做晶圓清洗，這 也使清洗成為 IC 製程中重複使用頻率最高的步驟。

一般典型濕式的清洗 RCA 流程會使用多種清洗劑，RCA standard clean 1 (又

稱 APM；NH4OH+H2O2+H2O)為流程裡的其中一種，此清洗劑可移除表面微粒子、

有機及部分金屬污染物，並同時進行氧化及蝕刻增加晶圓表面粗糙度。此外，氧 化膜濕式蝕刻會使用經稀釋的氫氟酸清洗，目前亦有使用緩衝式氧化物蝕刻劑(又 稱 BOE 或 BHF；NH4F/HF/H2O)，可用於取代蝕刻製程中的稀釋氫氟酸，以清除 矽晶圓表面自然生成之二氧化矽層，不過用此清洗劑在蝕刻接觸的過程會產生 NH4F 析出物產生污染(Kern, 1990)。而近期科技廠常使用氫氧化四甲基銨(TMAH)， 主要在玻璃基板時的光顯影製程中做為顯影劑之用，又因其為極強的鹼性溶液 (pH 值高達 13 以上)，亦拿來作為清潔晶圓之溶劑使用(Huynh et al., 1998)。

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2.2.1 含氮物質對生態環境的危害

含氮物質對生態環境的危害

含氮物質對生態環境的危害

含氮物質對生態環境的危害

清洗過程中使用到的氨水、氟化氨與氫氧化四甲基銨三種含氮化合物，排放

至水體不僅會產生污染，亦有文獻指出會對水中生物產生不同程度的生物毒性

(Weinstein and Kimmel, 1998; Lemarie et al., 2004)_{，如能利用胚胎毒性暴露試驗找出含氮物質對胚}

胎早期發育影響的部位，即可瞭解暴露低濃度的含氮化合物對生物的潛在危害。

(1)氨氮

氨氮

氨氮

氨氮

因氨氮為高需氧量物質，流入水體會破壞水域之氧平衡，且氨氮為水體植物 及藻類之營養成分，但過多的氨氮會加速河川湖泊之優養化。對大部分的水生生 物而言，氨氮為有毒物質，必須有效減少水中之溶解氨，才可使水生生物生活的 環境不受影響。如短溝對蝦暴露在不同溫度的氨氮溶液中 96 小時，26℃的 LC50 值為 1.00 mg NH3-N/L。在多齒新米蝦慢毒試驗中，總氨濃度大於 1.14 mg N/L 的 環境下蝦隻成長情形較差，且母蝦的抱卵率、孵出的蝦苗數量以及公蝦的雄性生 殖器指數皆會下降，其對總氨的最大容許濃度為 0.38~1.14 mg N/L(陳，2007)_。氨氮 不僅對食物鏈底端藻類有影響，甚至魚類也無法負荷過高的濃度，如銀鱗鯧的建 議養殖安全值也僅有 0.089 mg NH3-N/L( 李，2011)_{。由此可見氨氮對水中生物的毒性} 影響很大，在低濃度的條件下也可能因為長期暴露而導致死亡( Kir et al., 2004)。

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(2)硝酸鹽氮

硝酸鹽氮

硝酸鹽氮

硝酸鹽氮

硝酸鹽氮是含氮有機物氧化分解的最終產物，雖然在水中毒性比氨氮和亞硝 酸鹽氮低，依然有很多研究顯示硝酸鹽氮對水中生物有毒性，Camargo (2005)指 出硝酸鹽氮對生物的毒性反應，主要是由於硝酸鹽氮會氧化血液中的血紅蛋白， 使得生物失去氧氣攜帶的能力導致慢性中毒，進而擾亂生物的滲透調節造成生物 死亡。由於農業與工業用水的排放，水體中大多存在不同濃度的硝酸鹽氮，因此 亦有許多研究關於水體生物暴露於硝酸鹽氮的毒性，Scott and Crunkilton (2000)

使用水蚤暴露於硝酸鹽，其 48 小時的 LC50為 462 mg NO3--N/L，但不同物種對硝

酸鹽氮的耐受度皆不同，如 Siberian sturgeon (Acipenser baeri)暴露於硝酸鹽氮的 LC50為 1028 mg/L (Hamlin et al., 2006)即比水蚤的毒性低。因此有些研究不單只探討硝

酸鹽氮對生物的致死率，從不同的亞致死劑量可發現即使生物未死亡依然會有其 他生理與生長上的影響，Chambers (2001)發現暴露於低濃度的硝酸鹽，約 1~5 mg NO3--N/L 即會提高銀鮭魚(Oncorhynchus kisutch)與彩虹鱒(Oncorhynchus mykiss)

胚胎的死亡率，且還會減緩胚胎生長的速度。

(3)氫氧化四甲基銨

氫氧化四甲基銨

氫氧化四甲基銨

氫氧化四甲基銨(Tetramethylammonium hydroxide, TMAH)

氫氧化四甲基銨(TMAH)現今已被半導體與光電產業廣泛使用作為顯影劑或

蝕刻劑(Chang et al., 2008)_{，但因 TMAH 為具有毒性與腐蝕性的強鹼溶液，過度暴露於}

TMAH 會對人體產生傷害，過去幾年間已發生多起勞工因接觸過量的 TMAH 而

致死的案例(Wu et al., 2008)_{，因此 TMAH 的毒性很受到重視。目前已有對大鼠進行}

TMAH 毒性暴露測試，當大鼠暴露 2.38%與 25%的 TMAH，其 4 小時的 LD50分

別為 85.9 mg/kg 與 28.7 mg/kg，且發現暴露後的大鼠有支氣管病變、泌尿系統失

禁等現象，TMAH 亦會經由皮膚吸收導致呼吸抑制更嚴重會猝死(Lee et al., 2011)，對

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2.3 生物毒性

生物毒性

生物毒性

生物毒性檢測

檢測

檢測

檢測

2.3.1 生物毒性測試

生物毒性測試

生物毒性測試

生物毒性測試方法

方法

方法

方法

台灣人口成長與產業發展迅速，不過對於環境保護與規劃的法規仍尚未健全， 致使環境污染負荷日益加重，加上廢污水排放至水體後成分極為複雜，在檢驗分 析水中污染物時，往往無法檢測出水中全部的毒性物質，因此除了要考慮傳統水 質參數之外，更須考量有害物質或毒性污染物質對人體健康及生態環境產生的影 響。為解決此一問題，環境科學家乃建議發展以生物為指標之毒性試驗(Bioassay)， 用以輔助化學檢測能力之不足，並作為放流水中毒性物質之管制基準(Smolders et al., 2002; Marugán et al., 2012)_。

一般毒性試驗可分為急毒性(Acute toxicity)與慢毒性(Chronic toxicity)檢測， 短期暴露(96 小時以內)於某一物質，所引起受測生物之致死反應為急毒性，可用 來觀察 個體死 亡或 活動受 抑制等 立即 性的影 響，依 American Public Health Association (APHA)的建議，急毒性試驗的結果可以半數致死濃度(50% Lethal

concentration, LC50)來表示。而慢毒性為生物長時間暴露於測試環境中(一個星期

以上)，可觀察其死亡數量、活動情形，甚至可瞭解生物孵育後代的能力有無受損， 還有致畸胎與遺傳因子突變等影響。而目前水環境之生物毒性測試已有針對急毒 性、慢毒性等訂定不同之測試方法，及選定不同之測試生物，可依試驗者想獲得 的資訊，選擇不同的生物毒性檢測方法(Mishra et al., 2000; Chen et al., 2004)。

不過上述用來檢測急毒性或慢毒性所使用的生物如水蚤、彩虹鱒與鯉魚等， 皆有其試驗上的缺點，水蚤為無脊椎動物且構造簡單，通常只能以死亡率作為毒 性試驗結果的判斷，對於暴露後生長的變化所能獲得的資訊較少。而以魚類作為 毒性測試生物，試驗的成魚需有一定時間的馴養，加上試驗暴露溶液的體積較大， 無法短時間進行大量樣品暴露，暴露後對魚體的分析不易，且還會有大量廢棄物 產生，這些都是傳統生物毒性檢測所會遇到的問題。近年來許多研究開始使用魚

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類胚胎替代傳統毒性檢測的生物，如斑馬魚與青鱂魚皆是良好的胚胎孵育魚種， 其中又以斑馬魚胚胎最為廣泛應用，因其繁殖力強，產出的胚胎量大且體積又小， 可大量進行毒物暴露，加上胚胎外觀透明，利於在暴露期間使用顯微鏡觀察胚胎 發育的完整型態變化，相較於傳統的急、慢毒性檢測方法，能夠在短時間暴露後 獲得更多的訊息(Wedekind et al., 2007; Lammer et al., 2009; Embry et al., 2010)_。

2.3.2 斑馬魚繁殖行為與胚胎發育特性

斑馬魚繁殖行為與胚胎發育特性

斑馬魚繁殖行為與胚胎發育特性

斑馬魚繁殖行為與胚胎發育特性

(1)斑馬魚種類及繁殖行為

斑馬魚種類及繁殖行為

斑馬魚種類及繁殖行為

斑馬魚種類及繁殖行為

斑馬魚(Danio rerio)源自印度東部加爾各答至馬蘇利帕達坦等水域，分類下屬 於輻鰭魚綱(Actinopterygii)、鯉形目(Cyprinidae)、鯉科(Cypriniformes)、魚丹屬 (Danio)，主要分布於孟加拉、印度、巴基斯坦、緬甸、尼泊爾溪流，體色為銀色 或金色。本實驗所採用魚種為野生型斑馬魚，帶有一些藍色或紫色橫紋，雄魚比 雌魚長，由於斑馬魚體型略小，即使發育成熟的斑馬魚體長只有 3~4 公分，最大 約 5 公分(圖 2-1)，飼養上較為便利，目前已被許多科學研究用以做為模式物種， 例如發育生物學、基因體學、神經生物學等領域上，應用非常廣泛。 斑馬魚為廣溫性魚類，可生活於 22~28℃水溫之中，成長至性成熟階段約三 至四個月即可進行繁殖，無繁殖季之分。斑馬魚配對繁殖主要利用光源的控制， 在繁殖之前置於暗室 10 小時，開燈後便會開始追尾產卵，可隨時配合實驗上的 需要進行配對，在實驗室中也易於馴養，且斑馬魚屬於單尾多產，平均每次一對 雄、雌魚產卵量可達 200~300 顆卵，每隔一至兩週便可配對產卵，是繁殖力非常 好的魚種(Lawrence et al., 2007; 龍，2011) 。

11 圖 2-1 雄雌斑馬魚之辨別 (a)雄性、(b)雌性

(2)胚胎特性與發育情形

胚胎特性與發育情形

胚胎特性與發育情形

胚胎特性與發育情形

斑馬魚產出胚胎為沉性卵，不附著於缸壁也不易黏聚在一起，方便實驗使用 上之取用，此外，因胚胎透明且體積小，易於進行外部型態發育及觀察，加上胚 胎發育迅速，在受精後 24 小時內身體架構已建立，大部分內臟器官都在 96 小時 內發育完成，因此深受毒理學、動物行為及魚類生理學學者喜愛。 文獻指出硬骨魚類於胚胎及幼魚時期在生命週期中是較為敏感的階段，因胚 胎發育時細胞、組織及器官發育容易受外界環境之影響，而導致生長的外觀型態 改變，因此透過觀察胚胎的孵化過程，更能準確的評估污染物對生物發育所產生 的干擾(Wedekind et al., 2007; Lammer et al., 2009)_{。以下是胚胎生長的七個時期}(OECD, 1992; Yang et al., 2009)_： (1) 受精卵時期(Zygote period, 0~0.75 hpf)：精子與卵子結合後，細胞開始分裂(圖 2-2 (a, b))。 (2) 細胞分裂時期(Cleavage period, 0.75~2.25 hpf)：細胞持續分裂，直到分裂出一 定數量的細胞(圖 2-2 (c, d))。 (3) 囊胚期(Blastula period, 2.25~5.25 hpf)：在分裂第 14 次後進入囊胚期，至開始 形成原腸。 (4) 外包期(Epiboly, 4.7~10 hpf)：細胞藉由細胞骨架的幫助，一邊分裂一邊漸漸 從動物極(Animal pole)往植物極(Vegetal pole)的過程；這個階段可以幫助我們 很清楚的觀察到胚胎早期細胞移動的速度(圖 2-2 (e, f))。

(5) 原腸期(Gastula period, 5.25~10 hpf)：細胞會移動摺疊，形成三個胚層：外胚

12 層、中胚層、內胚層(圖 2-2 (g))。 (6) 體節形成期(Segmentation period, 10~24 hpf)：各種器官、體節形成，但尚未 發育完成(圖 2-2 (h, i))。 (7) 正常在 48~72 hpf 之間會孵化為斑馬魚幼魚(圖 2-2 (j))。 圖 2-2 斑馬魚胚胎各階段發育狀態(Yang et al., 2009) (a) 0.2 hpf, (b) 0.75 hpf, (c) 1.25 hpf, (d) 2.25 hpf, (e) 4.7 hpf, (f) 5.3 hpf, (g) 10 hpf, (h) 12 hpf, (i) 22 hpf, (j) 48 hpf (hpf, hours-post fertilization)

(a) (b) (c)

(d) (e) (f)

(g) _(h)

(i)

此外胚胎試驗可提供更多易於量化之觀測項目 畸形發育及幼魚的行為觀察 如肌肉神經、生理或行為及型態發育之受損 完全所需的時間，可藉由這些資訊挑選合適的觀測終點 官在魚體的分布位置(Esch (1) 運動系統：24 小時開始有自發運動 (2) 心臟系統：24 小時心室心房構造建立 子通道建立完成。 (3) 神經系統：48 小時腦部神經已建立 (4) 視覺系統：10 小時可在顯微鏡下觀察到眼睛形成 身體已可快速移動， (5) 肝臟系統：60~70 小時構造建立完成 (6) 腸道系統：36 小時開始發展 (7) 腎臟系統：40 小時有過濾血液的功能 圖 2 13 此外胚胎試驗可提供更多易於量化之觀測項目，如孵化時間 畸形發育及幼魚的行為觀察，並可從選擇分析之項目得知不同組織間的生物損傷 生理或行為及型態發育之受損。以下為各部位器官架構建立及發育 可藉由這些資訊挑選合適的觀測終點，而圖 Esch et al., 2012)_。 小時開始有自發運動，68 小時身體已可快速游動 小時心室心房構造建立，60 小時 S 形 looped 小時腦部神經已建立，10 天已有腦部血液屏障 小時可在顯微鏡下觀察到眼睛形成，68 小時對光線有反應 ，5 天後視覺系統才發育完全。 小時構造建立完成，5 天時肝臟發育完全且有運作功能 小時開始發展，5 天後才可以消化攝食的飼料 小時有過濾血液的功能，12 天後中腎發育完成 2-3 斑馬魚各器官分布位置(Esch et al., 2012) 如孵化時間、心跳、體長、 知不同組織間的生物損傷， 以下為各部位器官架構建立及發育 而圖 2-3 為各個目標器 小時身體已可快速游動。 looped 形成，72 小時離 天已有腦部血液屏障。 小時對光線有反應，且 天時肝臟發育完全且有運作功能。 天後才可以消化攝食的飼料。 中腎發育完成。

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2.3.3 斑馬魚胚胎毒性試驗

斑馬魚胚胎毒性試驗

斑馬魚胚胎毒性試驗

斑馬魚胚胎毒性試驗之應用

之應用

之應用

之應用

斑馬魚胚胎毒性試驗除了可觀察暴露毒性物質後胚胎的死亡率，最重要的是可 以知道尚未死亡的胚胎發育成幼魚後，形體與行為上有沒有受到毒性物質的干擾， 亦可幫助我們了解這些毒性物質會影響生物的部位，目前已有許多研究用斑馬魚 胚胎評估水域環境受污染的風險(Scholz et al., 2008)，以及用來檢驗化學物質或藥物可能

對胚胎產生的致畸性(Serbedzija et al., 1999; Selderslaghs et al., 2009; Yang et al., 2009)_。

斑馬魚胚胎毒性試驗應用範圍廣泛，可用來評估觀察奈米金屬、有機物質、 精神病藥物與出流水的毒性，如表 2-1 所示。Garcı´a-Cambero (2012)使用斑馬魚 胚胎評估含有精神科藥物的西班牙河水，偵測結果顯示胚胎經河水暴露後並沒有 嚴重的死亡及畸形的情形，不過卻發現對 6 天大的幼魚進行神經反應測試時，有 行為反應力下降的現象，此結果顯示經河水暴露後的幼魚，其神經系統有受到河 水中毒性物質影響而降低行為靈敏度。而 Jiang (2013)亦使用胚胎來檢驗經六價鐵 化合物處理的藥廠廢水其生物毒性，並得證處理後的出流水不會使胚胎死亡，在 孵化率與致畸率也下降至安全範圍。胚胎毒性試驗除了可以獲得觀察死亡率所無 法得知的訊息外，還可以評估出流水流放至水體的安全性。

15 表 2-1 斑馬魚胚胎毒性試驗之應用

毒性物質

毒性物質

毒性物質

毒性物質

觀測終點

觀測終點

觀測終點

觀測終點

實驗結果

實驗結果

實驗結果

實驗結果

文獻

文獻

文獻

文獻

奈米銀顆粒 (1) 死亡率 (2) 孵化率 (3) 心包膜水腫 (4) 心跳次數 (5) 細胞凋亡 (1) LC50：介於 25~50 µg/L。 (2) 在 24 小時發現心包膜腫大的現象，到 72 小時此現象 變得更加顯著。 (3) 72 小時尚未有胚胎孵化，有延遲孵化的現象。 (4) 當暴露濃度為濃度 50 µg/ml 時，心跳明顯減緩為 39 次 /分(控制組 150 下/分)，且還有 60~90%的幼魚在頭部與 尾巴出現身體變形。 (Asharani et al., 2008) 六溴環十二烷 (HBCD) (1) 死亡率 (2) 孵化率 (3) 心跳 (4) 畸形率 (5) 生長體長 (6) 細胞凋亡 (AO 染色、ROS 量測) (1) 在濃度 1.0 mg/L 時只有 79.2%的孵化率(控制組 90%)。 (2) 與控制組相比，所有暴露濃度的心跳皆有顯著降低。 (3) 當濃度 0.05 mg/L 以上，其體長生長都有抑制現象。 (4) 有脊椎彎曲、外包畸形、卵黃囊和心包膜水腫，尾巴 跟心臟畸形，魚膘無法膨脹等畸形發育情形。 (5) AO 染色發現幼魚眼睛與腦部細胞凋亡的情形較為嚴 重，且隨濃度增加，ROS 量測的 caspase-3 與 caspase-9 含量愈高。

(Deng et al., 2009)

16 表 2-1 斑馬魚胚胎毒性試驗之應用(續)

毒性物質

毒性物質

毒性物質

毒性物質

觀測終點

觀測終點

觀測終點

觀測終點

實驗結果

實驗結果

實驗結果

實驗結果

文獻

文獻

文獻

文獻

三種有機溶劑 (ETOH、 DMSO、 Acetone) (1) 死亡率 (2) 累積孵化率 (3) 心跳 (4) 畸形率 (1) 三種有機溶劑以乙醇的毒性較高，但也要濃度高於 1%才有顯著的胚胎死亡率。 (2) 當乙醇濃度為 1%時即會降低胚胎累積孵化率，且 有較高(30%)的畸形發育現象。 (3) 三種有機溶劑濃度大於 1.5%時，皆會降低胚胎心 跳速率。 (Hallare et al., 2006) 西班牙河水 (含精神科藥 物) (1) 胚胎死亡率 (2) 孵化率 (3) 48 小時心跳次數 (4) 尾部彎曲(往外彎或向內彎) (5) 自發運動與行為模式 (1) 西班牙河水不會造成胚胎死亡，亦沒有出現嚴重的 畸形發育現象。 (2) 對 6 天大的幼魚進行神經反應測試時，有行為反應 力下降的現象，顯示河水中毒性物質會降低斑馬魚 幼魚行為靈敏度。 (Garcı´a-Cambero et al., 2012) 製藥廠廢水 (1) 死亡率 (2) 孵化率 (3) 畸形發育 (1) 未經處理的藥廠廢水雖無造成胚胎死亡，但在 72 小時有 8.3%的胚胎孵化(控制組有 90%)，且有身體 變形、卵黃囊、心包膜腫大等現象。 (2) 經六價鐵化合物處理過的藥廠廢水，在死亡率、孵 化率與畸形發育皆不受影響。 (Jiang et al., 2013)

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第三章

第三章

第三章

第三章 實驗材料與方法

實驗材料與方法

實驗材料與方法

實驗材料與方法

3.1 模擬含氮廢水配製與半導體廢水採集

模擬含氮廢水配製與半導體廢水採集

模擬含氮廢水配製與半導體廢水採集

模擬含氮廢水配製與半導體廢水採集

(1)模擬含氮廢水配製

本實驗以氯化銨、硝酸鈉與氫氧化四甲基銨分別作為氨氮、硝酸鹽氮及有機 氮的代表化合物，每種化合物分別配製 5 個濃度進行斑馬魚胚胎毒性試驗。氯化 銨(Panreac, 99.5%)配製濃度為 200~600 mg/L (氨氮濃度為 50~155 mg/L)；硝酸鈉 (SIGMA-Aldrich, 99.5%)配製濃度為 6000~10000 mg/L (硝酸鹽氮濃度為 990~1650 mg/L)；氫氧化四甲基銨(Alfa Aesar, 25% in water)配製濃度為 200~600 mg/L (總氮 濃度為 30~90 mg/L)。 (2)半導體廢水採集 半導體廠之代表性廢水為氟系廢水、化學研磨製程廢水、製程酸鹼廢水與處 理過之出流水，此處取這幾股廢水進行斑馬魚胚胎毒性評估。但因此公司廢水處 理流程之緣由，氟系與化學研磨廢水為混合成一股之廢水。因此本實驗所取半導 體廢水總共有三股，分別為氟系與化學研磨製程廢水、製程酸鹼廢水與出流水。

3.2 分析方法與儀器

分析方法與儀器

分析方法與儀器

分析方法與儀器

(1) 化學需氧量

化學需氧量(Chemical Oxygen Demand, COD)的檢測採用環檢所公告之重鉻 酸鉀迴流法(NIEA W515.54A)，加入過量重鉻酸鉀溶液以氧化水中有機物質，在 約 50％硫酸溶液中迴流 2 小時，以硫酸亞鐵銨溶液滴定剩餘之重鉻酸鉀，藉由消 耗之重鉻酸鉀量，即可求得水樣中化學需氧量，此可得知樣品中被氧化有機物的 含量。

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使用的 pH meter 型號為 Mettler Toledo FEP20 FiveEasy Plus，每次使用前使用 酸鹼標準液(pH 為 4.0、7.0 及 10.0，25℃)及儀器內建的 RSY 模式進行校正；導 電度計型號為 CLEAN CON 200 CON/TEMP。

(3) 離子層析儀(Ion chromatography, IC)

為偵測水樣中陰(陽)離子之濃度，在此使用型號為 Dionex ICS-1000 的離子層 析儀進行分析，分析前待測水樣需經 0.45 µm 濾紙過濾，當待測溶液隨特定流洗 液流經一系列離子交換層析管柱時，即因其與低容量之強鹼性交換樹脂間親和力 不同而被分離。分離後待測陰(陽)離子再流經一高容量陽(陰)離子交換樹脂之抑制 裝置，而被轉換成具高導電度酸之型態，流洗液則轉換成低導電度之碳酸。經轉 換後之待測陰(陽)離子再流經適當之偵測器，即可依其滯留時間及波鋒面積予以 定性及定量。

(4) 總有機碳分析儀(Total organic carbon analyzer, TOC)

此處使用日本 Shimadzu 公司製造，型號 ASI-L 之總有機碳分析儀，偵測方 法為非分散型紅外線測定方法，用以測定水樣中之 DOC 濃度。首先取適量水樣 經 0.45 µm 濾紙過濾後，利用 HCl 酸化使其 pH 值小於 2，再以高純度氮氣曝氣 12~15 分鐘用以去除水樣中無機碳類，水樣經配有自動吸取裝置之高溫氧化法總 有機碳偵測儀器吸入後，經高感度觸媒於 680℃高溫下氧化水樣，使其中總有機 碳成份轉換成 CO2流經反應器及除濕氣冷卻並乾燥後，進入偵測器分析 CO2濃度， 所得濃度即為 DOC 的濃度。 (5) 顯微鏡

本實驗使用正立干涉位相差顯微鏡(型號為 ZIESS Imager. A2)觀察斑馬魚胚 胎的存活狀態及幼魚發育的形體，並用即時影像拍下斑馬魚胚胎與幼魚的照片。

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3.3 斑馬魚胚胎毒性試驗

斑馬魚胚胎毒性試驗

斑馬魚胚胎毒性試驗

斑馬魚胚胎毒性試驗材料與方法

材料與方法

材料與方法

材料與方法

3.3.1 斑馬魚養

斑馬魚養

斑馬魚養

斑馬魚養殖

殖

殖

殖

本實驗動物採用市售野生型(wild-type)斑馬魚，購入後置於魚類養殖循環系統 進行馴養，如圖 3-1 所示。放置魚苗於系統前，循環養殖系統的溫度設定在 26±1℃， 需先將系統裡的水曝氣一日以上，去除水中餘氯與增加溶氧，且等到原本運送時 裝魚苗的水與系統的水溫調整一致後即可放入系統，馴養時依照性別分開飼養於 缸中，以便配對時取用。斑馬魚光週期為 14：10 小時(光：暗)，以市售斑馬魚成 魚飼料(成分：粗蛋白質 46.8%以上，脂肪 5.2%以上)每日餵食兩次，於實驗前三 天另以乾燥豐年蝦餵食種魚補充養分。斑馬魚養殖水使用後會經由管線流至系統 下方的過濾硝化系統進行處理，處理完迴流至養殖魚缸前還有紫外線進行殺菌， 系統循環用水每個月會換水一次，以保持水質品質。 圖 3-1 斑馬魚養殖循環系統

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3.3.2 斑馬魚配對條件與方法

斑馬魚配對條件與方法

斑馬魚配對條件與方法

斑馬魚配對條件與方法

(1) 挑選種魚 雄魚：性成熟前後外觀變化不大，保持原本的流線型，臀鰭較母魚長。在身 上各個魚鰭末端，時常可看到有明顯的黃色出現。 雌魚：性成熟後肚子開始膨大，裡面卵囊形成卵，臀鰭較公魚來得小、短且 較圓，魚鰭末端有時也有黃色出現，但相對於公魚出現的時間比較少。 (2) 多對配對：斑馬魚在一定空間內可做多對配對，放置種魚於配對缸的數量不 宜超過10隻，比例以雄魚：雌魚為(n+1)：n較佳。 (3) 配對環境：水溫維持在26~28.5℃之間，光暗週期調控為14：10小時。 (4) 交配情形：經過10小時的暗室環境，斑馬魚在光照後會分泌費洛蒙，雄魚便 會往雌魚方向前去追尾進行交配。

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3.3.3 斑馬魚胚胎毒性試驗

斑馬魚胚胎毒性試驗

斑馬魚胚胎毒性試驗

斑馬魚胚胎毒性試驗

(1) 毒性暴露之胚胎採集 a. 經過暗室 10 小時的斑馬魚，光照後待種魚產卵，選取產出 1 小時內的受 精卵進行胚胎試驗。 b. 挑出受精卵至稀釋水(5.0 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2．2H2O, 0.33 mM MgSO4．7H2O)中，並滴入 2~3 滴 0.1 mg/L 的甲基藍溶液殺菌。 c. 將受精卵放置於顯微鏡下，挑選無死亡或變形的胚胎進行毒性試驗。 (2) 待測溶液 a. 模擬含氮溶液：以氯化銨、硝酸鈉與氫氧化四甲基銨三種化合物，分別 配製代表氨氮、硝酸鹽氮與有機氮的模擬含氮廢水。 b. 半導體廢水：取自某半導體廠之三股廢水，分別為氟系與化學研磨製程 廢水(HF/CMP)、製程酸鹼廢水與經處理過之出流水。 (3) 胚胎毒性暴露 a. 每次進行胚胎毒性暴露皆須同時做控制組，確保每次實驗的品質。控制 組取配置好的濃縮儲備溶液，使用前需先稀釋 50 倍，暴露組依每次實驗 內容稀釋不同倍數，每組暴露濃度皆 3 重覆。 b. 配製好的暴露溶液需調整 pH 值至 7.5±0.1。 c. 調整完 pH 值的暴露溶液，放入挑選過的斑馬魚胚胎，靜置 2 小時後即 可將斑馬魚胚胎移入塑膠 96 孔盤，每一個孔盤只放置一顆斑馬魚胚胎。 d. 維持毒性暴露環境溫度於 27~28.5℃。 e. 暴露觀察時間：24、48、60、72 及 96 小時。

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3.3.4 斑馬魚試驗終點觀察

斑馬魚試驗終點觀察

斑馬魚試驗終點觀察

斑馬魚試驗終點觀察

使用受精後 1 小時(hours post fertilization)內的斑馬魚胚胎暴露於控制組及不

同濃度的含氮物質，除了觀察胚胎的死亡情形，並於不同的時間點對斑馬魚胚胎 的孵化情形、心跳速率、胚胎體長與畸形型態進行觀察並記錄。 如表 3-1 所示，每一個觀測的時間點皆會記錄胚胎的死亡情形，並以公式(1) 計算得到胚胎的死亡率，不過本實驗只針對 48 及 96 小時的胚胎死亡率進行探討。 在暴露後 48、60、72 與 96 小時還會觀察胚胎孵化個數，依據記錄的結果計算上 述不同時間點的累積孵化率(如公式 2 所示)。此處亦有觀察胚胎心跳速率，觀測 時間為 48 跟 96 小時，計算心跳前需先將胚胎置於室溫條件 10 分鐘，待胚胎以 穩定的心跳速率跳動再進行計算，每次心跳次數計量採隨機取樣 10 隻斑馬魚胚 胎，並計算其 10 秒的心跳次數，量測結束再以 Excel 計算平均值。最後的暴露觀 測時間點為 96 小時，此時需觀察幼魚發育有無異常的型態，如脊椎彎曲、心包 膜腫大與卵黃囊腫大的現象，記錄其數量與類型並使用公式(3)計算其致畸率。最 後一項觀測項目為量測胚胎體長，此處同樣隨機取樣 10 隻幼魚量測其生長體長， 量測距離如圖 3-2 所示，從頭部頂端量至最後一節體節，量測完以 Excel 計算平 均值。 死亡率
% = 暴露胚胎總數 − 胚胎存活個數 暴露胚胎總數
1 累積孵化率
% = 胚胎累積孵化個數 暴露胚胎總數
2 畸形率
% = 已孵化胚胎之畸形個數 存活幼魚個數
3

23 圖 3-2 幼魚體長量測範圍 表 3-1 各項終點觀測時間點 觀測時間 觀測時間 觀測時間 觀測時間(小時小時小時小時) 觀測終點 觀測終點 觀測終點 觀測終點 24 48 60 72 96 胚胎死亡 胚胎死亡 胚胎死亡 胚胎死亡 ＋＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋ ＋＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋ ＋＋ 孵化 孵化孵化 孵化 ＋＋＋ ＋ ＋＋ ＋＋ ＋＋＋＋ ＋＋ ＋＋ 心跳 心跳心跳 心跳 ＋＋＋＋ ＋＋ ＋＋ 體長 體長體長 體長 ＋＋ ＋＋ 脊椎彎曲 脊椎彎曲 脊椎彎曲 脊椎彎曲 ＋＋＋＋ ＋＋ ＋＋ 心包膜腫大 心包膜腫大 心包膜腫大 心包膜腫大 ＋＋＋＋ ＋＋ ＋＋ 卵黃囊腫大 卵黃囊腫大 卵黃囊腫大 卵黃囊腫大 ＋＋＋＋ ＋＋ ＋＋

3.4 數據分析

數據分析

數據分析

數據分析

利用 SPSS 統計軟體的線性迴歸分析之 Probit model 進行斑馬魚胚胎半數致死 濃度(LC50)計算，由模式計算的結果取 50%斑馬魚死亡的濃度，此值即為半數致 死濃度。此外胚胎觀測實驗結果如累積孵化率、心跳、體長的部分，以獨立樣本 T 檢定比較各暴露組與控制組之統計是否有顯著差異(p < 0.05 為顯著，p < 0.01 為非常顯著)。

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第四章

第四章

第四章

第四章 結果與討論

結果與討論

結果與討論

結果與討論

4.1 斑馬魚胚胎

斑馬魚胚胎

斑馬魚胚胎

斑馬魚胚胎暴露於模擬

暴露於模擬

暴露於模擬含氮

暴露於模擬

含氮廢水

含氮

含氮

廢水

廢水

廢水之

之

之

之毒性

毒性

毒性

毒性

為瞭解單一含氮物質對於斑馬魚胚胎的生物毒性，本研究於實驗室自行配製 氨氮、硝酸鹽氮與有機氮的模擬含氮廢水，分別以氯化銨、硝酸鈉及氫氧化四甲 基銨三種化合物代表，藉由觀察不同的觀測終點瞭解含氮物質對斑馬魚胚胎的影 響。

4.1.1 斑馬魚胚胎之死亡率

斑馬魚胚胎之死亡率

斑馬魚胚胎之死亡率

斑馬魚胚胎之死亡率

為瞭解斑馬魚胚胎暴露於三種含氮物質，其暴露濃度與胚胎死亡的劑量效應 關係，本實驗配製不同濃度的模擬含氮廢水，於暴露時間 48 與 96 小時觀察斑馬 魚胚胎死亡的數量，以心跳有無停止活動作為判定的基準，且以下實驗皆有控制 組作為對照，控制組的斑馬魚胚胎死亡率需小於 10%實驗數據才可信，最後再藉 由 SPSS 線性迴歸分析之 Probit 模式計算出三種含氮化合物的半數致死濃度 (LC50)。 代表氨氮的化合物氯化銨在此所選擇的暴露濃度如圖 4-1(a)所示為 50~155 mg NH3-N/L，最低濃度 80 mg NH3-N/L 時死亡率為 28.47%，濃度 155 mg NH3-N/L 時死亡率為 65.28%，其 48 與 96 小時的 LC50分別為 146.5 與 111 mg NH3-N/L。 硝酸鈉為代表硝酸鹽氮的暴露化合物，此處所選擇暴露濃度範圍為 990~1650 mg NO3--N/L，如圖 4-1(b)所示，經濃度 990 mg NO3--N/L 的硝酸鈉暴露其死亡率為 29.17%，最高濃度 1650 mg NO3--N/L 的死亡率則為 70.83%，經計算可得 48 與 96 小時的 LC50值分別為 1446.5 mg NO3--N/L 與 1347.3 mg NO3--N/L。代表有機氮的 暴露化合物為氫氧化四甲基銨，暴露濃度與氯化銨同為 30~90 mg N/L，由圖 4-1(c) 可得知暴露濃度 30 mg N/L 時死亡率為 33.33%，最高濃度 90 mg N/L 則為 67.71%， Probit model 分析結果顯示其 48 與 96 小時半數致死濃度各別為 76.2 mg N/L 與

25 NH₄Cl concentration (mg NH₃-N/L) control 50 80 105 130 155 M o rt a li ty ra te ( % ) 0 20 40 60 80 100 48 h 96 h NaNO₃ concentration (mg NO₃--N/L) control 990 1155 1320 1490 1650 M o rt a li ty ra te ( % ) 0 20 40 60 80 100 48 h 96 h 圖 4-1 模擬含氮廢水對胚胎死亡率之影響 (a)氯化銨、(b)硝酸鈉 (a) (b)

26 TMAH concentration (mg N/L) control 30 45 60 75 90 M o rt a li ty ra te ( % ) 0 20 40 60 80 100 48 h 96 h 圖 4-1 模擬含氮廢水對胚胎死亡率之影響(續) (c)氫氧化四甲基銨 (c)

27 68.1 mg N/L。由以上三種含氮化合物毒性結果可得知，隨著暴露濃度與時間的增 加，斑馬魚的死亡率即會跟著上升，顯示濃度與死亡率有劑量效應關係，而從半 數致死濃度值(96 小時)可得知含氮物質對生物的毒性皆有所不同，其毒性由高至 低依序為氯化銨(氨氮) > 氫氧化四甲基銨(有機氮) > 硝酸鈉(硝酸鹽氮)。 許多文獻皆指出上述三種含氮物質具有毒性，如 Kallqvist (2003) 將微藻 (Nephroselmis)暴露於氨氮環境，在 pH 7.5 時 EC50為 0.013 mg NH3-N/L，而 Robert (1981)使用兩種魚類成魚進行暴露，鱒魚(Rainbow trout)於 pH 7.3 的 96 h-LC50為 72.7 mg NH3-N/L，而呆頭鰷魚(Fathead minnows) 於 pH 7.01 其 96 h-LC50則為 148 mg NH3-N/L，對於不同階層的物種氨氮亦同樣會對生物產生毒性。Scott and Crunkilton (2000)使用水蚤暴露於硝酸鹽氮，其 48 小時半數致死濃度為 462 NO3--N mg/L，亦有研究利用蝸牛(Potamopyrgus antipodarum)進行暴露，其 96

h-LC50則為 1042 NO3--N mg/L (Alonso and Camargo, 2003)。文獻上所使用的暴露生物雖不

同，但以半數致死濃度值相比，氨氮毒性遠大於硝酸鹽氮，與本實驗有相同的趨 勢。 氫氧化四甲基銨因曾發生過勞工安全意外，已證實對人體有危害，目前有研 究以大鼠進行注射暴露後，發現其 4 小時半數致死劑量(LD50)為 85.9 mg/L (2.38%)， 且大鼠暴露後會產生呼吸頻率增加及血壓升高等現象，隨著濃度提高與拉長暴露 時間會進而損害其他器官，在注射後 24 小時肝臟、腎臟與膀胱的生理機能亦會 受影響(Lee et al., 2011)_{。不過此生物毒性的暴露濃度較高，且是使用注射暴露的方式，} 對於流放至水體的影響尚無文獻指出。 與本毒性試驗結果相比，除了氫氧化四甲基銨則尚無水生生物暴露的研究之 外，氨氮與硝酸鹽氮的半數致死濃度皆比文獻的濃度高，但這有可能因為物種不 同而對毒物的耐受度有所差異。在此使用斑馬魚胚胎除了可觀察胚胎死亡的數量， 亦可觀察尚未死亡的胚胎生長有無異常，如有發育異常即可證明暴露毒物會對其 產生影響。為瞭解含氮物質對胚胎產生影響的最低濃度，降低三種含氮物質的暴 露濃度，當致畸率達 5%時即為此物質的最低效應濃度，最終獲得氯化銨、硝酸

28

鈉與氫氧化四甲基銨的 LOEC 分別為 0.41 mg NH3-N/L、0.51 mg NO3--N/L 及 0.1

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4.1.2 斑馬魚胚胎

斑馬魚胚胎

斑馬魚胚胎

斑馬魚胚胎之發育

之發育

之發育

之發育情形

情形

情形

情形

(1)累積孵化率

累積孵化率

累積孵化率

累積孵化率

本研究觀察胚胎生長的累積孵化率，欲瞭解含氮物質對斑馬魚早期生長發育 是否具有生物毒性，如圖 4-2 (a)所示，當斑馬魚胚胎暴露於氯化銨，濃度大於 80 mg NH3-N/L 即會顯著影響胚胎的累積孵化率(p < 0.05)，在 80~130 mg NH3-N/L 暴露濃度的累積孵化率介於 54~67%，與控制組 91%的累積孵化率相比較低，且 在 60 小時的觀察時間尚未死亡的胚胎皆已孵化。硝酸鈉暴露結果為圖 4-2(b)，自 暴露濃度 990 mg NO3--N/L 開始即會顯著影響胚胎累積孵化率，累積孵化率介於 62~69%間(p < 0.01)，相較於氯化銨，經硝酸鈉暴露的胚胎孵化時間集中在 72 小 時，在高濃度 1490~1650 mg NO3--N/L 的環境下，96 小時暴露結束後仍有未孵化 的胚胎，因此延長觀察時間至 120 小時，雖陸續有胚胎孵化，但依然有少許胚胎 未孵化抑或直接死亡。暴露於氫氧化四甲基銨時，於圖 4-2(c)顯示除了 90 mg N/L 的累積孵化率最低為 34%，其餘範圍皆落在 60~66% (p < 0.01)，孵化時間主要集 中在 65~72 小時間，但在 96 小時觀察時間結束後，未死亡的胚胎全部皆孵化。 Kimmel (1995)指出孵化時期是胚胎分化重要的時段之一，斑馬魚胚胎正常情況在 60~72 小時為胚胎孵化最為旺盛的時間，如胚胎受精後暴露在受污染的環境或者 存在外在壓力的環境下生長，即會延緩胚胎孵化的時間(Hallare et al., 2004; Miyachi et al., 2003)_，

結果顯示三種含氮物質的累積孵化率皆顯著低於控制組(91%)，代表斑馬魚卵暴 露於三種含氮物質皆會使胚胎的累積孵化率降低，而三者孵化的時間與控制組相 比較雖較為緩慢，但大部分皆在 72 小時已全數孵化，唯獨經硝酸鈉暴露的胚胎 有少數未孵化甚至直接死亡，從 4.1 節斑馬魚胚胎的死亡率結果來看，雖然硝酸 鈉的半數死亡濃度值較高(96h-LC50為 1347.3 mg NO3--N/L)，但 0.5 mg NO3--N/L 就會影響胚胎生長，此處累積孵化率的觀察亦顯示硝酸鹽氮對胚胎有可能從早期 發育即有顯著的影響，如 Fraysse (2006)指出胚胎外層的絨膜為保護胚胎的一層屏 障，如胚胎在發育時受到外在污染物的暴露，便以延緩孵化的方式來保護胚胎。

30 Exposure time (h) 0 24 48 60 72 96 C u m u la tiv e h a tc h in g r a te ( % ) 0 20 40 60 80 100 control 50 mg/L 80 mg/L 105 mg/L 130 mg/L 155 mg/L Exposure time (h) 0 24 48 60 72 96 C u m u la ti v e h a tc h in g r a te (% ) 0 20 40 60 80 100 control 990 mg/L 1155 mg/L 1320 mg/L 1490 mg/L 1650 mg/L 圖 4- 2 模擬含氮廢水對胚胎累積孵化率之影響 (a)氯化銨、(b)硝酸鈉 (a) (b)

31 Exposure time (h) 0 24 48 60 72 96 C u m u la ti v e h a tc h in g r a te ( % ) 0 20 40 60 80 100 control 30 mg/L 45 mg/L 60 mg/L 75 mg/L 90 mg/L 圖 4-2 模擬含氮廢水對胚胎累積孵化率之影響(續) (c)氫氧化四甲基銨

(c)