3-1 實驗流程
受體鍵結親合性 (receptor-binding affinity) 和人類卵巢癌細胞增生 (human ovarian cancer cell proliferation) 之測試
去醣基hFSH α 和 β次單元體之大量表現 (large-scale expression)
去醣基hFSH變異體 (NG-hFSH variant) 之再組成 (reconstitution) 以西方墨點法鑑定目標次單元體
去醣基hFSH α 和 β 次單元體 (subunits) 之小量表現 (small-scale expression)
決定目標次單元體之溶解性 pET30a
hFSHα cDNA (hFSHA) hFSHβ cDNA (hFSHB)
pACYCDuet-1
NovaBlue (DE3)
NovaBlue (DE3) BL21 (DE3) BL21 trxB (DE3) Origami (DE3) hFSHA/pET30a hFSHB/pACYCDuet-1
BamHⅠ HindⅢ
3-2 聚合酶連鎖反應 (polymerase chain reaction, PCR)
hFSH 由腦下腺前葉細胞表現並分泌到血液中，所以實驗設計上 以實驗室現有的commercial “human Pituitary Gland Marathon-Ready cDNA” 作為選殖 hFSH 基因的模版 (template) ，利用 PCR 方式分別 放大hFSHA 和 hFSHB，而 DNA polymerase 在 PCR 產物 3’端會多加 一個腺嘌呤 (Adenine) ，因此便可將此兩段 cDNA 分別構築到 yT&A 轉殖載體中 [在其間 3’端多一獨立胸腺嘧啶 (Thymidine) ，如此形成 A-T 配對] ，接著藉由轉形技術 (Transformation) 將 hFSHA 和 hFSHB 殖入E. coli DH5α，作為長期保存和往後實驗上之利用。
3-2-1 引子設計
名稱 寡核苷酸序列 鹼基數
hFSHA (F) 5’-GATATCCTCCATTCCGCTCCTGA-3’ 23 hFSHA (R) 5’-GGGATCCGCACTTGGTAAAACAT-3’ 23
hFSHB (F) 5’-AAGCTTTCTGGATCCCGCAATAG-3’ 23 hFSHB (R) 5’-AAGCTTAATGTCCACTGATCT-3’ 21
表4. 聚合酶連鎖反應之引子
y 如表 4 所述，hFSHA (F) 為放大 hFSHA 片段之前置引子 (forward primer) ，hFSHA (R) 則為反置引子 (reverse primer) ；hFSHB (F) 為放大 hFSHB 片段之前置引子，hFSHB (R) 同樣為反置引子。
【註：標線處為限制酶切位 (restriction cutting site) ，hFSHA (F) 為 EcoRⅤ、hFSHA (R) 為 BamHⅠ、hFSHB (F) 和 hFSHB (R) 皆
為HindⅢ 】
y 如同緒論所提，hFSH α 和 β 次單元體之結構皆由訊息胜肽 (signal peptide) 加上成熟胜肽 (mature peptide) 所組成。但在大腸桿菌表 現 系 統 中 ， 並 無 藉 由 訊 息 胜 肽 將 成 熟 胜 肽 帶 至 內 質 網 (endoplasmic reticulum) 之過程，所以在設計引子上去除訊息胜肽 之核苷酸部分，直接從成熟胜肽之N’端進行放大。
y hFSHA (F)、hFSHA (R) 之限制酶切位分別為 EcoRⅤ和BamHⅠ， 接上此切位可利於往後藉由此兩限制酶將hFSHA 構築於表現載體 pET30a；hFSHB (F)、hFSHB (R) 之限制酶切位皆為 HindⅢ，亦 設計於往後利於hFSHB 構築於表現載體 pACYCDuet-1。
y 引子儲存濃度配製為 50 µM，而作用濃度 (working concentration) 則為5 µM，平時儲存於-20 ℃。
3-2-2 PCR 材料與程式
表5 之藥品混合均勻之後總體積為 50 µl，置於 0.2 ml “thin walled tube” (ABgene Ltd.) ，放入 PCR machine 進行聚合反應，圖 10 為本 實驗採用之反應程式。
材料 體積 (µl)
Human Pituitary Gland cDNA library 1 5 µM Forward primer 3.5 5 µM Forward primer 3.5
10x PCR buffer 5
1 mM dNTPs 4
ddH2O 32
Taq DNA polymerase 1
Total volume 50
表5. 聚合酶連鎖反應之材料
圖 10. 聚合酶連鎖反應之反應程式
3-3 yT&A 載體構築
3-3-1 PCR 產物之瓊脂洋菜膠體電泳 (Agarose gel electrophoresis) y 配製 0.8 %瓊脂洋菜膠 (agarose gel)：
將gel-casting tray 置放於 tape 上，插入 well-forming comb。取 0.8 g agarose 溶於 100 ml 0.5×TBE buffer，搖晃均勻後微波 1 分鐘，拿出 搖晃均勻再微波至完全溶解。之後將稍微冷卻的洋菜膠溶液小心倒入 casting trap，避免產生氣泡，靜置 30 分鐘待其凝固。當電泳膠完全凝 固後，小心移開comb 並去除電泳膠下方之 casting tray，電泳膠保存 於0.5× TBE buffer 中。
y 電泳：
將電泳膠放置於 trap 上，再置於電泳槽之平台，此時膠體孔洞 (agarose well) 的一端須在負極的位置。電泳槽注滿 0.5× TBE buffer，
將PCR 產物與 6× gel-loading buffer 混合均勻 (體積比 5:1) ，然後立
y 電泳膠染色：
將跑完電泳後之洋菜膠放入染色用之盒子中。倒入 ethidium bromide solution (1 µg/ml) 覆蓋膠體，盒子置於水平迴轉式震盪器 (orbital shaker) 上染色 15 分鐘，之後將 ethidium bromide solution 倒 回儲存容器中。接著膠體以二次水搖晃退染，約置於震盪器 30 分鐘 以上。便可將膠體置於紫外光光照裝置 (ultraviolet transilluminator) 上觀看。另注意Ehidium bromide 為有毒污染物質，需全程避免碰觸 身體及沾染其它乾淨區域。
3-3-2 PCR 產物之純化
經電泳後染完色的 PCR 產物接著利用 “GFXTM PCR DNA and Gel Band purification kit” 進行純化。首先從洋菜膠上切下所需之 DNA 片段大小 ( hFSHA 為 316 base pairs；hFSHB 為 375 base pairs) 置 入微量離心管。之後秤量切下洋菜膠之重量並加入與重量等體積之 capture buffer (1 mg gel slice =1 µl capture buffer) 。置放微量離心管於 60 ℃乾浴加熱器中 10~15 分鐘，每隔 3 分鐘翻轉數次，直到洋菜膠 完全溶解。然後將GFX column 置放於 collection tube 上，並將溶解 後之樣品轉注入GFX column 中，放置室溫 1 分鐘。以 13,000 rpm 離 心 30 秒，之後倒掉過濾液，並以 0.5 ml 的 wash buffer 清洗 GFX column，再以 13,000 rpm 離心 30 秒。倒掉過濾液，再重複離心一次，
確保殘留的乙醇完全去除。取出GFX column 並置放於乾淨的 1.5 ml 微量離心管。加入15~50 µl 二次水復溶 DNA，靜置 1 分鐘後，再以 13,000 rpm 離心 1 分鐘，最後將沖提 (elute) 下來的 DNA 水溶液儲存 於-20 ℃。
3-3-3 與 yT&A 載體進行接合反應 (Ligation)
取6.5 µl 純化後的 PCR 產物與 1.5 µl 的 yT&A 載體混合，接著 加入1 µl ligation buffer A、1 µl ligation buffer B 以及 1 µl 的 T4 DNA ligase，混合均勻後放置於室溫 1 小時或 4 ℃隔夜反應。
3-3-4 大腸桿菌 DH5α 之轉形 (Transformation) y 勝任細胞 (competent E.coli DH5α) 之製備：
以接菌環在 DH5α 培養皿中挑一單一菌落，養於 5 ml 的 LB 培 養基中，隔夜培養於37 ℃、200 rpm 之迴轉式振盪培養箱。取 500 µl 的隔夜菌液接種至 50 ml 的 LB 培養基中繼續培養，直到菌液濃度 OD550達到0.6 ~ 0.8。將錐形瓶置於冰上 5 分鐘，然後將菌液轉移至 50 ml 的無菌離心管中，以 2800 rpm、4 ℃離心 5 分鐘。小心去除上 清液，再將菌塊復溶於20 ml 的 TfbⅠ，置於冰上 5 分鐘 (TfbⅠ須先 置放於4℃冰箱中) ，再以 2800 rpm、4 ℃離心 5 分鐘。小心去除上 清液，再將菌塊復溶於 3 ml 的 TfbⅡ，置於冰上 5 分鐘 (TfbⅡ亦須 先置放於4 ℃冰箱中) 。稍微混合均勻後，接著每 100 µl 分裝於 1.5 ml 微量離心管，置入液態氮中快速冷卻，之後長期儲存於-80 ℃。
y 大腸桿菌 DH5α 之轉形：
將10 µl 的接合反應產物和 50 µl 的勝任細胞 (DH5α) 混合於 1.5 ml 的無菌微量離心管，置於冰上 30 分鐘。將離心管由冰上移出並迅 速置放於42 ℃的水浴槽中 90 秒，接著快速將離心管移回冰上靜置 5 分鐘。然後將離心管中的菌液培養於 240 µl 的 LB 培養基中，以 37
℃、200 rpm 震盪培養 1 小時。分成 20 µl 和 280 µl 的菌液分別塗佈 於LB/Ampicillin 培養皿。之後將培養皿反置於 37 ℃的迴轉式振盪培
養箱中12~16 個小時，待菌落生成之後便可用石臘封膜 (parafilm) 密 封培養皿並保存於4 ℃冰箱。
3-3-5 質體 DNA 之微量製備 (miniprep)
本實驗利用波士特公司 “Gene-SpinTM -V2 ” miniprep kit 製備質 體DNA。首先從轉形後之 DH5α 培養皿上挑一株單一菌落養於 3 ml 的LB 培養基中，並加入適量的抗生素 (Ampicillin 50µg/ml) ，隔夜 培養於轉速200 rpm、37 ℃的迴轉式振盪培養箱。將 1.5 ml 的菌液 加到1.5 ml 微量離心管中，13,000 rpm 離心 1 分鐘，小心移除上清 液之後再加入 1.5 ml 的菌液重複離心一次。之後加入冷藏之 200 µl
“SolutionⅠ” 反覆震盪復溶菌塊。接著加入 200 µl 的 “Solution
Ⅱ” ，輕微翻轉離心管 5 次，靜置 1 分鐘。再加入 200 µl 的 “Solution
Ⅲ” ，同樣輕微翻轉 5 次混合均勻，以 13,000 rpm 離心 5 分鐘，之後 將澄清的lysate 轉移到置於 collection tube 上的 spin column 中，13,000 rpm 離心 30 秒，倒去 collection tube 中的濾液。加入 700 µl 的 washing solution 並以 13,000 rpm 離心 1 分鐘，同樣倒去 collection tube 中的濾 液後再次13,000 rpm 離心 3 分鐘，用以去除多餘乙醇。將 spin column 轉移到另一新的微量離心管上，加入50 µl 二次水置於室溫 1 分鐘復 溶DNA，最後以 13,000 rpm 離心 1 分鐘沖提出質體 DNA，並儲存於 -20 ℃。
3-4 pET30a 和 pACYCDuet-1 載體構築
3-4-1 質體 hFSHA-yT&A、hFSHB-yT&A 之限制酶切割 (Digestion) 構築好之質體hFSHA-yT&A 和 hFSHB-yT&A 先經由洋菜膠電泳 觀察片段大小是否正確，之後 hFSHA-yT&A 利用 BamHⅠ限制酶進
行截切，使其成為 hFSHA 和 yT&A 兩段 DNA；hFSHB-yT&A 則利用 HindⅢ限制酶進行截切，使其成為hFSHB 和 yT&A 兩段 DNA，反應 藥品如表6 所述，以 37 ℃水浴反應 3 小時。
hFSHA-yT&A
材料 體積 (µl)
hFSHA-yT&A 15
10× Buffer E 10
Restriction enzyme BamHⅠ 2
ddH2O 73
Total volume 100
hFSHB-yT&A
材料 體積 (µl)
hFSHB-yT&A 15
10× Buffer E 10
Restriction enzyme HindⅢ 2
ddH2O 73
Total volume 100
表 6. hFSHA-yT&A 和 hFSHB-yT&A 之切割反應材料
3-4-2 表現載體 pET30a 和 pACYCDuet-1 之限制酶切割
如同質體hFSHA-yT&A、hFSHB-yT&A 之切割反應，pET30a 利 用 BamHⅠ限制酶進行截切；pACYCDuet-1 則利用 HindⅢ限制酶進 行截切，而反應藥品如表7 所述，以 37 ℃水浴反應 3 小時。
pET30a
材料 體積 (µl)
pET30a 5
10× Buffer E 1
Restriction enzyme HindⅢ 1
ddH2O 3
Total volume 10
pACYCDuet-1
材料 體積 (µl)
pACYCDuet-1 5
10× Buffer E 1
Restriction enzyme HindⅢ 1
ddH2O 3
Total volume 100
表7. pET30a 和 pACYCDuet-1 之切割反應材料
3-4-3 與表現載體 pET30a 和 pACYCDuet-1 進行接合反應 (Ligation)
切割完之hFSHA、hFSHB、pET30a 和 pACYCDuet-1 經由洋菜膠 體電泳分離和純化之後，即可進行接合反應。類似前面所提 yT&A 之 接合，取7 µl 純化後的 hFSHA-BamHⅠ (經 BamHⅠ切割後之hFSHA) 與1 µl 的 pET30a-BamHⅠ混合 (insert DNA 與 expression vector 濃度 比 為 3:1) ； 同 樣 取 7 µl 純 化 後 的 hFSHB-HindⅢ 與 1 µl 的 pACYCDuet-1-HindⅢ混合，接著兩者分別加入1 µl ligase 10× buffer 以及1 µl 的 T4 DNA ligase，混合均勻後放置於 4 ℃隔夜反應。
3-4-4 大腸桿菌 NovaBlue (DE3) 、BL21 (DE3) 、BL21 trxB (DE3) 和 OrigamiTM (DE3) 之轉形 (Transformation)
與前述DH5α 之轉形相同，但此時需注意的是 hFSHA-pET30a 只 轉 形 至 NovaBlue (DE3) ， 培 養 於 LB/Kanamycin 培 養 基 ； 而 hFSHB-pACYCDuet-1 則轉形至四株 E. coli 菌株，分別為 NovaBlue (DE3) 、BL21 (DE3) 、BL21 trxB (DE3) 和 OrigamiTM (DE3) ，培養 於LB/Chloramphenicol 培養基，保存於 4 ℃冰箱。
3-4-5 選殖鑑定及 DNA 定序 (DNA sequencing)
上述轉形完帶有表現載體的菌株抽取其微量質體 DNA，利用限 制酶 EcoRⅤ、BamHⅠ和 HindⅢ切割，之後經由洋菜膠體電泳觀察 正反接合情形，選取片段大小正確無誤之單一菌落分別送至生工有限 公司和源資國際生物科技股份有限公司進行 DNA 定序進一步確定 insert DNA 序列。
3-5 去醣基 hFSH α- 和 β-次單元體之表現及純化
此時轉殖菌株共可分為五種類型，如下表8 所示。
菌株類型 抗藥性
(antibiotic resistance) 1.hFSHA-pET30a [NovaBlue (DE3)] Kanamycin
2.hFSHB-pACYCDuet-1 [NovaBlue (DE3)] Chloramphenicol 3.hFSHB-pACYCDuet-1 [BL21 (DE3)] Chloramphenicol 4.hFSHB-pACYCDuet-1 [BL21 trxB (DE3)] Chloramphenicol 5.hFSHB-pACYCDuet-1 [OrigamiTM (DE3)] Chloramphenicol
表8. 轉形後之五種菌株類型
3-5-1 去醣基 hFSH α-和 β-次單元體之小量表現 (small-scale expression)
從上述菌株培養皿中挑單一菌落培養於 3 ml 含有適當抗生素的 LB 培養基中 (LB/Kanamycin 濃度：25 µg/ml、LB/Chloramphenicol 濃度：34 µg/ml) ，隔夜培養於 37 ℃、200 rpm。取 30 µl 的隔夜菌 液接種至3 ml 含有適當抗生素的 LB 培養基中，在 37 ℃、200 rpm 下培養至OD600 達 0.6。分別加入 0.5 mM 和 1 mM 的 IPTG，另外取 一管LB 菌液不加 IPTG 作為正對照組 (positive control) ，而此時亦 需 培 養 一 管 無 “insert DNA” 只 包 含 表 現 載 體 (pET30a 和 pACYCDuet-1) 轉形進 E. coli 的菌液，此菌液同樣加入 0.5 mM 的 IPTG。同時另外培養無轉殖載體的野生型 (wild type) E. coli 於 LB 培養基，以上兩者作為負對照組 (negative control) 之用。上述 OD600 皆達0.6 之菌液繼續培養 4 小時。在 4 ℃下，以 13,000 rpm 離心 5 分 鐘，使菌體沈澱下來，移除上清液。菌塊加入 200~500 µl 的 bacterial lysis buffer (視菌塊大小決定適量 buffer) ，快速震盪再懸浮菌塊。待 溶液澄清後，取15 µl bacterial lysate 加入 5 µl 4× SDS gel-loading buffer，之後以 15 % SDS-PAGE 分析蛋白質表現並以西方墨點法進一 步確認。
3-5-2 SDS-PAGE
y SDS-polyacrylamide gel 之製備：
a. 4 ml 15 % Resolving-gel solution
b. 3 ml 5 % Stacking-gel solution
表9. SDS-polyacrylamide gel 之藥品配方：a. 15 % resolving-gel solution；b. 5 % stacking-gel solution
材料 體積 (ml)
ddH2O 0.88
30 % Acrylamide mixture 2 1.5 M Tris (pH 8.8) 1.04
10 % SDS 0.04
TEMED 0.0016
10 % APS 0.04
材料 體積 (ml)
ddH2O 2.1
30 % Acrylamide mix 0.5 1 M Tris (pH 6.8) 0.38
10 % SDS 0.03
TEMED 0.003
10 % APS 0.03
此SDS-PAGE 實驗使用 BIO-RAD 迷你垂直電泳槽系統。首先將 兩玻璃片依造操作手冊組裝起來，注入3.5 ml 的 resolving-gel solution 於玻璃間的溝槽，再以 300 µl 的異丙醇覆蓋其上使之水平凝固，靜置 30 分鐘待其凝結完全。倒去覆蓋的異丙醇並側立等待其完全蒸發。
注入適當體積的stacking-gel solution 於凝結完全的 resolving gel 上，
立即將Teflon comb 斜插入 stacking-gel solution，小心避免產生氣泡。
立即將Teflon comb 斜插入 stacking-gel solution，小心避免產生氣泡。